1. KELOMPOK 2 GENETIKA
1. KEREN BERLIANA ZEBUA (RRA1C41700
2. RIZA ALIFIA ZUKRI (RRA1C41700
3. KARMILA PASARIBU (RSA1C417001)
4. GUSTI ARI (RSA1C417002)
5. RINA APRIANTI NAINGGOLAN (RSA1C417003)
DNA
REKOMBINAN
2. Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA
(bahasa Inggris: deoxyribonucleic acid), adalah sejenis
asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun
berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA
umumnya terletak di dalam inti sel.
Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel
adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan
cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi
setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol
adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk
organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus).
DNA (ASAM DEOKSIRIBONUKLEAT)
3. Struktur DNA
DNA merupakan polimer yang
terdiri dari tiga komponen
utama, yaitu gugus fosfat, gula
deoksiribosa, dan basa
nitrogen. Sebuah unit monomer
DNA yang terdiri dari ketiga
komponen tersebut dinamakan
nukleotida, sehingga DNA
tergolong sebagai
polinukleotida.
Struktur untai komplementer DNA
menunjukkan pasangan basa (adenin
dengan timin dan guanin dengan sitosin)
yang membentuk DNA beruntai ganda.
Rangka utama untai DNA terdiri dari
gugus fosfat dan gula yang berselang-
seling.
DNA terdiri atas dua untai yang berpilin
membentuk struktur heliks ganda.
4. Deoksiribonukleotida
Bagian dari molekul DNA yang
membawa informasi genetik adalah
basa nitrogennya, sementara gula
dan phosphat berperan dalam
membentuk struktur (tulang
punggung) DNA. Basa nitrogen
merupakan turunan dari purin dan
pirimidin Purin dalam DNA adalah
adenin (A) dan guanin (G),
sedangkan pirimidinnya adalah timin
(T) dan sitosin (C). Gula di dalam
deoksiribonukleotida adalah
deoksiribosa.
5. Kata deoksi menunjukkan bahwa gula (ribosa)
tersebut kehilangan satu atom oksigen. Dalam suatu
molekul deoksiribonukleotida, atom karbon nomer1
(C-1)
dari deoksiribosa berikatan dengan atom N nomer 1
(N-1) dari pirimidin atau N nomer 9 (N-9) dari purin;
sedangkan fosfat terikat/teresterifikasi pada atom
karbon nomer 5(C-5) dari gula
Nukleotida-nukleotida yang menyusun DNA terikat
satu dengan yang lain melalui suatu jembatan fosfat
(ikatan fosfodiester). Pada suatu reaksi
pemanjangan rantai DNA, nukleotida yang baru
terikat pada atom karbon nomer 3 (C-3) dari
deoksiribosa.
7. satu molekul DNA tersusun oleh dua utasan polinukleotida,
dan antara kedua utasan terjadi perpasangan basa.
Perpasangan basa ini terjadi berkat terbentuknya ikatan
hidrogen antara basa yang berpasangan tersebut, dua
ikatan untuk A-T dan tiga ikatan untuk G-C
8. Suatu rantai DNA diawali dari ujung 5’P diakhiri pada
ujung 3’OH. Ujung
phosphate disebut ujung 5’P karena phospat terikat
pada atom C nomer 5 dari gula
ribose, sedangakan ujung OH disebut ujung 3’OH
karena OH tersebut terikat pada
atom C nomer 3 dari gula ribosa.
Penemuan lain yang membawa kepada
kesimpulan tentang struktur DNA
ialah hasil studi kristalografi DNA yang dilakukan
oleh Rosalind Franklin dan
Maurice Wilkins (1953). Dari foto kristalografi DNA
ditemukan celah sebesar 0,34
nm dan selanjutnya terdapat struktur yang
berulang setiap 3,4 nm
9. PENGERTIAN DNA REKOMBINAN
DNA rekombinan adalah
pembentukan kombinasi
materi genetik yang baru
dengan cara penyisipan
molekul DNA ke dalam suatu
vektor sehingga
memungkinkannya untuk
terintegrasi dan mengalami
perbanyakan di dalam suatu
sel organisme lain yang
berperan sebagai sel inang.
