Mikhail Eidelstein: Additional phenotypical methods used to identify the most crucial antibiotic resistance mechanisms

1. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НАИБОЛЕЕ ВАЖНЫХ
МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
М.В. Эйдельштейн
НИИ антимикробной химиотерапии
ФГБОУ ВО СГМУ Минздрава России

2. Нужно ли определять механизмы
антибиотикорезистентности для проведения
(адекватной) антибактериальной терапии?
…или достаточно (правильно) определять
чувствительность стандартными методами?

3. Определение механизмов
антибиотикорезистентности (АБР)
 Зачем? (С какой целью?)
 Когда? (В каких случаях?)
 Как? Это сложно?

4. Зачем определять механизмы резистентности?
 Проведение адекватной АБ-терапии у
конкретного пациента
 Получение эпидемиологических данных
 Инфекционный контроль
Отсроченное получение
данных о механизмах
АБ-резистентности
НЕ помогает в лечении
конкретного пациента
Накопление локальных
эпидемиологических данных
позволяет выбирать наиболее
эффективную стартовую терапию,
которая всегда является
эмпирической,
даже если в Вашем распоряжении
есть сверхбыстрые методы
выявления механизмов АБР

5. Когда нужно определять механизмы АБР?
 Если стандартные методы оценки чувствительности
недостаточно эффективны или оперативны
 Если обнаружение механизма или генетических
маркеров может улучшить оценку риска
неэффективности терапии определенными АБ

6.  Резистентность ко многим антибиотикам может быть
вызвана различными молекулярно-генетическими
механизмами
 Ингибиторозащищенные пеницилины vs. Грам(-)
 Карбапенемы vs. P. aeruginosa, A. baumannii
 … (множество примеров)
 В этом случае выявление отдельных (важных)
механизмов имеет в основном эпидемиологическое
значение
Нужно учитывать…

7. Рекомендации EUCAST по выявлению специфических
механизмов резистентности, имеющих особое
клиническое и эпидемиологическое значение
http://www.eucast.org/resistance_mechanisms/
Ver. 2.0, July 2017
1.Энтеробактерии, продуцирующие карбапенемазы
2.Энтеробактерии, продуцирующие -лактамазы расширенного спектра
3.Энтеробактерии, продуцирующие приобретенные AmpC
4.Резистетные к полимиксинам Грам(-) бактерии
5.Резистентные к карбапенемам P. aeruginosa и Acinetobacter
6.Резистентные к метициллину Staphylococcus aureus
7.Нечувствительные к гликопептидам Staphylococcus aureus
8.Резистентные к ванкомицину Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis
9.Streptococcus pneumoniae c пониженной чувствительностью к пенициллину

8.  EUCAST Clinical Breakpoints v. 7.1-9.0
«The presence or absence of a carbapenemase does not in itself influence the
categorisation of susceptibility. Carbapenemase detection and characterisation
are recommended for public health and infection control purposes»
 Клинические рекомендации «Определение чувствительности
микроорганизмов к антимикробным препаратам» вер. 2018-03
«В случае выявления продукции карбапенемаз отчет о результате
определения чувствительности должен включать комментарий о возможной
нечувствительности изолята к карбапенемам»
 КР вер. 2019 (проект)
«В случае выявления продукции карбапенемаз отчет о результате
определения чувствительности должен включать комментарий о возможной
неэффективности карбапенемов, по крайней мере при их использовании в
стандартных дозах в виде монотерапии»
Рекомендации по выявлению карбапенемаз* и
сообщению результатов тестирования
* Аналогичные комментарии для ESBL и цефалоспоринов и азтреонама

9. Является ли простое определение чувствительности
достаточным, или лаборатории должны по-прежнему
выявлять ESBL и карбапенемазы?
...при использовании современных критериев EUCAST / CLSI

10. Проблема 1:
Точность определения чувствительности
-лактамазо-продуцирующих штаммов к -лактамам

11. Мы верим в точность результата
МПК из лаборатории!

