Kelompok 8 - A Highly Selective Amperometric Biosensor Array for Simultaneous Determination of Glutamate, Glucose, Choline, Acetylcholine, Lactate and Pyruvate.pdf

A Highly Selective Amperometric Biosensor Array
for The simultaneous Determination of
Glutamate, Glucose, Choline, Acetylcholine, Lactate and Pyruvate
KELOMPOK 8
Nur Sekti Waskitha Jati (18318023)
Nur Mutmainnah Rahim (18319006) Namira Husaimah (18319039)
Nugroho Adiyono (18319007)

Biosensor adalah device yang mengonversi konsentrasi
analit menjadi arus atau tegangan dengan
menggunakan transduser.
Beberapa biosensor dapat disusun sebagai array atau
multibiosensor.
Biosensor
Sumber : D.Yu. Kucherenko dkk (2019). A highly selective amperometric biosensor array for the simultaneous determination of glutamate, glucose,
choline, acetylcholine, lactate and pyruvate. www.elsevier.com/locate/bioelechem
3

Neurotransmitters
■ Glutamat -> Neurotransmitter
■ Asetilkolin -> Neurotransmitter
Metabolit
■ Glukosa -> Sumber energi
■ Laktat -> Sumber energi di otak
■ Piruvat -> Sumber laktat/asetil coA
■ Kolin -> Prekursor asetilkolin
Kegunaan: Deteksi penyakit neurodegeneratif
Analit
4

Digunakan enzim glutamat oksidase, glukosa
oksidase, laktat oksidase, piruvat oksidase, kolin
oksidase, dan asetilkolin oksidase sebagai penentu
aktivitas analit.
Seluruh biosensor mempunyai transduser
amperometric dengan menggunakan platinum disc
electrodes. Digunakan poly-phenylenediamine
sebagai membran serta glutaraldehyde untuk
membantu ikat enzim ke membran. Gliserol juga
ditambahkan untuk stabilisasi enzim selama
imobilisasi.
Transduser terdiri dari gelas kapiler dengan kawat
platinum di dalamnya.
Material dan Desain
6

Selektivitas transduser amperometrik ditingkatkan dengan pengendapan membran polimer
tambahan ke daerah sensitif sebelum imobilisasi enzim
1. Auxiliary electrode dan reference electrode direndam dalam larutan 5 mM
m-phenylenediamine dan buffer 10 mM kalium fosfat dengan PH 7,4
2. 10-15 voltamogram siklik diterima tanpa mengaduk larutan.
Parameter voltammogram adalah:
■ potensial awal 0 V
■ potensial akhir +0,9 V
■ laju perubahan potensial 20 mV/s
■ langkah perubahan potensial 5 mV
3. Membran diendapkan pada setiap transduser secara bergantian
4. transduser dikeringkan dan enzim diimobilisasi pada membran poli (fenilendiamin).
Modifikasi dengan phenylenediamine
7

Elemen biorecognition diperoleh dengan imobilisasi kovalen enzim dan zat tambahan pada
permukaan transduser amperometrik
Larutan awal mengandung 8% GluOx, 4% BSA, dan 10% gliserol dalam 100 mM buffer fosfat
dengan pH 6,5.
Larutan ini dicampur dengan larutan glutaraldehid dalam air 0,4% dengan perbandingan 1:1.
Setelah campuran ini diendapkan ke permukaan transduser, kemudian dikeringkan selama 40
menit di udara pada suhu kamar
Kemudian Komponen membran bioselektif yang tidak terikat dan glutaraldehida yang berlebihan
dicuci dengan larutan buffer kerja.
Fabrication of biorecognition elements
8

■ glukosa
5% GOx, 3% BSA, 10% gliserol dalam 20 mM dapar fosfat dengan pH 6,5.
Konsentrasi GA adalah 0,4%, durasi imobilisasi - 40 menit.
■ kolin
8% ChOx, 4% BSA, 10% gliserol dalam 100 mM buffer fosfat dengan pH 6,5.
Konsentrasi GA adalah 1,6%, durasi imobilisasi - 10 menit.
■ penentuan laktat
8% LOx, 4% BSA, 10% gliserol dalam 100 mM dapar fosfat dengan pH 6,5.
Konsentrasi GA adalah 1%, durasi imobilisasi - 40 menit.
Prosedur imobilisasi enzim untuk biosensor lain
9

