RT-PCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen secara kualitatif melalui pembuatan DNA komplementer (cDNA) dari RNA. Teknik ini melibatkan transkripsi balik RNA menjadi cDNA, kemudian amplifikasi cDNA menggunakan PCR. Hasil amplifikasi dapat dideteksi secara kuantitatif menggunakan sinyal fluoresens selama proses PCR atau secara kualitatif pasca PCR. RT-PCR banyak digunakan dalam diagnosis penyakit dan penel

1. PENGENALAN RT PCR
Referensi:
1.Prinsip dan Teknik Biokimia dan Biologi Molekuler 7thedisi oleh Keith Wilson dan John Walker, Teknologi DNA
Rekombinan dan Penerapannya: Tinjauan oleh SA Shinde et al,
2.Dasar rekayasa genetika dan bioteknologi, oleh Dr.Mohiuddin Kabir.
ANDI ARIYANDY
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN
Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.com

2. BedanyaPCRKonvensional denganRT-PCR?
• Perbedaanyang palingumum antaraPCRKonvensional(PCR
KUALITATIF)danRT-PCRyaitu analisis hasil amplifikasi
fragmenDNApadaPCRkonvensional dilakukan dengan visualisasi
padaagarelektroforesis.SedangkanPCR waktu nyata,jumlahDNA
yangdiamplifikasi dapat dideteksi dan diukurdisetiap siklusproses PCR.
• RT-PCR = REVERSE TRANSCRIPTASE PCR (Reaksi
pengubahanRNAmenjadicDNAdgn menggunakan enzimMembalikkan
Transkripsi)
• RT-PCR = PCR-WAKTU NYATAatauPCR KUANTITATIF (qPCR)

4. Apa ituRT-PCR?
• Reaksi berantai polimerase waktu nyataatau sering disebut reaksi
berantai polimerase kuantitatif(qPCR),merupakan suatu metode
biologis molekuler berbasis reaksi rantai polimerase.
• Metode ini mendeteksi amplifikasitarget genselamaproses
PCRberlangsung,tidakdiakhir reaksi,seperti padaPCRkonvensional.
qPCRmenggunakan fluoresens,dimana peningkatan sinyal fluoresens
pertunjukan terjadinya amplifikasitarget genselamaproses PCR.

5. DeteksiqPCR
• (A)setuju berbasis hijau SYBR. hijau
SYBRberikatan dengan semuaDNAutas
ganda dan menghasilkan sinyal fluoresens.
• (B)setuju
berbasisprobe.Jikamengujiutuh,tidak ada
sinyalyangdideteksi/tidak adatarget
gen.Jikaprimerdanmengujimenempel
padatarget genkemudian enzim
Taqpolimerasemensintesis utas
baruDNA,maka enzim5′eksonuklease akan
bekerja pecahmengujisehingga pada
akhirnya dihasilkan sinyal fluoresens.
• Peningkatan sinyal fluoresens ini
pertunjukan terjadinya amplifikasitarget
gen.
Smith dan Osborn, FEMS, 2008

6. qPCR
• Jikabahangenetika
daritargetadalahRNA,makaRNAdiubah
dulu menjadicDNAsebelum
dilakukanPCR.Langkah ini disebut
transkripsi terbalik(RT).
• 2.RTdapat dilakukan dengansatu langkah
(RTdan amplifikasi dilakukan sekaligus
dalam mesinPCR)ataudua langkah
(dibuatcDNAdulu dalam suatu tabung
sebelum dilakukanPCR).
• 3.qPCRsingleplex:hanya1 target gen
yangdiamplifikasiperreaksi. Menyelidiki
target gendiberi nama fluoresens
tertentu
https://www.thermofisher.com/id/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/basic-principles-rt-qp