12. О точности определения МПК и возможности
использования индивидуальных результатов для
оптимизации дозирования антибиотиков…
Авторы являются
членами
руководящего
комитета EUCAST
2018 73(3):564-568

13.  Точность определения МПК для большинства комбинаций МО-АБ
невысока (обычно ~2 двукратных разведения)
 В рутинной практике (с помощью автоматизированных систем или
градиентных методов (E-тестов, MTS, MICE)) – еще ниже
 Результаты однократного определения МПК не могут быть
использованы для оптимизации режима дозирования АМП на
основании PK/PD расчетов
 Практические рекомендации по использованию МПК для ФК/ФД
интерпретации:
Основные положения и выводы

14. Противоречия?
 Новое определение EUCAST для
категории I (У) предполагает
чувствительность МО при
увеличенной экспозиции АБ
 Для большинства комбинаций МО-
АБ категория «У» включает
значения МПК, превышающие
уровень ECOFF.
 В рутинной практике МПК
практически всегда определяется
однократно «нереферетными»
методами
 Если в PK/PD расчетах
использовать значения 4 x МПК, то
могут ли значения МПК,
попадающие в диапазон У, служить
обоснованием «чувствительности
при повышенной экспозиции»?
Пример: меропенем vs. K. pneumoniae
https://mic.eucast.org/Eucast2/regShow.jsp?Id=4073
S
(Ч)
I
(У)
R
(Р)

15. Определение МПК контрольного штамма
ESBL+ K. pneumoniae ATCC 700603
S или R?
Rasheed et al. AAC 2000 44(9): 2382–8
AB BIODISK Etest ESBL QC 2007
Микроразведения в бульоне E-тесты

16. Программа внешней оценки качества определения
чувствительности (NEQAS 2011) K. pneumoniae ST258 KPC
Референтная оценка: имипенем 0,5-1 мг/л (S),
меропенем 4 мг/л (I – EUCAST, R - CLSI)
Результаты лабораторий:
Livermore et al, J Antimicrob Chemother. 2012 67(7):1569-77
% Лабораторий,
Антибиотик выдавших результат МПК, мг/л
S (Ч) I (У) R (Р) Диапазон Мода
Имипенем 12,8% 17,9% 69,3% 0,5 – ≥32 8
Меропенем 7,6% 9,3% 83,1% 0,25 – ≥64 ≥16

17. NEQAS 2015: K. pneumonia OXA-48
Референтная оценка: цефтазидим (S)
эртапенем МПК 8 мг/л (R)
меропенем МПК 2-4 мг/л (EUCAST – S/I, CLSI – I/R)
имипенем МПК 4-8 мг/л – (EUCAST – I/R, CLSI – R)
Результаты лабораторий:
Меропенем Все лаборатории, %
(n=207)
Россия, %
(n=27)
S (Ч) 30,0 37,0
I (У) 33,8 29,6
R (Р) 36,2 33,3

18. Первый случай выделения E. coli, ко-продуцирующей
ESBL и MBL, в России
Штамм E. coli (55/1389) выделен из мочи у пациентки с госпитальной ИМП,
несмотря на терапию меропенемом
Сниженная чувствительностью к имипенему, резистентность ко всем
прочим -лактамам, ФХ, АГ и ко-тримоксазолу.
FEP
CAZCTX
AMC
ESBL+
(CTX-M-15)
CAZ
IPMMEM
MBL+
(VIM-4)
Инокулюм,КОЕ/мл
EPM
IPM
MEM
DPM
5x105
5x105
5x105
5x105
5x107
5x107
5x107
5x107
Сильный инокулюм-эффект !
мг/л
МПК карбапенемов:
Shevchenko, et al., Clin Microbiol Infect. 2012 18(7):E214-7

