3. ELISA
ELISA adalah teknik pengujian
biokimia berbasis plat yang
dirancang untuk mendeteksi dan
mengukur peptida, protein, antibody,
hormon, mendeteksi dan mengukur
antigen, antibody.
Prinsip : Pengikatan Spesifik Antigen-Antibodi
yang di labeli dengan enzim
Kualitatif : Antibodi mengikat Antigen tertentu
Kuantitatif : Konsentrasi Pengikatan Antigen-Antibodi
diukur berdasarkan nilai absorbansi,
Konsentrasi dihitung berdasarkan kurva
standar.
Tujuan : Mendeteksi keberadaan Antigen /
Antibodi tertentu
Hasil : ELISA reader hingga mendapatkan
berupa densitas optis (OD), dengan
menghitung rata-rata Kontrol negatif yang
digunakan, didapat nilai cut-off untuk
menentukan hasil positif – negatif suatu
sampel
4. MATERIAL ELISA
1. Antigen
2. Monoclonal Antibodi
3. Microplate
4. Blocking Buffer
5. Serum sample
6. Conjugate (secondary Anti
bodi + Enzyme)
7. Subtrate
8. Stop Sol
6. JENIS – JENIS ELISA
Direct Indirect Sandwich Competitive
7. DIRECT ELISA
Direct ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan
untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi suatu
antigen. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan
langsung (direct) dengan antibodi detector (antibodi
yang telah dilabeli oleh enzim reporter). Antibodi yang
digunakan pada teknik direct ELISA berjumlah satu
buah.
8.
9. Kekurangan direct ELISA
Amplifikasi signal hanya sedikit
Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan
berkurang akibat bertaut dengan enzim
Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan
enzim (label) pada percobaan yang berbeda
Kelebihan Direct ELISA
Pengujian cepat karena hanya menggunakan satu
jenis antibody
Kemungkinan terjadinya kegagalan akibat reaksi
silang dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat
diminimalisasi
10. INDIRECT ELISA
• Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur
konsentrasi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu antigen tidak
menempel langsung pada antibodi detector (indirect). Antigen akan berikatan dengan antibodi
lain terlebih dahulu. Antibodi tersebut kemudian akan berikatan dengan antibodi yang telah
dilabeli.
• Kelebihan indirect ELISA yaitu memiliki sensitivitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi.
• Kekurangan indirect ELISA yaitu membutuhkan waktu yang lama dan terjadi cross reaksi.
11. SANDWICH ELISA
Sandwich ELISA merupakan jenis ELISA yang dapat digunakan untuk mengukur antigen maupun
antibodi. Karakteristik khas dari sandwich ELISA adalah menggunakan antibodi penangkap atau primer
antibodi. Antigen yang akan dideteksi dan diukur konsentrasinya berikatan terlebih dahulu dengan
antibodi penangkap. Antigen akan berikatan kembali dengan antibodi sesuai jenis sandwich ELISA
yang digunakan. Sandwich ELISA dibagi menjadi dua jenis yaitu sandwich direct ELISA dan sandwich
indirect ELISA.
13. UJI ELISA SANDWICH
• Uji Immunologik yang paling baik untuk
mendeteksi dua jenis Ab adalah uji ELISA
sandwich.
• Uji imunologik ini digunakan untuk
mendeteksi konsentrasi Ag dari sampel
yang tidak diketahui.
• Uji EliSA ini sangat cepat dan sangat
akurat, dan bila Ag murni telah tersedia
sebagai standar, maka uji ELISA
sandwich memerlukan dua Ab yang dapat
melekat pada dua epitope yang tidak
saling menutupi (overlap) pada Ag.
• Uji ini sangat cocok untuk menggunakan
dua monoclonal Ab murni atau satu set
dari ikatan Ab poliklonal murni.
15. ELISA kompetitif atau ELISA pemblok dapat
digunakan untuk mengukur antibodi maupun
antigen.
Prinsip dasar dari teknik ELISA kompetitif adalah
dengan menambahkan suatu kompetitor ke
dalam lubang microtiter/well.
ELISA dapat dilakukan secara kompetitif
langsung (direct competitive) dan kompetitif tak
langsung (indirect competitive) ELISA.
COMPETITIVE
16. Kelebihan competitive ELISA
Tidak diperlukan purifikasi pada sampel yng mengandung
antibody/antigen, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat
sensitivitas tinggi akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen
Editor's Notes
Reagen Ab yang telah dimurniikan (Capture Ab) di masukkan dalam sumur ELISA plate yang telah dilapisi dengan solid phase kemudian Ab tersebut mengikat solid phase tersebut di dalam dasar sumur.
Kemudian Ag ditambahkan dan dibiarkan mengkilat sebagai ikatan Ab kompleks. Sebagian yang tidak mengikat dibuang dengan mencuci plate tersebut dengan aquades.
Kemudian Ab yang kedua yang telah dilabel (detected Ab) ditambahkan dan biarkan mengikat pada Ag, hal inilah yang disebut Sandwich.
Mengukur jumlah ab yang dilabel yang mengikat dengan melihat perubahan warna pada saat dilakukan penambahan substrat (colorimetrik).
Pembacaan dilakukan dengan elisa reader.
Keuntungan uji ini adalah Ag yang diuji tidak perlu dimurnikan dan uji ini sangat spesifik. Tetapi kerugiannya, tidak semua Ab dapat digunakan,
Di mana pasangan kombinasi ab monoclonal harus baik dan sesuai dengan epitope dari Ag
