2. Outline
• Prinsip Umum
• Teknik Pengawetan (Preservation)
• Keuntungan dan Kerugian
• Pemilihan Metode
3. Prinsip Umum
Tujuan utama
memelihara biakan
suatu fungus adalah
untuk menjaga galur
fungus tersebut di
dalam suatu media
tanpa terjadi nya
perubahan morfologi,
fisiologi, atau genetik
4. Prinsip Umum
• Organisme dapat
berasal dari
berbagai sumber
• Contoh :
Penicillium
digitatum
5. Prinsip Umum
• Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat
dengan mengurangi kecepatan metabolisme
atau bahkan dapat menunda metabolisme
mikroorganisme
• Pengawetan yang baik bila digunakan biakan
yang sehat dan kondisi pertumbuhan yang
optimum
• Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dan
kondisi yang berbeda-beda
• Beberapa diantaranya memiliki spesifisitas
tertentu sebagai syarat pertumbuhannya
6. Prinsip Umum
• Umumnya
Mikroorganisme
tumbuh baik dalam
media yang dibuat
mendekati kondisi
lingkungan tempat
asalnya
• Contoh : tanah,
bagian tanaman atau
komponen air, dll.
7. Pertumbuhan Mikroorganisme
• Media pertumbuhan dapat bervariasi.
Misalnya Raper & Thom (1949)
menggunakan Czapek's Agar, Steep Agar
and Malt Extract Agar untuk pertumbuhan
Penicillia dan Aspergilli
• Pitt (1980) menganjurkan penggunaan
recommends Czapek Yeast Autolysate (CYA)
dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia
• Standarisasi of formula media penting
dilakukan
• Media akan mempengaruhi morfologi dan
warna koloni, karena kandungan media akan
mempengaruhi pembentukan senyawa
tertentu atau menginduksi sifat tertentu dari
mikroorganisme
9. Kontaminasi pada kultur fungi
• Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh
Tyroglyphus or Tarsonemus
• Di alam banyak terdapat pada tanah, dan
hampir semua bahan organik
• Terbawa ke laboratorium dari bahan
tanaman, produk yang sudah kadaluarsa,
pada sepatu, serangga atau biakan
mikroorganisme lain.
• Cepat berkembang biak dalam keadaan
lembab dan suhu ruang
• Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat di
simpan
10. Pencegahan Kontaminasi
• Melakukan pekerjaan sesuai prosedur
• Menjaga kebersihan dan kesehatan diri
• Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium
• Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur
11. Metode pencegahan kontaminasi
Hygiene
• Bersihkan seluruh permukaan dan hindari
biakan dari udara luar dan debu
• Cuci peralatan dengan desinfektan yang
sesuai.
Fumigation
• Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang
laboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harus
dilakukan oleh yang berwenang
Mechanical and chemical barriers
• Universal bottles, kapas lemak, tube
bersumbat
12. Metode pencegahan kontaminasi
• Tempat penyimpanan yang aman
• Lemari pendingin 4-8°C
• Lemari penyimpanan “deep freeze” (< -
20°C)
• Menutup kultur dengan minyak mineral
• Simpan dengan silica gel
• Freeze-dry
• Simpan di ultra-low temperatures case
14. Pengawetan dan Penyimpanan
• Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan
sebagai seed stock
• Simpan satu biakan sebagai cadangan
• Setelah pengawetan, viability, purity, dan
identitas harus di cek ulang dan dibandingkan
dengan data aslinya atau referensi
• Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan
biokimia harus diuji
• Semua pengamatan harus dicatat dan
disimpan untuk referensi di masa yad.
16. Metode pengawetan mikroorganisme
Kerugian metode sub-kultur pd agar
• Kemungkinan terjadi variasi genetik
akibat pemindahan berulang, hilangnya
sifat patogenitas atau karakteristik
fisiologi dan morfologi lainnya
• Kemungkinan kontaminasi besar
• Memerlukan pengawasan yang ketat
supaya biakan tidak tertukar atau
terkontaminasi
17. Pengawetan dan Penyimpanan
Keuntungan metode sub-kultur pada agar :
• Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu
cukup lama dibawah pengawasan ahlinya.