19. ВЫЯВЛЕНИЕ ESBL АВТОМАТИЗИРОВАННЫМИ СИСТЕМАМИ
 Возможны проблемы с
чувствительностью (или
специфичностью) из-за
ограниченного диапазона
тестируемых разведений ЦС и
ЦС+Клав.
 …особенно для видов с
природными AmpC

20. ВЫЯВЛЕНИЕ КАРБАПЕНЕМАЗ С ПОМОЩЬЮ
АВТОМАТИЗИРОВАННЫХ СИСТЕМ
 Низкая специфичность
невозможность
дифференциации от
других мех-мов. R
 Чувствительность:
удовлетворительная для
MBL и KPC, но
недостаточная для OXA-48

21. Проблема 2:
“There is no hidden mystery behind ESBL-producing
strains... It’s all about the MIC”
P. Ambrose
«Нет никакой скрытой магии в ESBL-продуцирующих
штаммах… Все зависит от МПК»
МПК имеет большее значение, чем
механизм резистентности?

22. Зависимость между %T > МПК и микро-биологической
эффективностью ЦС при экспериментальной
инфекции у мышей
Независимо от механизма
резистентности эффект терапии ЦС
достигается при
 50% T > МПК
Цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон или цефепим
4x - 6x дозы каждые 6 ч в течение суток
«Данные о наличии ESBL не являются
значимыми в дополнение к МПК…»
?
Craig et al. ICAAC 2003, A1318
Andes, Craig. CMI 2005 11(S6): 10–7

23. Критика
 Микробиологическая
Гетерогенность группы «не ESBL» штаммов:
часть штаммов продуцировали AmpC -лактамазы и, следовательно,
должны были проявлять сходную с ESBL продуцентами
резистентность к терапии ЦС III
 ФК/ФД
Для достижения статического эффекта или снижения нагрузки
большинства ESBL+ штаммов потребовались слишком высокие дозы
ЦС, которые не соответствуют терапевтическим, даже с учетом
различия ФК параметров ЦС у человека и животных
Группа Диапазон МПК, 6-ч cтатич. дозы*
мг/л мг/кг
Не ESBL 0,12 – > 16 3,1 – > 1600
ESBL 1 – > 16 71,3 – > 1600
* Расчетные значения, полученные с помощью модели Emax
Craig et al. ICAAC 2003, A1318

24. Новые исследования, доказывающие обратное…
В модели инфекций, вызванных
карбапенемазопродуцирующими
штаммами, у животных
эффективность карбапенемов,
зависела не от МПК, а от типа
карбапенемаз:
NDM-1 – положительный эффект
KPC и OXA-48 – слабый эффект или
отсутствие эффекта

25. Вероятность летального исхода была значительно выше у
пациентов с инфекциями, вызванными VIM+ штаммами с
МПК меропенема или имипенема >4 мг/л, по сравнению с
пациентами, инфицированными in vitro "Ч" VIM+ штаммами
Карбапенемы могут быть эффективны в отношении
карбапенемазо-продуцирующих штаммов K. pneumoniae с
МПК < 4 мг/л
Важность МПК для предсказания эффективности
терапии карбапенемами

26. Weisenberg et al, Diagn Microbiol Infect Dis. 2009 64:233-5
Livermore et al, J Antimicrob Chemother. 2012 67:1569-77
НО… Всегда ли низкие значения МПК позволяют
предсказать положительный исход терапии?
…при наличии карбапенемаз