7. https://www.thermofisher.com/pengenal/en/home/life-
science/cloning/cloning-learning-tengah/invitrogen-sekolah-
biologi-molekuler/pcr-pendidikan/pcr-reagen-enzim/pcr-
methods.html
• 4. multipleks qPCR:lebih dari1 target
gen yangdideteksiperreaksi.
Mengujimasing-masingtarget gendiberi
nama fluoresensyangberbeda sehingga
dapat berbedagen mana
yangdiamplifikasi.
• 5.Saat melakukanqPCR:kontrol
negatif,kontrol
positif,kontrolinterndiberlari sama
dengan

8. • 6.Kurva amplifikasi pada
hasilqPCRkontrol positif dan
sampelyangpositif akan
berbentuksigmoid
• 7.Ct(ambang siklus)nilaiatau Cq
pertunjukan jumlah
siklusyangdiperlukan sinyal
fluoresens untuk melewati
taman/ambang.Nilai Ctberbanding
terbalik dengan jumlahDNA
sasaranpada sampel(Nilai
Ctyangrendah pertunjukan
jumlahtarget DNA yangbesar).
https://www.cogentech.it/realtime-pcr-eng-technical-details.php

10. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)
• PCRnyadigunakan untuk memperkuat fragmen DNA yang tepat dari
campuran kompleks bahan awal yang biasanya disebut DNA
cetakandan dalam banyak kasus membutuhkan sedikit pemurnian
DNA.

11. •Membalikkan reaksi berantai polimerase transkripsi(RT-PCR) adalah salah satu dari
banyak varian reaksi berantai polimerase (PCR).
•Itu diperkenalkan pada tahun 1977 .
•Penemuan reverse transcriptase selama studi replikasi virus dari materi genetik
menyebabkan pengembangan RT-PCR.
•RT-PCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen secara kualitatif melalui
pembuatan DNA komplementer (cDNA) transkrip dari RNA.
•Teknik ini umumnya digunakan dalam biologi molekuler untuk mendeteksi ekspresi
RNA.

12. V/S
RT-PCR PCR

13. Prinsip RT-PCR
Ada beberapa jenis Prinsip RT PCR. Satu langkah RT PCR
• RT-PCR juga dapat dilakukan sebagai RT-PCR satu langkah di
mana semua komponen reaksi dicampur dalam satu tabung
sebelum reaksi dimulai.
• RT-PCR satu langkah menawarkan kesederhanaan dan
kenyamanan serta meminimalkan kemungkinan kontaminasi.
• HasilnyacDNAtidak dapat digunakan untuk mendeteksi banyak
pesan dari sampel RNA tunggal seperti pada RT-PCR dua
langkah.
PCR RT dua langkah
• Secara tradisional, RT-PCR melibatkan dua langkah: reaksi RT
dan amplifikasi PCR.
• RNA pertama-tama ditranskripsi balik menjadi DNA
komplementer (cDNA) menggunakan enzim, reverse
transcriptase.
• HasilnyacDNAdigunakan sebagai template untuk amplifikasi
PCR selanjutnya menggunakan primer spesifik untuk satu atau
lebih gen.

14. Prinsip RT-PCR
Kuantifikasi produk RT-PCR sebagian besar dapat dibagi menjadi dua kategori:Titik akhir dan waktu
nyata.
• RT-PCR titik akhir:pendekatan pengukuran gen deteksi titik akhir RT-PCR
tingkat ekspresi dengan menggunakan pewarna neon sepertiethidium
bromida,Fosfor-32pelabelan produk PCR menggunakanphosphoimager. RT-PCR titik akhir umumnya dicapai
dengan menggunakan tiga metode berbeda: relatif, kompetitif, dan komparatif.
• RT-PCR waktu-nyata:analisis dan deteksi produk PCR secara real-time telah menyebabkan adopsi RT-PCR real-
time secara luas untuk analisis ekspresi gen.
• Ada empat probe DNA fluoresen yang berbeda untuk mendeteksi produk PCR: SYBR Green,TaqMan, Suar
Molekul, dan Kalajengking. Semua probe ini memungkinkan deteksi produk PCR dengan menghasilkan sinyal
fluoresen.