■ Asetilkolin
dilakukan dua prosedur imobilisasi berurutan.
1. AChE diendapkan, kemudian ChOx.
2. Larutan 0,5% AChE, 5% BSA, 10% gliserol dalam 100 mM buffer fosfat dengan pH 6,5
3. dicampur dengan larutan GA 1%
4. diendapkan pada transduser selama 10 menit.
5. Setelah itu, larutan yang mengandung 8% ChOx, 4% BSA, 10% gliserol dalam buffer yang
sama,dicampur dengan larutan GA 1,6% dan diimobilisasi selama 10 menit.
■ piruvat
1. Larutan 20% PyrOx, 5% BSA, 10% gliserol dalam 100 mM buffer fosfat dengan pH 6,5.
2. kemudian dicampur dengan 13,3% larutan PVA-SbQ berair dalam rasio 1:1.
3. Segera setelah itu, campuran diendapkan ke permukaan sensitif transduser dan disinari UV
selama 20 menit menggunakan lampu KF-4 M.
Prosedur imobilisasi enzim untuk biosensor lain 10

Pengukuran dilakukan pada suhu kamar dalam sel 4 ml terbuka
dengan pengadukan konstan dan pada potensial konstan +0,6 V
berlawanan dengan elektroda referensi Ag/AgCl
25 mM HEPES dengan pH 7,4 digunakan sebagai buffer.
Untuk biosensor piruvat perlu ditambahkan juga kofaktor ion
PyrOx – magnesium (120 M), TPP (500 M), dan ion fosfat (20
mM).
Konsentrasi substrat dalam sel kerja diperoleh dengan
menambakan alikuot larutan stok (50 mM – 1 mM).
Semua pengukuran dilakukan dalam tiga ulangan
titik pada graﬁk mewakili nilai rata-rata hasil.
Prosedur Pengukuran
11

Perhitungan dari biosensor array berdasarkan reaksi
enzim. Reaksinya dapat dilihat pada gambar disamping.
Keenam reaksi tersebut akan menghasilkan oksidasi
substrat (glutamat, glukosa, acetylcholine, choline,
lactate dan pyruvate) dan hidrogen peroksida. Pada
potensial positif (+0,6 V) , pada elektroda, terjadi
dekomposisi hidrogen peroksida yang menghasilkan
pembentukan elektron.
Dari elektron akan menghasilkan arus .Arus yang
dihasilkan ini sebanding dengan konsentrasi analit.
Prinsip Biosensor Array
Reaction 1 - for glutamate determination; reaction 2 – for glucose determination;
reactions 3 and 4 - for acetylcholine determination; reaction 4 - for choline
determination; reaction 5 - for lactate determination; reaction 6 - for pyruvate de-
termination
Setiap analit membutuhkan enzim yang sesuai :
13

Setiap enzim dicirikan oleh rentang kerja pH dan nilai pH optimal. Untuk enzim yang digunakan ini,
produsen mengklaim pH optimum untuk GluOx sekitar 7–9; GOx 5.5 (rentang kerja 4–7); ChОx –
8.0–8.5; AChE – 8.0; LOx – 6,5; PyrOx – pH 6,7. Namun, nilai pH optimal sering berubah setelah
imobilisasi enzim dan bergeser ke daerah basa atau asam. Kadang-kadang, imobilisasi
menghasilkan rentang kerja pH enzim yang lebih luas secara signiﬁkan .
Pengaruh buffer pH
glutamate (1), glucose (2), choline (3), acetylcholine (4), lactate (5), pyruvate (6).
14

Perubahan konsentrasi dari kerja buffer atau
penambahan sampel biologi ke sel biosensor
menyebabkan perubahan kapasitas buffer yang mana
juga bisa memengaruhi kerja biosensor.
Pada gambar disamping, respons semua biosensor
berubah secara tidak signiﬁkan pada konsentrasi buffer
yang berbeda. Waktu respons juga tetap sama. Oleh
karena itu, susunan biosensor yang diusulkan dapat
digunakan dalam sampel biologis, yang dicirikan oleh
kapasitas buffer yang berbeda.
Pengaruh buffer kapasitas
15

Ikatan ionik bisa membantu meningkatkan performa dari
biosensor. Ikatan ionik bervariasi tergantung konsentrasi dari
buffer. Biosensor bekerja memeriksa variasi nilai dari ikatan
ionik.
Dalam hal ini, digunakan larutan NaCl sebagai sumber ion yang
ditambahkan ke sel kerja dalam alikuot yang berbeda untuk
mendapatkan konsentrasi dalam kisaran 0 hingga 50 mM.
Hasilnya dapat dilihat pada gambar di samping.
Dari gambar disamping menunjukkan bahwa tidak ada
perubahan signiﬁkan dalam respons biosensor yang khas
untuk biosensor amperometrik.Maka, kita dapat menggunakan
susunan biosensor dalam sampel biologis dengan kekuatan
ionik yang berbeda.
Pengaruh ikatan ionik
Concentrations of substrates in the cell: glutamate (1) - 100 μM, glucose (2)
- 100 μM, choline (3) - 100 μM, acetylcholine (4) - 100 μM, lactate (5) - 50
μM, pyruvate (6) - 250 μM. The measurements were carried out in 25 mM
HEPES buffer, pH 7.4, at a constant potential of +0.6 V vs Ag/AgCl
reference electrode.
16