27. Вспышка, вызванная гипервирулентным штаммом
K. pneumoniae ST23, ко-продуцирующим OXA-48 и CTX-M-15
Drug (combination) MIC,
mg/L
ECOFF-
based
category*
Clinical
susceptibility
category**
Ampicillin ≥256 non-WT R
Amoxicillin-сlavulanic
acid
≥256/4 non-WT R
Piperacillin-tazobactam ≥256/4 non-WT R
Cefoxitin 4 WT -
Cefotaxime ≥256 non-WT R
Ceftazidime 64 non-WT R
Cefepime 32 non-WT R
Aztreonam 64 non-WT R
Ceftazidime-Avibactam 0.25/4 WT S
Imipenem 1 WT S
Meropenem 0.5 non-WT S
Ertapenem 2 non-WT R
Tobramycin 8 non-WT R
Gentamicin 0.5 WT S
Netilmicin 4 non-WT I
Amikacin 4 WT S
Ciprofloxacin 8 non-WT R
Doxycycline 8 non-WT -
Tigecycline 0.25 WT S
Chloramphenicol 16 - R
Colistin 0.125 WT S
Fosfomycin 64 non-WT R
Trimethoprim-
sulfamethoxazole
≥256/4864 non-WT R
Lev AI, Pathog Glob Health. 2018 112(3):142-51
Shaidullina E., et al., ECCMID 2019
 2013-15 гг.: 6 пациентов в
хирургическом ОРИТ
 Во всех случаях
неэффективность
комбинированной терапии
меропенем (8g CI)
± амикацин
± ципрофлоксацин
± тигециклин

28. Механизм резистентности и МПК одинаково
важны для предсказания эффективности
терапии
Механизм МПК

29. “Во-первых, несмотря на то, что есть сообщения о случаях эффективной терапии
цефалоспоринами и карбапенемами инфекций, вызванных, соответственно, продуцентами ESBL
и карбапенемаз с низкими значениями МПК, имеется такое же количество сообщений о
неэффективности подобного рода терапии.
Во-вторых, точность определения чувствительности в рутинной практике обычно ниже, чем при
проведении исследований; таким образом, чувствительность продуцентов ESBL и карбапенемаз
с “истинными” значениями МПК 1-8 мг/л может варьировать между различными категориями в
зависимости о того, кто и как проводит определение чувствительности.
В-третьих, несмотря на то, что EUCAST и CLSI по-прежнему рекомендуют проводить
определение ESBL и карбапенемаз с целью эпидемиологического надзора, наиболее вероятно,
что из-за рекомендации не выявлять эти ферменты для коррекции терапии некоторые
лаборатории полностью откажутся от выполнения соответствующих тестов, что приведет к
утрате важнейшей информации для осуществления инфекционного контроля.
Таким образом, продолжение выявления ESBL и карбапенемаз и, по возможности, недопущение
использования для терапии препаратов, которые они расщепляют, является целесообразным.”

30. «Нередкий» случай…
Пациент с тяжелой нозокомиальной инфекцией
Результат из микробиологической лаборатории:
 Klebsiella pneumoniae
 ЦС III-IV --- МПК >32 мг/л --- Р (R)
 Меропенем --- МПК 2 мг/л --- Ч (S) ?
(непроницаемость? карбапенемаза?)
Для выбора оптимальной терапии крайне важен ответ из
лаборатории о механизмах резистентности!
… к сожалению

31. Методы выявления ESBL у Enterobacterales
Фенотипическая оценка синергизма между оксиимино-ЦС и
клавулановой кислотой
 Метод «двойных дисков»
модификация (использование дисков с нагрузкой ЦС, рекомендуемой EUCAST)
 Метод «комбинированных дисков»
ограничения (только для E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, Salmonella, Shigella)
 Методы разведений
ограничения (согласно рекомендациям производителей тестов, включая тесты для
автоматизированных систем)
 Метод градиентной диффузии
Выявление генов ESBL и мутаций, связанных с расширенным
спектром активности TEM и SHV -лактамаз
 Методы ПЦР-РВ, ПЦР-гибридизации, секвенирования
(простыми и доступными в настоящее время являются только методы выявления
CTX-M ESBL)