16. DNA gratis (cDNA) vs DNA genom (gDNA)
• Perbedaan utama yang harus dibuat antara cDNA dan gDNA adalah
keberadaan intron dan ekson.Intronadalah nukleotida dalam gen yang
tidak memiliki urutan pengkodean.
• cDNA dapat digambarkan sebagai gDNA tanpa semua daerah
nonkode yang diperlukan, begitulah namanya sebagai DNA
pelengkap. Ketika para ilmuwan menggunakan enzim virus untuk
membuat cDNA dari RNA yang diisolasi dari sel dan jaringan yang
mereka pelajari, cDNA tidak mengandung intron. karena disambung
dalam mRNA.

17. Amplifikasi eksponensial melalui reaksi berantai transkripsi polimerase terbalik menyediakan teknik yang sangat
sensitif di mana jumlah salinan molekul RNA yang sangat rendah dapat dideteksi. RT-PCR banyak digunakan dalam
diagnosis penyakit genetik dan,secara semikuantitatif, dalam penentuan kelimpahan molekul RNA spesifik yang
berbeda di dalam sel atau jaringan sebagai ukuran ekspresi gen.
•Metode penelitian-Sebagai contoh, Lin et al. digunakanqRT-PCR untuk mengukur ekspresi gen Gal dalam sel ragi.
•Penyisipan Gen-RT-PCR juga bisa sangat berguna dalam penyisipan gen eukariotik ke prokariota. RT-PCR biasa
digunakan dalam mempelajari genom virus yang genomnya tersusun atas RNA, sepertivirus influenzaA dan
retrovirus seperti HIV.
•Diagnosis Penyakit Genetik-RT-PCR dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit genetik sepertiLesch–
Nyhansindroma. Juga dapat digunakan sebagai tes flu burung-H7N9.
•Deteksi Kanker-Para ilmuwan sedang mencari cara untuk menggunakan RT-PCR dalam deteksi kanker untuk
membantu meningkatkan prognosis, dan memantau respons terhadap terapi
•RT-PCR biasa digunakan dalam mempelajari genom virus yang genomnya tersusun atas RNA, sepertivirus
influenzaA dan retrovirus seperti HIV.
Penerapan RT-PCR

18. 1
8
Interpretasi hasil PCR:
validmasukan hasil, tidak
validulang proses analisis
Input data hasil di sistem
Verifikasi hasil
Pengiriman hasil
Pengecekan identitas
Pencatatan
Pengkodean
Penyimpanan
Alikuot sampel
EkstraksiRNA
Pencampuran reaksiPCR
PCR
Pra-analisis
Analisis
Pos-analisis
Bagaimana
sampelmengusappr
oses untuk setuju
Covid19denganRT-
PCR?
AlurPemeriksaanMengusap
2-3 jam
7-8 jam
2-3 jam

19. 19
alur kerja qPCRuntuk setujuCOVID-19
Analisis
Run PCR
Reverse
transcription (RT)
RNA  cDNA
Ekstraksi
RNA
Swab
200uldigunakan untuk
ekstraksi,sisanya
disimpandi -80HaiC
Manualatau
menggunakan
alat ekstraktor
Metodesatu
langkahatauPCR
dua langkah
Singleplex ataumultipleks Analisis kurva
amplifikasidanNilai Ct

20. 1. Buku Panduan Dasar-Dasar Kultur Sel oleh GIBCO dan Invitrogen,
Prinsip dan teknik Biokimia danMolekulbiologi 7thedisi oleh Keith
Wilson dan John Walker, Teknologi DNA Rekombinan dan
Penerapannya: Tinjauan oleh SAShindeet al.
2. Dasar rekayasa genetika dan bioteknologi, oleh Dr.Mohiuddin
Kabir.
3. PCR laboratoriumUnud
Referensi