Pengukuran dilakukan sebanyak 15 kali dengan
mencampur ke-6 zat dalam larutan buffer HEPES, pH
7.4, dan diberi potensial konstan +0,6 V terhadap
elektroda Ag/AgCl. Setiap pengukuran berlangsung
selama 3-5 menit dengan selang waktu antar
pengukuran sekitar 10 menit.
Didapatkan hasil reprodusibilitas yang cukup tinggi dan
standar deviasi yang tidak lebih dari 5%.
Reprodusibilitas
17

Selektivitas
Penggunaan
mediator-free biosensor
dengan potensial tinggi
Oksidasi senyawa
elektrik aktif
Pelapisan
poly(phenylenedia
mine)
- Pelapisan membran berfungsi untuk mencegah difusi dari
molekul besar ke permukaan transduser, namun masih
melewatkan senyawa hidrogen peroksida
- Proses pelapisan dilakukan dengan elektropolimerisasi
- Senyawa pelapis terbaik adalah m-phenylenediamine
- Adanya senyawa lain tidak mempengaruhi efektivitas
biosensor
- Biosensor asetilkolin tidak hanya sensitif pada asetilkolin,
melainkan juga pada kolin
18

Analisis karakteristik (i)
Kurva kalibrasi penentuan
substrat
1. Glutamat
2. Kolin
3. Laktat
4. Glukosa
5. Asetilkolin
6. Piruvat
Daerah kerja keseluruhan
ditunjukkan pada graﬁk A
& B, sementara daerah
linier ditunjukkan pada
graﬁk C & D
19

Analisis karakteristik (ii)
- Respon waktu bisa ditingkatkan dengan mengurangi tebal membran atau mengukur
gradien respon
- Sensitivitas penentuan piruvat terendah karena hilangnya aktivitas PyrOx selama
imobilisasi
- Penyimpanan biosensor dilakukan pada suhu 18o
C dengan biosensor terstabil adalah
glukosa
- Peningkatan konsentrasi oksigen (tekanan parsial) sampel darah 50-100 mmHg menjadi
150 mmHg meningkatkan daerah linier dari biosensor, kecuali deteksi glukosa dengan
konsentrasi < 3mM (yang optimal pada keadaan 7 mmHg)
20

1. Biosensor array yang dikembangkan mampu mengkarakterisasi
6 senyawa, yaitu glukosa, glutamat, asetilkolin, kolin, piruvat, dan
laktat.
2. Kekuatan ionik dan kapasitas buffer tidak mempengaruhi respon
biosensor.
3. pH efektif biosensor adalah 7.4
4. Biosensor array memiliki selektivitas dan reprodusibilitas yang
tinggi.
5. Biosensor array bisa disimpan dalam hitungan bulan sehingga
cocok untuk diimplementasikan secara nyata dan dilakukan
pengembangan lebih lanjut
Kesimpulan
22

■ Kucherenko, D. Y., Kucherenko, I. S., Soldatkin, O. O., Topolnikova, Y. V.,
Dzyadevych, S. V., & Soldatkin, A. P. (2019). A highly selective amperometric
biosensor array for the simultaneous determination of glutamate, glucose,
choline, acetylcholine, lactate and pyruvate. Bioelectrochemistry.
■ Riske, L., Thomas, R. K., Baker, G. B., & Dursun, S. M. (2016). Lactate in the brain:
an update on its relevance to brain energy, neurons, glia and panic disorder.
Therapeutic Advances in Psychopharmacology, 7(2), 85–89.
Daftar pustaka
23

Kelompok 8 - A Highly Selective Amperometric Biosensor Array for Simultaneous Determination of Glutamate, Glucose, Choline, Acetylcholine, Lactate and Pyruvate.pdf

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Kelompok 8 - A Highly Selective Amperometric Biosensor Array for Simultaneous Determination of Glutamate, Glucose, Choline, Acetylcholine, Lactate and Pyruvate.pdf

Similar to Kelompok 8 - A Highly Selective Amperometric Biosensor Array for Simultaneous Determination of Glutamate, Glucose, Choline, Acetylcholine, Lactate and Pyruvate.pdf (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (7)

Kelompok 8 - A Highly Selective Amperometric Biosensor Array for Simultaneous Determination of Glutamate, Glucose, Choline, Acetylcholine, Lactate and Pyruvate.pdf