Nhân nhanh cây hoa dã yên thảo (petunia hybrida) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhân giống cây hoa Dã yên thảo (petunỉa hybrida) bằng phương pháp tạo cụm chồi trong điều kiện in vỉtro.

1. Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
NGUYỄN THÙY VÂN
NHÂN NHANH CÂY HOA DÃ YÊN THẢO
(PETUNIA HYBRIDA) BẰNG KĨ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ TÉ BÀO THựC VẬT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC • • • •
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngưòi hướng dẫn khoa học Th.s La Việt Hồng
HÀ NỘI –

2. Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng - Khoa Sinh KTNN
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa
luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô
Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân Phong - Trung tâm
Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyến giao Công nghệ đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến
đế tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu
Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí
nghiệm Thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương
tiện đế tôi có thế hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học
tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày 10 thảng 04 năm 2015 Sinh viên
NGUYỄN THÙY VÂN

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội, 10 tháng 04 năm 2015 Sinh viên
NGUYỄN THÙY VÂN

4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết
bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
NAA: Napthlacetic acid
BAP: 6-Benzyl amino purin
MS: Murashige và Skoog
Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh
Nxb: Nhà xuất bản
Ctv Cộng tác viên

5. DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng ..18
Bảng 2.2. Ánh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã
yên thảo ...............................................................................................................19
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của a-NAA và nước dừađến tạo rễ cây Dã yên thảo in
vitro .....................................................................................................................20
Bảng 2.4. Ánh hưởng của giá thể tới tỷ lệ sống của Dã yên thảo .............................. 21
Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng đối với chồi cây hoa Dã yên thảo....................... 23
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi cây Dã yên
thảo............................................................................................................................. 29
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của a-NAA và nước dừa đến sự hình thành rễ ở cây Dã
yên thảo ...............................................................................................................31
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của giá thể tới rèn luyện cây ngoài tự nhiên........................... 33
Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng.................................. 23
cây Dã yên thảo........................................................................................................ 23
Hình 3.2. Chồi cây hoa Dã yên thảo. (Trái) mẫu in vỉtro vô trùng sau 5 ngày nuôi
cấy, (Phải) mẫu in vỉtro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy ..............................................24
Hình 3.3. Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Dã yên
thảo.............................................................................................................................25
Hình 3.4. Quá trình phát sinh phôi ở cây 2 lá mầm (Arabidopsis) .......................... 27
Hình 3.5. Quá trình phát sinh phôi soma của cây Dã yên thảo ................................ 28
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến hệ số nhân nhanh từ chồi cây
hoa Dã yên thảo..........................................................................................................29
Hình 3.7. Cụm chồi Dã yên thảo sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường có bố sung
BAP ............................................................................................................................30

6. DANH MỤC HÌNH
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele :
0973.287.149
Hình 3.8. Tạo rễ cây Dã yên thảo in vỉtro................................................................ 32
Hình 3.9. Dã yên thảo trong giai đoạn rèn luyện ..................................................... 34
Hình 3.10. Dã yên thảo in vitro đã ra hoa ngoài tự nhiên ........................................ 34
Hình 3.11. Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo in vitro .............................................. 35

7. MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu ..............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu...............................................................................................2
4. Ý nghĩa của đề tài ...................................................................................................2
NỘI DUNG..................................................................................................................3
CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3
1.1. Giới thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrỉda).............................................3
1.1.1. Vị trí, phân loại ..................................................................................................3
1.1.2. Mô tả ..................................................................................................................3
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố ...........................................................................................4
1.1.4. Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo................................................5
1.1.5. Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo...................................................................7
1.2. Sơ lược về nhân giống in vỉtro........................................................................... 8
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật............................................... 8
1.2.2. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam ..................................................................9
1.2.3. Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô ....................................9
1.3. Các nghiên cứu về nhân giống in vỉtro cây Dã yên thảo ..........................13
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................15
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................15
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu .........................................................................15

8. Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele :
0973.287.149
2.2.1.Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 15
2.2.2.Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 15
2.2.3.Môi trường nuôi cấy ......................................................................................... 16
2.2.4.Điều kiện nuôi cấy in vitro ............................................................................... 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 17
2.3.1.Bố trí thí nghiệm............................................................................................... 17
2.3.2.Nội dung nghiên cứu......................................................................................... 17
2.3.3.Phương pháp phân tích số liệu.......................................................................... 21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 22
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu ỉn vỉtro từ chồicây hoa Dã yên thảo............................... 22
3.2. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụmchồi ỉn vỉtro.. 26
3.2.1.Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Dã yên thảo
in vỉtro ........................................................................................................................ 26
3.2.2.Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên
thảo............................................................................................................................. 28
3.3. Tạo 1'ễ cây Dã yên thảo ỉn vỉtro (Ảnh hưởngcủa a-NAA và nước dừa đến
khả năng tạo rễ).......................................................................................................... 30
3.4. Rèn luyện cây Dã yên thảo ỉn vỉtro ngoài môi trường tự nhiên ....................... 32
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 36
4.1. Kết luận............................................................................................................. 36
4.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 37
MỞ ĐÀU

9. 2
1. Lý do chọn đề tài
Sau những phút giây bận bịu với công việc, mỗi người có thể tìm cho
mình những thú chơi tao nhã giúp xả stress. Có người đến trung tâm thể dục thể
thao, bơi lội để rèn luyện sức khỏe, có người lại tìm tới các lóp nấu ăn, làm đẹp,
cũng có người lại ở nhà xem tivi, máy tình hay chơi điện tử.. .Bên cạnh đó, có
không ít người tìm đến thú vui trồng hoa đế có khoảng không gian thoáng đảng
với những chậu hoa rực rõ' sắc màu [13].
Xã hội đô thị hóa đất chật người đông với những người yêu thích cây
xanh thì việc có một mảnh vườn trồng cây thì thật khó. Vì vậy việc tận dụng ban
công để trồng hoa quả là ý kiến sáng suốt. Hiện nay việc trồng hoa trang trí ban
công đang rất thịnh hành và được ưa chuộng đặc biệt là các khu đô thị. Mỗi sớm
thức dậy bạn có thể ra đứng hít thở khí trời, ngắm nhìn ánh bình minh hay ngắm
cảnh mặt trời mọc, làm như thế nào để ngôi nhà nhỏ xinh của bạn trông quyến
rũ, phong cách mà không cần ban công quá cầu kì. Xu hướng tận dụng ban công
để làm đẹp cho ngôi nhà của mình ngày càng trở nên ưa chuộng, đặc biệt đối với
những ngôi nhà có diện tích không lớn, không thế đủ đế thiết kế một sân vườn,
hay một không gian thoáng rộng nơi mặt đất. Ket họp ban công sắt với họa tiết
trang trí đơn giản điểm tô một vài chậu hoa là ý kiến sáng tạo cho trang trí ngôi
nhà bạn. Chỉ cần chút khéo léo kết họp ban công sắt với cây cảnh, cỏ cây hoa lá,
bạn sẽ sở hữu một không gian độc đáo ấn tượng [14].
Nhưng giá thành của một số loài hoa, cây cảnh vẫn khá cao trong đó có
hoa Dã yên thảo - “nữ hoàng hoa ban công”. Hoa Dã yên thảo được du nhập vào
nước ta hiện nay chủ yếu là nhân giống từ hạt. Tuy nhiên theo Verdork (2005)
cây hoa Dã yên thảo có hạt nhỏ và rất chậm để xử lý nhân giống bằng hạt. Đối
với nhân giống bằng cành thì hệ số nhân thấp, không đồng đều nên chưa thể đáp
ứng nhu cầu khi cần trồng cây với số lượng lớn, đồng loạt. Trong khi đó nuôi

