1. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Основы xMAP - технологии мультиплексирования
Приборы семейства Био-Плекс
Марина Таракина
ООО «Био-Рад Лаборатории»

2. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Мультиплексирование
Терминология
Мультиплексирование – это
определение десятков
типов биомолекул в одной пробе
xMAP – xMultiple Analyte Profiling
Аналит – определяемая молекула
(мишень)

3. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
ИФА – Иммуноферментный анализ
1. Основан на взаимодействии антитела с антигеном.
2. Уже более 50-ти лет используется для
определения различных соединений (как в науке, так и
в клинической диагностике). От ИРА к ИФА.
3. Метод рутинный, с низкой себестоимостью,
легок в использовании, имеет множество модификаций
в зависимости от задач. 10 000 публикаций ежегодно.
В то же время метод имеет ряд ограничений:
1. Требуется довольно большое количество
образца.
2. Неспецифическое взаимодействие.
3. В подавляющем большинстве случаев
используется фермент-опосредованное
усиление сигнала.
4. Ограниченная производительность – 96
луночный планшет.

4. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
xMAP
Технология xMAP
Анализ на Анализ на
плоскости микросфере
ELISA ELISA на бусине

5. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
xMAP
Технология xMAP
В основе – окраска микросфер в различные «цвета»
• 2 красителя: красный и инфракрасный
• 10 концентраций каждого красителя
• 10 х 10 = 100 вариантов окраски
Red IR(infrared)
(660 nm) (730 nm)

6. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
xMAP
Технология xMAP
Полистироловые
микросферы
Частицы размером 3.4 мкм на человеческом волосе, 1000x
Сканирующая электронная микроскопия.

7. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
xMAP
Технология хМАР
• 2-цветная система
• Соотношение 2-х
флуоресцентных
классифицирующих
красителей – уникальная
флуоресцентная подпись
• Микросферы производятся
Люминексом

8. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Конъюгация антител с микросферами
• Первичные антитела к интересующим нас белковым аналитам
пришиваются к микросферам различных типов

9. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Смешивание микросфер разных типов
4-плексный
анализ
Приготовление
смеси 4 типов
микросфер

10. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Связывание молекул образца
•Добавление образца к смеси микросфер
•Инкубация
•Отмывка

11. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Детекция

12. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Схема эксперимента
1. Смешать образцы,
стандарты, контроли Инкубация 30 мин 2. Добавить
и микросферы с детектирующие
пришитыми к ним биотинилирован
ные антитела
первичными
антителами
Между каждым Инкубация 30 мин
этапом - промывка
Bio-Plex Pro Wash Station
4. Считывание результатов
в приборе Био-Плекс 200
3. Детекция:
стрептавидин-
ФЭ
Инкубация 10 мин
Анализ цитокинов – за 3,5 часа

13. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Преимущества хМАР
•Стратегия:
– Увеличение числа лабораторий, которые могут позволить себе
хMAP посредством продаж более доступной системы
– Фокусирование на пользователях, работающих с ELISA (ИФА),
предлагая им действительно недорогое решение их задач
– Продажа прибора в те организации, куда мы сможем продавать наши
наборы (прибор не для использования с наборами пользователя)
•Куда идти с МАГПИКСом:
– К пользователям ELISA с ограниченным бюджетом
– В лаборатории, которые хотят поставить у себя xMAP
– В лаборатории, для которых важна простота обслуживания
инструментального парка и низкие затраты на его сервис
– К текущим пользователям старых моделей Люминекса/Био-Плекса
– Где активно ставят вестерн-блотинги

14. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Преимущества мультиплексного подхода
• Малый объем пробы
– Важен при анализе редких и особо ценных образцов
• Данные по нескольким параметрам в одной пробе
– Многократное увеличение объема информации от одного образца
– Меньшее количество циклов оттаивания/замораживания
• Комплексное изучение взаимодействий между различными аналитами
– Поиск молекул, вовлеченных в различные сигнальные пути
• Надежность результатов: один прибор, один оператор, один день, один
прогон
• Снижение трудозатрат и себестоимости экспериментов
– Экономия времени и бюджета по сравнению с классическими подходами

15. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Приборы для технологии хМАР: 2 типа
Проточные флуориметры
Каждая микросфера опрашивается
индивидуально.
Био-Плекс 200, Био-Плекс 3D
Флуоресцентный имиджер
Все микросферы детектируются одновременно
Био-Плекс МАГПИКС

16. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

17. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

18. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Система анализа микросфер Био-Плекс
Прибор
Программное Реактивы
•Готовые панели
обеспечение •Реагенты для создания
Bio-Plex Manager 6.1 своих панелей
Bio-Plex Data Pro
•Наборы для
Техподдержка калибровки/валидации
www.bio-rad.com/bio-plex

19. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Портфолио панелей производства Bio-Rad для
исследования биомаркеров
Скрининг на широкий спектр биомаркеров
• Цитокины и факторы роста (126 показателей)
• Белки сигнальной трансдукции (50 показателей)
Специализированные панели на патологические состояния
• Острая фаза (9 показателей)
• Онкопанель (16 показателей)
• Ангиогенез (9 показателей)
• Диабет (26 показателей)
• Изотипирование АТ (7 показателей)
• Прецизионная цитокиновая панель Pro (10 показателей)

20. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Панели постоянного состава для анализа
цитокинов человека

21. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Панели на патологические состояния

22. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Онкомаркеры
Target Target Name
Target Target Name 1 Angiopoietin-2
1 sEGFR 2 sCD40L
2 FGF-basic 3 EGF
3 Follistatin 4 Endoglin
4 G-C SF 5 sFASL
5 sHER-2/neu 6 HB-EGF
6 H GF 7 IL-6
7 sIL-6Ra 8 IL-8
8 Lep tin 9 IL-18
9 Osteopontin 10 PAI-1
10 PDGF- AB/BB 11 PLGF
11 PECAM-1 12 TNF-α
12 Prolactin 13 TGF-α
13 SCF 14 uPA
14 sTIE-2 15 VEGF-A
15 sVEGFR-1 16 VEGF-C
16 sVEGFR-2; Flk 17 VEGF-D
18 IGFBP-1

23. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Фосфобелки: внутриклеточная сигнализация

24. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Вы можете заказать свою конфигурацию панели

25. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Набор для пришивки через аминогруппу
Стандартный протокол конъюгации
• Для создания собственных O
панелей
• Включает в себя:
OH
• Реактивы для конъюгации O
H
N
O
S-NHS
• Буферы 1. Активация
EDAC
• Протокол ( ~3 ч) SO3Na
микросферы
O
O
• COOH микросферы (магнитные O
N
или полистироловые) SO3Na
приобретаются отдельно O
R-NH2 2. Формирование
амидной связи
O
R
N
H

26. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Возможные варианты
К поверхности микросфер можно пришить антитела, антигены,
субстраты для ферментов, рецепторы, нуклеиновые кислоты…

27. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Дополнительная информация
www.bio-rad.com/bio-plex

28. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
хМАР – надежная, проверенная технология
Уже опубликовано более 10 000 статей в рецензируемых журналах
28

29. Таракина М.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Спасибо за внимание!