32. Рекомендации: какие штаммы тестировать
на наличие ESBL?
 Enterobacterales:
учитывая широкое распространение ESBL среди
нозокомиальных (>70%) и внебольничных штаммов
(>30%) в РФ, рекомендуется тестирование всех
клинических изолятов энтеробактерий
 Другие виды Грам(-) бактерий:
рутинное тестирование является затруднительным из-
за наличия других механизмов устойчивости к
оксиимино--лактамам

33. Метод «двойных дисков» для выявления ESBL
E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis:
CAZ-30, CTX-30
Продуценты AmpC:
Enterobacter, Citrobacter, Serratia,
Morganella, Providencia:
CAZ-30, FEP-30
K. oxytoca, P. vulgaris, P.penneri, C. koseri:
CAZ-30
CAZ-30 CTX-30
AMC-30
30 мм
20 мм
CAZ-30 CTX-30
CAZ – цефтазидим
CTX – цефотаксим
FEP – цефепим
AMC – амоксициллин/клавуланат
Методические рекомендации
КМАХ 2001; 2(3):183-9

34. Диско-диффузионный метод:
содержание АМП в дисках
Диск
Содержание препарата, мкг
CLSI / МУК-2004 EUCAST / КР-2014
Цефепим 30 30
Цефотаксим 30 5
Цефтазидим 30 10
CTX
30
CTX
5
CAZ
30
CAZ
10

35. Анализ эффективности выявления ESBL с помощью
модифицированного метода двойных дисков
Варианты постановки тестов:
1. Диски с нагрузкой CLSI; обычные
расстояния между дисками
2. Диски с уменьшенной нагрузкой
(EUCAST); обычные расстояния между
дисками
3. Диски с уменьшенной нагрузкой
(EUCAST); уменьшенные расстояния
между дисками
4. Диски CAZ с уменьшенной нагрузкой
(EUCAST); использование дисков с FEP
(вместо CTX) для всех видов; обычные
расстояния между дисками
Контрольные штаммы:
ESBL+ (n=43); ESBL- (n=10)
Вид ESBL Кол-во.
E. coli CTX-M-5 2
E. coli CTX-M-15 3
E. coli CTX-M-3 1
P. mirabilis CTX-M-3 1
K. pneumonaie CTX-M-3 1
E. aerogenes CTX-M-8 1
E. coli CTX-M-9 1
E. coli CTX-M-14 1
K. pneumonaie CTX-M-14 1
E. coli CTX-M-42 1
E. coli SHV-2 1
E. coli SHV-3 1
E. coli SHV-4 1
E. coli SHV-5 1
E. coli SHV-6 1
E. coli SHV-8 1
E. coli SHV-18 1
E. coli TEM-3 1
E. coli TEM-4 1
E. coli TEM-6 1
E. coli TEM-9 1
E. coli TEM-10 1
E. coli TEM-11 1
E. coli TEM-26 1
E. coli TEM-143+CTX-M-3 1
E. aerogenes CTX-M-3+SHV-2 1
E. cloacae CTX-M-3+SHV-12 3
E. cloacae CTX-M-14+SHV-12 1
C. freundii CTX-M-15+SHV-12 1
S. marcescens CTX-M-15+SHV-12 1
E. coli CTX-M-3+SHV-12 2
K. pneumoniae CTX-M-3+SHV-12 4
K. pneumoniae CTX-M-14+SHV-12 1
K. pneumoniae CTX-M-14+SHV-2 1
Sukhorukova et al. ECCMID, 2016, EV0404

36. Результаты:
 Продукция ESBL выявлена у всех
контрольных штаммов
(чувствительность 100%) во всех
вариантах постановки теста
 При использовании дисков с меньшей
нагрузкой коррекция расстояния между
дисками не требуется
 FEP может быть использован вместо
CTX для всех видов
CAZ-10
FEP-30
AMC-30
30 мм20 мм
FEP-30
CAZ-10
Эффективность выявления ESBL с помощью
модифицированного метода двойных дисков
CAZ – цефтазидим
FEP – цефепим
AMC – амоксициллин/клавуланат
Sukhorukova et al. ECCMID, 2016, EV0404