10. 3
cấy mô là một phương pháp hiệu quả trong nhân giống. Đe chủ động trong việc
sản xuất cây giống và giảm giá thành chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài:
“Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo (petunia hybrida) bang kĩ thuật nuôi cấy mô
tế bào thực vật
2. Mục đích nghiên cứu
Nhân giống cây hoa Dã yên thảo (petunỉa hybrida) bằng phương pháp tạo cụm
chồi trong điều kiện in vỉtro.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu in vitro từ chồi đỉnh cây Dã yên thảo (petunia hybrỉda)
- Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của cây Dã yên thảo (petunia
hybrỉda) in vitro .
- Ảnh hưởng của a - NAA đến khả năng ra rễ của cây Dã yên thảo (petunỉa
hybrỉda) ỉn vỉtro.
4. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa lí luận: Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân
giống in vitro cây Dã yên thảo (petunia hybrida).
Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần sản xuất cây giống Dã yên thảo có hiệu quả
cao, chất lượng tốt.

11. 4
NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giói thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrida)
1.1.1. Vị trí, phân loại
Giới: Plantea(Thực vật)
Giới phụ: Tracheobionta Ngành:
Magnoliophyta Ngành phụ:
spermatophyta Lớp:
Magnoliopsida Lớp phụ: Asteridae
Bộ: Solanales Họ: Solanaseae
Giống: Petunia Hình 1.1. Hoa Dã yên thảo
Tên khoa học: Petunia hybrỉda {petunia hybrida)
Tên thông thường: Petunia
Tên việt nam: Dạ yên thảo, Dã yên thảo [15].
1.1.2. Mô tã
Dã yên thảo là cây sống hằng năm, cây cao 1 5 - 3 0 cm. Thân có lông mịn bao
quanh, phân nhánh từ các nách lá thật, một nách lá có thể phân nhiều nhánh. Lá đơn,
mọc đối hay luân phiên, mặt trên và dưới của lá có phủ lớp lông mịn. Lá hình oval,
mềm mại, mép nguyên không có răng cưa.
Hoa cô độc, mọc trên một cọng dài 2 - 3 cm, đài hoa cao 1 - 2,5 cm. Hoa lưỡng
tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành. Nang hủy ngăn thành hai mảnh,
hạt nhiều và rất nhỏ [2]. Hoa Dã yên thảo nguyên thủy có hình phễu, tuy nhiên sự lai
tạo đã cho nhiều dạng hoa khác nhau như: hoa cánh đơn, hoa cánh kép với mép có
viền và gợn sóng, mép dúng hình cung

12. 5
nhọn ở giữa. Màu sắc hoa có thể thay đổi từ tía đến trắng, tía đến đỏ, đỏ đến cam,
tím đến tím nhạt. Đặc biệt nhiều loại Dã yên thảo trắng thuần khiết hay xanh nhạt
pha hơi đỏ (màu hoa oải hương) có mùi thơm dịu dàng.
Dã yên thảo là cây nhất niên, nở hoa vào mùa hè. Dã yên thảo ưa sáng, sẽ trở
nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm
vừa phải, có thể sống trong điều kiện hơi khô nhưng không thích ứng với điều kiện
ngập úng. Cây thích hợp với khí hậu nóng và ấm, không chịu được nhiệt độ quá lạnh
hay quá nóng. Dã yên thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất
màu mỡ, đất có pH từ 6.0 - 7.0. Bấm đọt để kích thích cây đâm nhánh tạo độ rũ cho
cây, nếu cây ốm yếu hay sau khi cho hoa rộ thì cũng nên tỉa lá bớt để cây phục hồi
lại.
Dã yên thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới nước đúng liều
lượng, không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ
sinh và duy trì ẩm độ thích hợp. Ngoài ra, Dã yên thảo thường bị héo rũ do nấm, bị
thối nhũn do vi khuấn cũng như sâu, sên, rệp cắn phá. Một số bệnh virus cũng ảnh
hưởng nhiều đến cây như làm biến dạng lá, cây chậm phát triến, hoa không có màu
và hình dạng thay đối, thân tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị
lốm đốm và héo, có khi kết dính thành cụm [16].
1,1.3. Nguồn gốc, phân bố
Hoa Dã yên thảo thuộc chi 35 của một loài thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ
với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà (Solanaceae) [11].
Cây hoa Dã yên thảo có nguồn gốc từ các nước miền Nam châu Mỹ, hiện nay
được gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng, vườn hoa khắp nước ta. Ở
miền bắc, hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền nam, hoa nở vào dịp Tết. Cây có nhiều
tên gọi khác nhau, theo Phạm Hoàng Hộ (2000) cây có tên là dã yên, theo Trần Hợp
(2000) có tên là cây hoa cà.