Teknologi DNA Rekombinan
merupakan kumpulan teknik
atau metoda yang digunakan
untuk mengkombinasikan
gen-gen di dalam tabung
reaksi. Teknik-teknik tersebut
meliputi: Teknik untuk
mengisolasi DNA, Teknik
untuk memotong DNA,
Teknik untuk menggabung
atau menyambung DNA, dan
Teknik untuk memasukkan
DNA ke dalam sel hidup.
10. Tujuan dilakukan rekombinasi
DNA
Tujuan secara umum yaitu menyambungkan gen yang ada di dalam
DNA sehingga diperoleh organisme baru. Berikut contohnya:
Bidang kesehatan : produksi insulin manusia secara
masal, pembuatan vaksin virus hepatitis B, produksi
hormone tumbuh manusia (GH), terapi gen untuk
penyakit.
Bidang pertanian : pembuatan bakteri ice (bakteri tahan
beku), mikrobia pendegradasi imbah, tanaman tahan
hama, peningkatan nutrisi pangan.
Bidang pengembangan ilmu pengetahuan : membantu
upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia,
perwujudan proyek genom manusia dan organisme yang
lain.
11. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Teknologi DNA rekombinan adalah kumpulan teknik atau metode
yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen didalam tabung
reaksi. Teknik-teknik tersebut adalah :
1
2
3
4
Teknik untuk mengisolasi DNA
Teknik untuk memotong DNA
Teknik untuk mengabung atau menyambung DNA
Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup
12. 1. Teknik Isolasi DNA
Teknik isolasi merupakan bagian dari konjugasi yaitu merupakan
perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) kedalam sel bakteri
lainnya( sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.
Sel donor ( sel jantan) memasukan sebagian DNA nya kedalam
sel resipien (sel betina) Transfer Dna ini melalui pili seks yang
dimiliki oleh sel jantan. Sel betina tidak memiiki pili seks.
DNA dari sel jantan berpindah ke dalam sel betina secara replikatif.
Oleh karena itu, setelah proses konjugasi selesai, sel jantan tidak
kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel berpisah
kembali dan jumlah sel tidak bertambah (setelah konjugasi tidak
dihasilkan anak sel). Oleh karena itu, proses konjugasi ini disebut
juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif.
13. 2. Teknik Memotong
DNA
Pada tahun 1960, Werner Arber &
Hamilton Smith menemukan
enzim dari mikroba yang dapat
memotong DNA utas ganda.
Enzim tersebut mengenal dan
memotong DNA pada sekuen
spesifik yang panjang 4 sampai
dengan 6 pasang basa. Enzim
tersebut dikenal dengan enzim
restriksi atau enzim endonuklease
restriksi.
Enzim restriksi memotong DNA
bukan pada sembarang tempat,
tetapi memotong DNA pada bagian
tertentu. Bagian pada DNA yang
dikenai aksi pemotongan oleh enzim
restriksi ini dinamakan sekuens
pengenal. Suatu sekuens pengenal
adalah urutan nukleotida (urutan
basa) tertentu yang dikenal oleh
enzim restriksi sebagai tempat atau
bagian yang akan dipotongnya.
Salah satu contoh enzim restriksi ini
adalah enzim EcoRI.
14. Berdasarkan cara pemotongannya Enzim retriksi
digolongkan menjadi dua:
Endonuklease, memotong nukleotida
dari arah dalam
Eksonuklease, memotong nukleotida
hanya pada ujung atau dari arah luar.
1) pemotongan sticky
end
2) pemotongan blunt end
Secara umum berdasarkan hasil pemotongan DNA double strain dengan
enzim endonuklease memilik dua bentuk yaitu:
15.
16. Untuk menyambung DNA digunakan Enzim DNA ligase.
Pada tahun 1972, David Jackson, Robert Simon, dan
Paul Berg melaporkan bahwa mereka berhasil membuat
molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil
menggabungkan fragmen-fragmen DNA dengan cara
memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu
fragmen dengan ujung sticky ends fragmen lainnya,
kemudian menyambungkan kedua ujung fragmen-
fragmen tersebut secara kovalen dengan menggunakan
enzim DNA ligase. Keberhasilan membuat DNA
rekombinan ini terjadi tidak lama setelah enzim restriksi
ditemukan dan diisolasi pertama kali dari E.coli oleh
Herbert Boyer yaitu pada tahun 1969 .