37. AmpC: фенотипические методы выявления:
использование комбинированных дисков
CTXCX
CAZCXCTX+C
CTXCCCAZ+C
CAZCC
12 мм
19 мм
CTXCX – cefitaxime + cloxacillin, CTX+C – cefotaxime + clavulanate,
CAZCX- ceftazidime + cloxacillin, CAZ+C – ceftazidime + clavulanate,
CTXCC – cefotaxime+ cloxacillin+ clavulanate, CAZCC – ceftazidime+ cloxacillin+ clavulanate
Cefotaxime + cloxacillin + clavulanate –
Cefotaxime + clavulanate ≥ 5 мм
и/или
Ceftazidime + cloxacillin + clavulanate –
ceftazidime + clavulanate ≥ 5 мм
11 мм
19 мм

38. Методы выявления AmpC: реальная практика?
 Детекция с использованием комбинаций с боронатами и
клоксациллином (комбинированные диски и др.)
- трудоемкость, ↑ стоимость
- необходимость дифференциальной диагностики с КРС
 Молекулярно-генетические методы
- множество генов-мишеней
- трудоемкость, ↑ стоимость
- отсутствие зарегистрированных в РФ коммерческих тестов

39. Методы выявления карбапенемаз у Грам(-) бактерий
Фенотипическая оценка синергизма между -лактамами и
ингибиторами карбапенемаз
 Методы «двойных дисков», «комбинированных дисков»,
градиентной диффузии (ограничения: низкая специфичность или
отсутствие ингибиторов для некоторых типов карбапенемаз)
Методы оценки гидролиза карбапенемов in vitro
 Биохимические (колориметрические) тесты с использованием
pH-индикаторов (Carba-NP, Blue-Carba)
 Масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS)
 Метод инактивации карбапенемов (Carbapenem Inactivation Method, CIM)
Иммунохроматографические тесты
 Тест-полоски (Lateral Flow Strips) (Coris Bioconcept; NG Biotech)
Выявление генов приобретенных карбапенемаз
(и мутаций, связанных с карбапенемазной активностью GES -лактамаз)
 Методы ПЦР-РВ, ПЦР-гибридизации, секвенирования

40. Рекомендации: какие штаммы тестировать
на наличие карбапенемаз?
 Enterobacterales –
пониженная чувствительность к меропенему
или эртапенему (не только I и R штаммы)
 Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp. –
I или R к имипенему и/или меропенему

41. Эртапенем
Меропенем Имипенем
N=627
 OXA-48-гр.
 NDM
 NDM+OXA-48-гр.
 KPC
 VIM
Ч
35,9%
Ч
35,9%
Ч
2,7%
Распределение МПК карбапенемов для изолятов
энтеробактерий, продуцирующих различные карбапенемазы
http://amrmap.ru/?id=Peg5L40jk01jk16

42. P. aeruginosa (N=1506)
Меропенем
Ч
0,14%
Имипенем
Ч
0,14%
A. baumannii (N=1499)
Меропенем
Ч
0,27%
Имипенем
Ч
0,17%
Распределение МПК карбапенемов для изолятов ГНБ,
продуцирующих различные карбапенемазы

43. Первичный скрининг: выявление энтеробактерий -
возможных продукцентов карбапенемаз
Руководство EUCAST по выявлению механизмов резистентности
 Меропенем (MEM) обеспечивает лучшее сочетание чувствительности и
специфичности
 В связи с широким распространением OXA-48 в РФ – рекомендуемая точка
отсечения: МПК > 0,125 мг/л,  зоны подавления роста для диска MEM < 28 мм

44. Алгоритмы детекции карбапенемаз, основанные на
выявлении синергизма карбапенемов с ингибиторами
Руководство EUCAST по выявлению механизмов резистентности
 Слишком сложный и длительный алгоритм для клинических
микробиологических лабораторий
 Не все используемые ингибиторы являются специфичными для
карбапенемаз (проблемы интерпретации)
?