13. 6
Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài khác của chi petunia, ví như
P.axillaris BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng, hoặc p.
vỉolacea Lindl. (Violet-flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím.
Ngày nay, các nhà vườn từ loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa
xòe ngón rất đẹp [3].
1.1.4. Một số đặc điếm của cây hoa Dã yên thảo
1.1.4.1. Các loạỉ Dã yên thảo
Hoa Dã yên thảo có ba loại:
Dã yên thảo đơn: cây bụi, có rất nhiều hoa nhưng hoa chỉ có 1 lớp cánh, đường
kính của hoa lên tới 5-7,5 cm, dễ trồng và ít ảnh hưởng đến sâu bọ. Cánh có thể đơn
lớp và đa lớp, dạng gợn sóng. Hoa có thể có sọc, đốm hoặc viền quanh cánh với
nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng,
vàng. Khi chạm vào lá và cuống hoa thấy hơi dính và có mùi thơm rất khác biệt.
Dã yên thảo kép: hoa lớn với nhiều cánh, đường kính của hoa có thể lên đến 13
cm.
Dã yên thảo lượn sóng: là cây thân leo, mùi thơm benzen đặc trưng vì trên cây
có rất nhiều tinh dầu [17].
Hoa Dã yên thảo đơn Hoa Dã yên thảo kép

14. 7
Hoa Dã yên thảo biển sóng Hình 1.2. Các loạỉ Dã yên thảo ngoàỉ tự nhiên
ỉ. 1.4.2. Cách trồng Dã yên thảo
Có thế trồng bằng hai cách đó là giâm cành và trông từ hạt, với cách trồng hoa dã
yên thảo bằng hạt thì cần làm đất kỹ và đủ ánh nắng trước khi gieo hạt, hạt gieo 4-6 ngày
sẽ cho cây con và có thể đem trồng ở vườn ươm sau 20 ngày. Sau 20 - 25 ngày nữa thì
đem trồng ở vườn hoa, đất trồng cần đủ phân. Đối với cành giâm, sau 20 ngày đã có rễ
và sau 1 tháng bứng trồng ở nơi cố định. Cây chóng cho hoa, nhưng nở rộ và chóng tàn,
quả cần thu hoạch kịp thời (lg quả có 10.000 - 12.000 hạt) [18].
Dã yên thảo thường được côn trùng thụ phấn, ngoại lệ với loài p.exserta là một loài
hiếm có hoa màu đỏ thì được chim ruồi thụ phấn. Hầu hết Dã yên thảo là loài lưỡng bôi
có 14 nhiễm sắc thế [9], [10]. Những bông hoa hình ống được ưa chuộng bởi một số loài