• Metodenya cukup murah dan tidak
memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah
koleksi yang sedikit, metode ini cukup
menguntungkan
• Penumbuhan mudah karena tidak perlu
waktu adaptasi yang lama.
• Periode pemindahan : 2 – 4 minggu atau
2 – 4 bulan
18. Di bawah minyak mineral
Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu
dituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegah
dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan
pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen
19. Pengawetan dengan
Minyak mineral
• Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell &
Weston (1947)
• Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10
mm minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinal
paraffin dengan specific gravity 0.830-0.890).
• Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada
121°C selama 15 menit
• Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengan
cara mengambil sejumlah koloni dengan jarum
biakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin.
• Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengah
kadangkala memberikan hasil yang lebih baik
sehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudah
melalui slope
20. Pengawetan dalam
Minyak mineral
Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral :
• Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara
• Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval
• Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi
yang tidak nyaman dapat mengarah pada
mutasi
21. Pengawetan dalam
Minyak mineral
Keuntungan :
• Peralatan murah dan pengerjaan mudah
• Beberapa mikroorganisme hanya dapat
disimpan di dalam minyak mineral
• Namun penyimpanan di bawah minyak mineral
disarankan untuk laboratorium yang memiliki
keterbatasan sumbar daya dan fasilitas
23. Penyimpanan dalam air
Cara :
1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari
ujung pertumbuhan koloni jamur
2. Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril
di dalam botol McCartney dan tutup erat , lalu
disimpan pada suhu 20-25°C.
3. Peremajaan dilakukan dengan mengambil
potongan agar tsb, tempatkan terbalik pada
medium pertumbuhan yang sesuai
24. Penyimpanan dalam air
• Jangka waktu penyimpanan dapat
mencapai 2-3 tahun , misalnya untuk
spesies of Phytophthora dan Pythium
tanpa adanya perubahan fisik
(Onions & Smith, 1984).
25. Penyimpanan dalam air
• Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939,
1967) yang menyimpan fungi yang patogen
thp manusia
• Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogen
tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya.
• Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan
penyimpanan dalam air bisa mencapai 10
years
• Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogen
a.l. Oomycota, Ascomycota, Basidiomycota
dan mitotic fungi selama 7 tahun.
• Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales,
Pyrenomycetes, Hymenomycetes,
Gasteromycetes dan Hyphomycetes
26. Teknik pengeringan and freeze‐drying
• Penghilangan air akan mengurangi laju
metabolisme sel
• Dapat dilakukan dengan pengeringan udara
• Dapat pula dengan penambahan absorbant spt
tanah, silica gel, atau desiccant lain.
• Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan
beku dengan cara sublimasi es
27. What happens to a cell <-
when it freezes? 10OC
-5OC
-2OC SLOW
COOL
RAPID
COOL
VERY
RAPID
COOL
Response of cells to freezing. Slow cool: cells can maintaing osmostic
equilibrium by water efflux; thus cells shrink and only extracellular ice
forms. Rapid cool: cells cannot lose water rapidly enough to maintain
osmotic equilibrium; thus cells shrink slightly and contain a few large
ice crystals. Very rapid cool: cells contain a large number of small ice
crystals.
28. Penyimpanan dalam Silica Gel
• Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun
• C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungi
lebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins
(1962), semua galur terbukti stabil.
29. Penyimpanan dalam Silica Gel
Cara :
1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dan
sterilkan dengan dry heat (180°C selama 3 jam).
2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal
- 20°C).
3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yang
telah didinginkan.
4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica gel
dan goyangkan agar tercampur homogen.
5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada
25°C sampai silica gel crystals mengering dan siap untuk
dipisahkan.
6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4°C dalam wadah
kedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsi
lembab.
30. Penyimpanan dalam Silica gel
• Banyak fungi yang tahan lama dengan
metode ini (Perkins, 1962; Ogata, 1962;
Onions, 1977; Smith & Onions, 1983).
• Spora yang berdinding tipis cenderung tidak
dapat bertahan.
• Keberhasilannya tergantung biakan yang
sehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dari
perbedaan biakan dari setiap isolat.
• Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freeze-
drying tidak tersedia, walaupun ada bbrp
fungi yang tidak dapat bertahan lama dgn
cara ini.
32. Penyimpanan dalam Silica Gel
Kekurangan cara silica gel :
• Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak
sesuai untuk Pythium, Phytophthora dan
beberapa Oomycota, juga beberapa fungi
bermiselium yang memiliki spora yang
kompleks.
• Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukup
besar setelah beberapa kali peremajaan.
33. Penyimpanan dalam Silica Gel
Keuntungan cara silica gel :
• Murah dan sederhana
• Menghasilkan biakan yang stabil untuk
banyak sporulating fungi termasuk
Basidiomycota.
• Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari
karena kondisi yang kering
• Peremajaan inokulum dapat dilakukan
dengan mengmbil beberapa butir dari satu
botol, walaupun disarankan tetap
memisahkan biakan stock dari biakan kerja.
34. Penyimpanan dalam tanah
• Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15 min)
sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi spora
dalam air steril
• Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantung
pada laju pertumbuhan fungi
35. Penyimpanan dalam tanah
• Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971)
• Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria,
Aspergillus, Circinella dan Penicillium.
• Patogenitas Septoria dari sereal setelah 20 bulan
tetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan juga
Pseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke &
Fokkema, 1979).
• Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolat
Fusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F.
acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971).
• Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakan
untuk Fusarium dibandingkan di dalam minyak
karena adanya perubahan (variasi) terjadi dalam
minyak.
36. Penyimpanan dalam tanah
Keuntungan :
• Biakan dapat bertahan sampai 10
tahun.
• Peremajaan berulang dapat dilakukan
dari sampel yang sama, walaupun
sebaiknya stok harus ditempatkan
terpisah.
• Biaya murah dan alat sederhana
37. Penyimpanan dalam tanah
Kerugian :
• Kemungkinan terjadi variasi genetik
• Beberapa fungi tidak dapat tahan di
desikasi
• Kemungkinan kontaminasi lebih besar
38. Oomycota
• Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair
dengan kecepatan pendinginan 10°C min-1,
walaupun beberapa galur tidak dapat disimpan
dengan cara ini.
• Di bawah minyak mineral dapat disimpan
sampai 6 bulan
• Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40
tahun (laporan dari CABI-UK)
• Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu di
transfer setiap 2 tahun
39. Zygomycota
• Nitrogen cair sangat disarankan untuk
penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus
lainnya
• Dapat pula dengan cara freeze-dried
• Tidak semua genus tahan proses dehidrasi,
terutama dengan silica gel, misalnya
Coemansia, Martensiomyces, Condiobolus,
Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites.
Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis dan
Coemansia yang dapat di freeze dried.
40. Basidiomycota
• Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi
demikian hanya dapat disimpan dengan cara
transfer regular pada agar dengan atau tanpa
minyak, atau disimpan di nitrogen cair.
• Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang
tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukar
ditumbuhkan kembali
• Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang
tumbuh di alam, dapat di freeze-dried
41. Fungi Deuteromycota
• Fungi yang ber konidia reltif mudah di
simpan
• Freeze-drying adalah teknik yang paling
tepat.
• Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces
dapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai
2 tahun pada agar miring pada -18°C.
42. Ragi
• Ragi (single celled vegetative yeasts)
dapat disimpan dengan cara freeze-
drying.
• Kebanyakan spesies dapat tahan
disimpan dalam silica gel namun sukar
ditumbuhkan kembali
• Liquid nitrogen adalah cara yang paling
baik.
43. Rangkuman
Method Cost Stability Longevity
Cryopreservation High Excellent >10 000
below –130oC years
Freeze-drying High Little change 4-40 years
reported
Silica gel Low Little change 5-20 years
reported
Water Low Variation linked 2-7 years
to storage time
Soil Low Variation 5-20 years
common
Oil Low Change 1-50 years
expected with
time
Growth 18-22 oC Low-Medium Change 2 weeks to
expected with 6 months
time
Growth 4-7 oC Medium Change 6-12
expected with months
time