45. “CARBA NP” (Nordmann / Poirel) тест
 Детекция кислых продуктов гидролиза
имипенема с помощью pH-индикатора
(фенолового красного)
 Гидролиз лизатом тестируемой культуры в
коммерческом буфере (B-PER II)
  чувствительность и специфичность при
тестировании Enterobacterales
(для различных карбапенемаз: VIM, IMP, KPC, NMC,
SME, GES, IMI, NDM, OXA-48)
 Метод также эффективен для выявления
карбапенемаз у P. aeruginosa
 Адаптированный вариант (CarbAcineto NP)
применим также для Acinetobacter spp.
(лизис культуры в растворе 5M NaCl)
 Общее время анализа (включая подготовку
образцов и инкубацию): ~1 - 3 часа
- ± - +

46. Blue-Carba – альтернативный метод, основанный
на использовании pH индикаторов…
Pires, Novais, Peixe. JCM 2013;51:4281-3
Преимущества:
pH индикатор: бромтимоловый синий (более явное
изменение цвета)
Лизирующий буфер: не требуется
Субстрат: имипенем (флаконы с лекарственной
формой имипенема-циластатина)
Подходит для: Enterobacterales, P. aeruginosa, Acinetobacter spp.
Коммерческий вариант теста: Rapid CARB Blue Kit, Rosco Diagnostica

47. Коммерческие тесты
Rapidec® CARBA NP, bioMérieux
Rapid CARB Screen®, Rosco Diagnostica

48. Carbapenem Inactivation Method (CIM)
метод инактивации карбапенемов
van der Zwaluw K, et al. PLoS One. 2015;10(3):e0123690

49. Возможные причины ложноотрицательных
результатов CIM (для любых видов бактерий)
Недостаточный
инокулюм
Необходимый инокулюм
(полная петля 10 мкл)
Диск с меропенемом не
полностью погружен
Диск полностью покрыт
жидкостью

50. Эффективность CIM
Enterobacterales 
(NDM, VIM, IMP, KPC, OXA-48-гр.)
P. aeruginosa 
(VIM, IMP, GEScarb)
A. Baumannii 
(OXA-23-гр., OXA-24/40-гр., OXA-58-гр.)
Причины ошибок при тестировании A. baumannii:
- Низкий уровень экспрессии приобретенных OXA-карбапенемаз
- Гиперпродукция видоспецифической карбапенемазы OXA-51-гр.

51. Модифицированный CIM (mCIM) тест
Дифференциация сериновых карбапенемаз
и MBL с помощью ЭДТА (eCIM)
+ЭДТА
Pierce VM, et al. JCM 2017;55(8): 2321-2333
CLSI M100-ED29:2019

52. Выявление карбапенемазной активности с
помощью MALDI-TOF MS
476,2 Da 494,2 Da 450,2 Da
Эртапенем Продукт гидролиза
эртапенема
Продукт гидролиза и
декарбоксилирования
эртапенема
+ 18 Da (H2O) - 44 Da (CO2)

53. Пробоподготовка
0.01М Na-PBS,
pH 7.4
150 мкл
Внести ночную
культуру 10-мкл
петлей
Перемешать до
гомогенного состояния
Внести диск с
эртапенемом (10 мкг)
Перемешать
на вортексе
Инкубировать при
35°C – 2,5-3 часа
Центрифугировать при
14000 rpm - 2 мин.
Отобрать
надосадочную
жидкость (1 мкл)
Shaidullina E. P2255 ECCMID 2018

54. Нанесение пробы на мишень
1 мкл матрицы (HCCA, 50% ACN / 0.1% TFA)
«Сэндвич» - метод
1 мкл супернатанта
1 мкл матрицы
высушить
высушить
высушить
Детекция продукции карбапенемаз
Shaidullina E. P2255 ECCMID 2018