15. 8
Lepỉdoptera, bao gồm cả chim bướm (Hummingbird) [19].
1.1.4.3.Nhược điếm của hoa Dã yên thảo
- Là cây thân thảo, nhạy cảm đặc biệt trước các thay đối của thời tiết và nhiệt độ cao mùa
hè.
- Không chịu được mưa nhiều, không chịu úng (Chậu hoa nên đăt nơi không chịu mưa
trực tiếp).
- Bộ rễ rất nhạy cảm với nhiệt độ ngoại cảnh, trên 36°c dễ bị nẫu bộ rễ khi nhiệt độ lên
cao (nên che mát bồn chậu trồng khi ở nhiệt độ này).
- Bị nhiễm nấm làm nhũn thối cổ rễ, hoặc khô teo tại gốc giữa các cành kết với thân
chính do tốn thương khi đóng gói vận chuyến.
- Cây sẽ bị chết ngay do mất nước (Khi cây thiếu nước có biểu hiện héo rũ, bố sung nước
lại cũng sẽ rất khó phục hồi do dã yên thảo có lá mỏng, hoa, lá nhiều,thân rỗng) vì vậy
cần quan tâm bổ sung đều nước [18].
1.1.5. Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo
- Thường ngắt ngọn khi cây còn nhỏ và để cây gia tăng số lượng mầm.
- Không trồng trong chậu quá nhỏ. Đất thịt, đất mịn quá là không thích họp, không
bền cây.
- Khi cây quá già thực hiện cắt bớt thân ngọn, giữ gìn các phần thân (Thực hiện
vào ngày mát) có thể thay đất hoặc chậu to hơn (vào mùa xuân), bổ xung dinh dưỡng cây
sẽ bật mầm lộc dày và trong thời gian ngắn lại tiếp tục cho Hoa nhiều vì cây được trẻ hóa,
lưu ý đây là loài cây ưa ấm, háu ăn nhưng chúng ta phải trồng bằng những giá thế thật
xốp thoáng giàu chất hữu cơ.
- Tránh đặt chậu cây nơi có gió lớn, cây hoa dễ bị tốn thương.
Khi cây già cỗi có biểu hiện lá nhỏ,cành gầy, sắc hoa không thắm, cần bổ xung thêm
phân giàu đạm (có thế dùng nước giải pha loãng) và tống hợp dinh dưỡng vi lượng
- Tưới nước thường xuyên, vừa đủ. Trời ẩm không tưới hoặc tưới ít, trời hanh khô
tưới nhiều hơn:

16. 9
Kiếm tra độ ấm bằng cách:
Dùng que tre nhỏ cắm sâu vào giữa bầu đất:
Que ướt: Thừa nước Que
se ẩm: Đủ nước Que sáng
màu: Thiếu nước [18].
1.2. Sơ lược về nhân giống ỉn vitro
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính
toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902), nhà thực vật học người
Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi
gặp điều kiện thích họp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể
hoàn chỉnh [8].
Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh
từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương
mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây
với hệ số nhân giống vô cùng lớn [12]
Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuật điều
khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân
tạo và vô trùng) [4], [6].
1.2.2. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam
Ở Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong khoảng năm 1977
ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay có rất nhiều phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô ở các Trường Đại học, các Viện nghiên cứu, các Sở khoa học và Công nghệ
ở các Tỉnh, Thành phố. Đà Lạt là nơi có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tư nhân
phục vụ cho công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ [7].
1.2.3. Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô
Đen nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử

17. 10
nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều bào gồm những nhóm chất chính sau
đây:
1. Các loại muối khoáng
2. Nguồn carbon
3. Vitamin
4. Các chất điều khiển sinh trưởng
5. Các nhóm chất bổ sung
6. Chất độn [1].
Thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại
mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử
dụng cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn
sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy [3].
1.23.1. Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dung trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô và tế bào
thực vật được phân chia thành 2 nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng và nhóm
vi lượng.
• Các nguyên tố khoáng đa lượng.
Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức là trên 30mg/l.
Những nguyên tố đó là: N, s, p, K, Mg, Ca.
- Nito (N): Được sử dụng ở hai dạng NO3 và NH4 riêng 1'ẽ hoặc phối hợp với nhau.
- Lun huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4. Các dạng ion khác như SO3 hoặc
SO2 thường kém tác dụng, thậm chí còn độc.
- Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy cso nhu cầu về phospho rất cao.
Phospho là một trong thành phần cấu trúc phân tử acid nucleic. Ngoài ra khi phosphor ở
dạng H2P04~ và HP04
2-
còn tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của
môi trường trong quá trình nuôi cấy.
• Các nguyên tố khoáng vi lượng.
Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30ppm. Đó là Fe, B, Mn, I,

