Marina Sukhorukova: In vitro antimicrobial susceptibility testing. Possibilities and limitations of different methods. Selection of methods for a clinical laboratory

1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ
М.В. Сухорукова
НИИ антимикробной химиотерапии
Мурманск, 10 сентября 2019 г.

2. ПАРАМЕТРЫ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ /
РЕЗИСТЕНТНОСТИ
 Определение минимальной концентрации антибиотика, которая
вызывает подавление видимого роста (минимальная подавляющая
концентрация, МПК) или гибель (минимальная бактерицидная
концентрация, МБК) исследуемого МО in vitro в бульонной культуре
или на плотной питательной среде
(некоторые методы, например, методы диффузии в агаре,
позволяют оценивать МПК не напрямую, а косвенно)
 Определение скорости роста/отмирания микробной культуры в
присутствии заданной концентрации антибиотика
 Выявление определенных факторов устойчивости
(с помощью фенотипических или молекулярно-генетических тестов)

3. КЛИНИЧЕСКИЕ КАТЕГОРИИ
ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЭВОЛЮЦИЯ ПОНЯТИЙ
ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ (Ч) / SUSCEPTIBLE (S) – активность АМП
свидетельствует о высокой вероятности эффективности терапии
УМЕРЕННО-РЕЗИСТЕНТНЫЙ (УР) / INTERMEDIATE (I) –
• до 2014 – неясная эффективность терапии…
• 2014-2018 (открытые консультации) – высокая вероятность
эффективности терапии, но только в случае использования более
высоких (по сравнению с обычными) доз или для лечения инфекций в
локусах, где создаются высокие концентрации АБ
РЕЗИСТЕНТНЫЙ (Р) / RESISTANCE (R) – активность АМП свидетельствует
о высокой вероятности терапевтической неудачи

4.  Диффузионные
- диско-диффузионный (ДДМ)
- градиентной диффузии (E-тест и др.)
 Последовательных разведений
- разведений в агаре
- разведений в бульоне
- микроразведений в бульоне
 Автоматизированные системы
- модификация метода микроразведений в бульоне
 Дополнительные методы выявления механизмов резистентности
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
МПК, мкг/мл
Ø зоны подавления роста, мм
МПК, мкг/мл
МПК, мкг/мл
МПК, мкг/мл
МПК (?)
категория Ч-У-Р
категория Ч-У-Р (?)
наличие отдельных
факторов Р

5. МЕТОДЫ РАЗВЕДЕНИЙ
 Стандартизированное in vitro тестирование
 Используются последовательные двойные разведения
антибиотика
 Микроорганизм инокулируется в питательную среду
(агар или бульон)
 Чувствительность определяется измерением
концентрации антибиотика, подавляющей рост
тестируемого микроорганизма
 Критерии интерпретации – пограничные значения МПК →
Ч, УР, Р

6. МЕТОД РАЗВЕДЕНИЙ В БУЛЬОНЕ
Концентрация антибиотика X (мг/л)
0 0,5 1 2 4 8 16 32 64
Контроль
Рост микроорганизма Роста нет

7. МЕТОД МИКРОРАЗВЕДЕНИЙ В БУЛЬОНЕ:
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ S. pneumoniae
рост
нет
роста
МПК
2 мг/л

8. 0,5 мг/л
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
МЕТОД РАЗВЕДЕНИЙ В АГАРЕ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
МПК 2 мг/л
1 мг/л 2 мг/л

9. МЕТОДЫ РАЗВЕДЕНИЙ: ДОСТОИНСТВА
 Количественный
 Стандартизированный
 Высокая воспроизводимость
 Гибкий
 Широкий диапазон концентраций
 Возможность тестирования большинства клинически
значимых бактерий

10. МЕТОДЫ РАЗВЕДЕНИЙ: ОГРАНИЧЕНИЯ
 Трудоемкость
 Необходимость использования химических субстанций
антибиотиков
 Визуальный учет результатов – “trailing end points”
(ингибиторы синтеза фолиевой кислоты, тетрациклины)
 Высокие требования к квалификации персонала
 Крайне редко применяются в клинических
микробиологических лабораториях

11. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ
 Модификация метода микроразведений в бульоне
• метод пограничных концентраций
• определение МПК (двойные последовательные разведения)
 Специальное оборудование (термостатирование, анализ
роста, учет результатов)
 Программное обеспечение – анализ, хранение
результатов

12. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ
 В основе – определении МПК
Принцип – рост исследуемого микроорганизма в присутствии различных
концентраций АБ
• 2-х последовательных
• отдельных концентраций (пограничных)
Метод
• Модифицированный метод микроразведений в бульоне
• Анализ кривых роста

13. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ
Концентрация антибиотика (мг/л)
0
Контроль
42 8 3216 6410,5
Рост микроорганизма Интерпретация
− − Чувствительный
+ − Умеренно
резистентный
+ + Резистентный
~ 2 – 5 разведений для каждого антибиотика в области пограничных концентраций
Метод «пограничных концентраций»

14. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ
Цефтазидим (мг/л)
0,125 42 8 3216 6410,5
~ 2 – 5 разведений для каждого антибиотика в области пограничных концентраций
Ч – EUCAST
Ч – CLSI Р – CLSI
Р – EUCAST
Рост микроорганизма Интерпретация
− − Чувствительный
+ − Умеренно резистентный
+ + Резистентный

15. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ: ДОСТОИНСТВА
 Специальное оборудование и расходные материалы –
↓ контроль качества (при соблюдении условий
транспортировки, хранения и пр.)
 Программное обеспечение – автоматизированный учет
результатов (корректная визуализация) / экспертная
оценка
 ↓ Трудозатраты
 ↓ Требования к квалификации персонала
 ! Наибольшая скорость получения результатов

16. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ: ОГРАНИЧЕНИЯ
 Невозможность тестирования всех клинически значимых
видов бактерий
 Фиксированный набор антибиотиков
 Ограниченный диапазон разведений антибиотиков
 Качественный результат: ≤ Х мг/л или ≥ Y мг/л (Ч, УР, Р)
 Не всегда позволяет выявить резистентные штаммы
 Относительно высокая стоимость тестирования

17.  Trek Diagnostic Systems Ltd.
• 16 типов панелей
 MIKROLATEST® MIC
• 6 типов панелей
 MICRONAUT AST-SYSTEME, Merlin-diagnostika
• 4 типа панелей
 Возможность использования специального оборудования и
работы в «ручном режиме»
КОММЕРЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МПК

18.  MIKROLATEST® MIC – Single Strips
• 21 антибиотик
• планшеты в наборах стриппированы –
возможность работы с 1 изолятом
• возможность автоматизированного и визуального учета
результатов
• хранение при комнатной температуре
КОММЕРЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МПК
в ФОРМАТЕ СТРИП-ПЛАСТИН
 MIC-Strip, Merlin-diagnostika

19. MIKROLATEST® MIC – Single Strips
• пенициллин
• ампициллин
• ампициллин/сульб.
• пиперациллин/тазоб.
• цефепим
• цетазидим
• цефуроксим
• эртапенем
• имипенем
• меропенем
• амикацин
• гентамицин
• ципрофлоксацин
• колистин
• нитрофурантоин
• ко-тримоксазол
• тигециклин
• клиндамицин
• ванкомицин
• линезолид
• тейкопланин

20. ДИСКО-ДИФФУЗИОННЫЙ МЕТОД
 Стандартизированное in vitro тестирование
 В качестве источника АМП – бумажный диск
 Агар инокулируется взвесью тестируемого микроорганизма
 В результате диффузии АМП в агар – зона подавления роста
 Чувствительность определяется измерением диаметра зоны
подавления роста (мм) вокруг диска, содержащего
антибиотик
 Непрямой качественный метод. Критерии интерпретации –
диаметр зоны подавления роста, мм → Ч, УР, Р

21. ТЕОРИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА
К.Е. Купер (K.E. Cooper), 1964
X2 = 4DT 2,3 (log m0 – log m’)
T = L + n log N/N0
X – радиус зоны подавления роста
D – коэффициент диффузии антибиотика
T – время установления зоны подавления
m0 – концентрация антибиотика в диске
m’ – критическая концентрация антибиотика (МПК)
N – масса клеток, формирующихся в единицу времени
N0 – плотность инокулюма

22. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ø ЗОНЫ
ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА
I. Питательная среда
• состав
• рН
• толщина агара
• влажность
• плотность
• содержание ионов
Са2+, Мg2+, Zn2+ и других веществ
II. Антибиотики
• молекулярная масса
• количество в диске
• скорость диффузии в агар
• стабильность
• растворимость
• наличие активных и неактивных
примесей
III. Микроорганизм
• вид микроорганизма
• плотность инокулюма
• скорость роста
IV. Условия инкубации
• атмосфера
• температура
• длительность
V. Метод учета результатов
• интенсивность и угол
освещения

23. ДДМ: ОГРАНИЧЕНИЯ
 Непрямой полуколичественный метод
 Используется только для быстро растущих
микроорганизмов
 Необходимость строгого контроля качества

24. ДДМ: ДОСТОИНСТВА
 Стандартизация метода
 Высокая воспроизводимость
 Гибкость
- комбинации антибиотиков
- различное количество и наборы антибиотиков
- широкие возможности выявления
механизмов резистентности
 Относительно низкая стоимость
 Технологическая доступность
 Возможность использования автоматизированных систем
учета и интерпретации результатов

25. МЕТОД ГРАДИЕНТНОЙ ДИФФУЗИИ
Êîä àíòèáèîòèêàКод антибиотика
Шкала учета
Водонепроницаемый
носитель
ME
256
192
128
96
64
48
32
24
16
12
8
6
4
3
2
1.5
1.0
.75
.50
.25
.38
E
Постоянный градиент
антибиотика
E-test (bioMerieux)
M.I.C.E. (OXOID)
MTS (Liofilchem)

26. МПК 0,125 мг/л
Рост бактерий
Эллипсовидная зона
подавления роста
МЕТОД ГРАДИЕНТНОЙ ДИФФУЗИИ: УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА

27. МЕТОД ГРАДИЕНТНОЙ ДИФФУЗИИ: ДОСТОИНСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ
+ Высокая воспроизводимость
+ Количественный (определение МПК)
+ Стандартизация
+ Гибкость
+ Возможность тестирования большинства клинически
значимых видов бактерий
+ Широкий диапазон концентраций
+ Технологическая простота
- Высокая стоимость

28. КОГДА НАДО ОПРЕДЕЛЯТЬ МПК?
 Определенные комбинации микроорганизм / антибиотик
Enterobacteriaceae / колистин*
Enterobacteriaceae / карбапенемы (промежуточный рез-тат)
Salmonella spp. / ципрофлоксацин*
P. aeruginosa / колистин, полимиксин В*
Acinetobacter spp. / колистин, полимиксин В
Enterococcus spp. / ванкомицин (промежуточный рез-тат)
Staphylococcus spp. / ванкомицин, тейкопланин, телаванцин*
Staphylococcus spp. / даптомицин, фосфомицин*
Стрептококки групп A, B, C и G / даптомицин*
S. pneumoniae / пенициллин, ампициллин, цефепим, цефотаксим, цефтаролин,
цефтриаксон и др. ЦС, карбапенемы*
Стрептококки группы Viridans / пенициллин*
* Клинические рекомендации, 2015-02, EUCAST Breakpoint table v. 5.0

29. КОГДА НАДО ОПРЕДЕЛЯТЬ МПК?
 Определенные виды микроорганизмов
Neisseria spp., Helicobacter pylori, анаэробы, грибы, микобактерии*
 Определенные виды инфекционных заболеваний:
эндокардит, сепсис, менингит
(напр., Haemophilus influenzae / меропенем / менингит)*
 Многоцентровые эпидемиологические исследования
* Клинические рекомендации, 2015-02, EUCAST Breakpoint table v. 5.0

30. ВЫБОР МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
«В настоящее время большинство лабораторий предпочитает
пользоваться 2 методами, особенно при использовании
автоматизированных систем… Преимуществом использование двух
методов является также возможность проверки необычных
результатов определения чувствительности.»
G. Kahlmeter, J. Turnidge
ДДМ + градиентная диффузия
или
Автоматизированный + градиентная диффузия
или
Автоматизированный + ДДМ
Автоматизированный/ДДМ + МПК (метод разведений)