55. Не гидролизированный Гидролизованный
MW 475,2 [Mh+H]+ 494,2
[M+H]+ 476,2 [Mh+Na]+ 516,2
[M+Na]+ 498,2 [Mh+2Na]+ 538,2
[M+2Na]+ 520,2 [Mh/d+H]+ 450,2
[M+3Na]+ 542,2 [Mh/d+Na]+ 472,2
Анализ масс-спектров
Положительный
результат
Отрицательный
результат
Shaidullina E. P2255 ECCMID 2018

56. Иммунохроматографические тесты для
детекции карбапенемаз у энтеробактерий
RESIST-3 O.K.N.: OXA-48, KPC, NDM
Чувствительность и специфичность 100%

57. Иммунохроматографические тесты для детекции
ESBL и карбапенемаз у энтеробактерий
Boutal H. et al.,
ASM Microbe 2017
DOI: 10.13140/RG.2.2.10689.86882
DOI: 10.13140/RG.2.2.35205.65767
Чувствительность и специфичность 100%
NG-Test CTX-M: группы 1, 2, 8, 9
NG-Test CARBA 5: OXA-48, KPC, NDM

58. Молекулярно-генетические методы
выявления карбапенемаз
 Быстрая детекция генов карбапенемаз в клиническом материале
без выделения возбудителя с помощью МАНК (ПЦР, ПЦР-РВ,..)
 В норме стерильные локусы – оптимизация терапии
 Нестерильные локусы – инфекционный контроль
(источником гена R может быть не только возбудитель!)
 Тестирование выделенных в чистой культуре изолятов
 Единственно надежные для выявления генов приобретенных
карбапенемаз у Acinetobacter spp.

59. Карбапенемазы Enterobacterales P. aeruginosa Acinetobacter spp.
VIM + +++ +
IMP + + +
NDM +++ + +
OXA-48 группа +++
OXA-23 группа +++
OXA-24/40 группа +++
OXA-58 группа ++
KPC ++
GES-5 (G170S) ++
Гены каких приобретенных карбапенемаз необходимо
детектировать у разных видов Грам(-) бактерий?
+ единичные случаи;
++ множественные случаи или локальное распространение;
+++ широкое распространение в РФ.
http://amrmap.ru/?id=77R0M29Nr13Nr12; http://amrmap.ru/?id=rqVsz31CG14CG12; http://amrmap.ru/?id=6U3HY54YU12YU12

60. Тест Производитель Гены-мишени
Xpert Carba-R Cepheid KPC, VIM, NDM, IMP-1, OXA-48-like
Verigene BC-GN Nanosphere KPC, VIM, NDM, IMP, OXA-23,
OXA-24/40, OXA-58, OXA-48
Check-MDR CT101
Check-MDR CT102
Check-MDR CT103 XL
Check-Points KPC, OXA-48,-23,-58,-24/40-like, VIM, NDM, IMP, GIM,
GES, SPM;
+ESBL: TEM, SHV, CTX-M, VEB, PER, BEL, GES
+AmpC: CMY I/MOX, ACC, DHA, ACT/MIR, CMY II, FOX
Check-Direct CPE Check-Points KPC, OXA-48-like, VIM, NDM
Check-MDR Carba Check-Points KPC, OXA-48-like, VIM, NDM, IMP
AmpliSens MDR
KPC/OXA-48
ИЛС KPC/OXA-48-like
AmpliSens MDR
MBL
ИЛС VIM, IMP, NDM
AmpliSens MDR
Acinetobacter OXA
ИЛС OXA-23,-24/40,-58,-51-like
Коммерческие молекулярные тесты для
выявления генов карбапенемаз

61. Контрольные штаммы, рекомендации EUCAST*
* В качестве контролей могут быть также использованы другие штаммы,
охарактеризованные с использованием молекулярно-генетических методов