18. 11
Mo, Cu, Zn, Ni, Co
- Sat (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Fe thường tạo phức hợp với các
thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi phức hợp này thường mất khả năng giải
phóng Fe cho các nhu cầu trao đối chất trong tế bào. Tốt nhất là nên sử dụng Fe ở dạng
phức chelat với citrate hoặc với EDTA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid). Từ các phức
chất này, Fe được giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng.
- Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự do và DNA
tăng lên, nhưng lượng RNA và sinh tống hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào.
- Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực tế B
làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện hóa
mô sẹo mạnh, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh.
- Molypden (Mo): là ion đóng vai trò CO-factor trong hệ thống nitrat reductase, như
vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đối đạm trong tế bào thực vật [1].
1.23.2. Nguồn cacbon
Mô và tế bào thực vật nuôi cay in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù
ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sang nhân tạo và
lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon
hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là
saccharose. Nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%.
Tiếp đến là glucose và maltose cũng hay được đưa vào môi trường nuôi cấy. Các loại
đường khác như fructose, raffinose, lactose, galactose...cũng đã được thử nghiệm, nhưng
tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt [1].
1.2.3.3. Vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cay in vitro có khả năng tự tổng họp
được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do đó phải bổ sung thêm
từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B [1].
Vitamin thường được sử dụng nhất là Nicotinic acid, Pyridoxin (B6), Thiamin (Bl),
Myo- inositol [7].

19. 12
1.2.3.4. Các hồn hợp chât tự nhiên
• Nước dừa: kết quả phân tích thành phần của nước dừa từ non đến già của tulecke và
ctv (1961) cho thấy, trong nước dừa có: amino acid tự do, amino acid dạng liên kết, axit
hữu cơ, đường, RNA và DNA
• Dịch chiết mầm lúa mỳ (mạch nha): thành phần hóa học chưa được phân tích kỹ,
chủ yếu chứa một số đường, vitamin và một số chất có hoạt tính điều khiến sinh trưởng
[1].
ỉ.2.3.5. Các chất điều khiến sinh trưởng
• Auxin : Được gọi là hooc môn sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện,
chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào, nhưng cũng làm tăng phân bào. Có 4 loại auxin
thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là:
Indolylacetic acid (IAA) tồn tại tự nhiên
Naphthylacetic acid (NAA)
2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D)
Indolylbutyric acid (IBA)
Riêng IAA là auxin tự nhiên, còn lại NAA, IBA và 2,4-D là các auxin nhân tạo. Thường
thì các enzyme nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn do đặc điểm phân tử của chúng nên các
enzyme oxy hóa auxin (auxinoxidase) không có tác dụng.
• Cytokinin: lần đầu tiên được Skoog (khoảng 1950) phát hiện trong một thí nghiệm
chiết xuất acid nucleic bị sơ suất. 3 loại cytokynin chính thường được dùng trong nuôi cấy
mô là: kinetin, zeatin, BAP
Trong thực tiễn nuôi cấy mô, người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì
quá đắt, mà thường sử dụng kinetin hoặc một sản phẩm tổng họp nhân tạo là BAP. Hoạt
lực của BAP cao hon nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác
động của nhiệt độ cao [1 ].
1.2.3.6. Chất độn - thạch (Agar)
Là một loại polysaccharide thu được từ một số loại tảo (chủ yếu là tảo hồng