3. Teknik Menggabung dan Menyambung
DNA
17. Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi
harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya,
fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan
(diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
Ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-
fragmen DNA secara in vitro yaitu:
1) Ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Cara ini hanya
dapat digunakan untuk meligasi sticky end.
2) Ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi
dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Cara
yang kedua ini dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada
blunt end.
18. Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan
DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul
DNA tersebut dengan menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil
elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah
terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA
rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar
dapat diperbanyak dengan cepat.
19. 4. Teknik Memasukan DNA Kedalam Sel
Hidup
Setelah melakukan ligasi atau penggabungan DNA maka proses
selanjutnya adalah memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel
organisme prokariot maupun eukariot sehingga DNA rekombinan dapat
berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan.
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya
DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel
inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di
antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih
harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA
rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
20. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi
setelah transformasi dilakukan yaitu:
Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau
berarti transformasi gagal.
Sel inang dimasuki vektor religasi atau
berarti ligasi gagal.
Sel inang dimasuki vektor rekombinan
dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen
yang diinginkan.
21. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat
perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang
memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa
kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan
antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang
terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu
sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa
kemungkinan ketigalah yang terjadi.
22. Replikasi DNA pada organisme prokariotik
Replikasi molekul DNA dimulai pada tempat- tempat
khusus yang disebut pangkal replikasi (origin of replication).
Kromosom bakteri, yang berbentuk melingkar, mempunyai satu
pangkal, yaitu satu bagian DNA yang mempunyai urutan
nukleotida yang spesifik. Replikasi DNA berlangsung pada
kedua arah mengelilingi kromosom sirkuler sampai keseluruhan
kromosom tersebut telah diproduksi. Enzim yang memulai replikasi
mengenali urutan ini dan menempel pada DNA, memisahkan
kedua rantai dan membentuk sebuah gelembung yang dinamakan
gelembung replikasi. Replikasi DNA kemudian berjalan dalam dua
arah sampai seluruh molekul tersebut disalin.
23. Replikasi DNA pada organisme eukariotik
Pada eukariota, replikasi DNA dimulai pada
tempat- tempat spesifik dimana kedua untai DNA
induk berpisah membentuk gelembung replikasi.
Daerah tersebut dinamakan pangkal replikasi. Pada
eukariota, terdapat ratusan atau ribuan daerah
pangkal replikasi di sepanjang molekul DNA.
Gelembung replikasi terentang secara lateral,
sementara replikasi DNA bergerak kedua arah. Pada
akhirnya, gelembung replikasi akan menyatu di
tengah, dan sintesis rantai DNA anak pun selesai.
24. Mekanisme Replikasi DNA
Pada tahun 1960, mekanisme sederhana dari replikasi
DNA dianggap bahwa kedua rantai baru tumbuh secara kontinyu,
dimana nukleotida pernukleotida ditambahkan pada garpu replikasi
DNA dan bergerak dari ujung molekul DNA ke ujung yang lain.
Kedua rantai DNA yang anti paralel, menyebabkan munculnya
Permasalahan. Sebab bila demikian, maka mekanisme
seperti dikemukakan di atas membutuhkan satu rantai anak yang
tumbuh dari arah 5’ – 3’ dan rantai yang lain tumbuh dari arah 3’ –
5’. Pada garpu replikasi terdapat dua rantai yang dikenal dengan
rantai cepat (leading strand) dan rantai lambat (lagging strand)
dengan struktur yang asimetris.
Pada rantai cepat, DNA polimerase hanya mampu
memanjangkan rantai baru DNA dengan arah 5’ – 3’ ketika replikasi
sedang berjalan. Pada rantai lambat, rantai tumbuh secara
menyeluruh dalam 3’ – 5’ dengan penambahan segmen- segmen
pendek yang dikenal dengan fragmen okazaki. Fragmen okazaki
secara individu tumbuh dengan arah 5’ – 3’.