20. 13
Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam (Glacia spp.)
Được sử dụng làm chất đệm cho môi trường dinh dưỡng rắn lại. ở 80C thạch ngậm
nước chuyển sang trạng thái sol và ở 40C trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của
thạch là 6-12 thạch/1 lít nước [1].
1.2.3.7. Nước
Nước pha môi trường cấy phải là loại nước hoàn toàn sạch ion. Thông thường người ta sử
dụng nước cất 2 lần và tốt nhất là sử dụng hệ thống cất nước thủy tinh [1].
1.2.3.8. Độ pH của môi trường
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất
dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. VI vậy đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối
với từng trường hợp cụ thể của loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định
ban đầu.
Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5-6,0. Sau 4 tuần nuôi cấy
đạt được 6,0-6,5.
Những thí nghiệm nuối cấy tế bào đơn hay tế bào trần trọng lượng môi trường nhỏ thì
việc chỉnh độ ph bắt buộc [1].
1.3. Các nghiên cửu về nhân giống ỉn vỉtro cây Dã yên thảo.
- Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv.(1999) cho thấy các đoạn thân và lá
của chồi non đang tăng trưởng trong điều kiện ỉn vỉtro được nuôi cấy trên môi trường MS
có BA hoặc BA và NAA. Ket quả được ghi nhận trên giống hoa kép và hoa đơn sau 10
ngày nuôi cấy. Tỷ lệ (%) thành lập chồi cao nhất từ mẫu cấy lá được ghi nhận trên môi
trường MS có 0,5 xM BA đối với giống hoa kép và 2 ỊLiM BA đối với hoa đơn. Chồi
được tái tạo từ lóng thân của cả hai giống trên môi trường MS bổ sung 0,5 ỊLiM BA và
0,05 ịxM NAA. Việc bổ sung nước dừa 5% kích thích cho sự kéo dài chồi non. Cây con
có bộ rễ khỏe mạnh được trồng thủy canh trong Vi MS trong 7- 10 ngày trước khi ra vườn
ươm.
- Theo Kedong (2001) môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/1 cũng rất thích họp cho

21. 14
sự tái sinh chồi từ lá của cây hoa dã yên thảo.
- Ket quả nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Minh Tâm (2005) đã cho thấy môi trường tốt
nhất để nhân giống dã yên thảo gồm có: nước cá, nồng độ đường 50 g/1 và auxin được
chọn là NAA. Điều kiện thuần dưỡng có tỉ lệ sống cao nhất là trùm bọc nilon kín trong
vòng 1 tuần.
- Theo kết quả nghiên cứu của Hassan và ctv.(2010) trong thí nghiệm nhân chồi thì số
chồi dã yên thảo trung bình cao nhất với môi trường bố sung BA 0,8mg/l và NAA 0,1
mg/1. Đối với thí nghiệm tái sinh chồi từ mẫu cấy lá của hoa dã yến thảo thì tỷ lệ chồi
được tái sinh là 45% đã được quan sát trong môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/1.
- Theo Trần Quốc Cường (2011), môi trường MS có bổ sung BA 2,0 mg/1 NAA 0,5
mg/1 cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá tốt là 88,9% và cho số chồi cao (4 chồi). Môi trường MS
có bố sung TDZ 0,2 mg/1 cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá đạt 100%, số chồi tái sinh cao nhất
với 9,9 chồi, chiều cao chồi cao nhất là 2,3 cm.

22. 15
Model & hãng sản xuất
GM612, Đức HM30G/TOA, Đức
HV - 110/HIRAYAMA, Nhật
31AG5D, Thái lan Trung Quốc AV
- 110/TELSTAR CP224S, Đức
Pháp
UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức
ARE/VELP, Italia
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thòi gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 7/2014 đến tháng 4/2015 tại Phòng thí nghiệm
Sinh lí thực vật, Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa
học và Chuyển giao Công nghệ và Phòng thực vật học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2.
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cún
2.2.1.Đối tượng nghiên cứu
Mau cây Dã yên thảo (petunia hybrỉda) thu ngoài tự nhiên, khi đỉnh sinh trưởng cao
khoảng 6-8cm tiến hành thu mẫu cho nghiên cứu nuôi cấy mô tại phòng Sinh lí thực vật -
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2.2.Thiết bi và dung cu
ỉ • o •
Các thiết bi:
Tên thiết bị
Cân kĩ thuật Máy đo pH Nồi hấp khử
trùng Tủ lạnh Hitachi Máy cất nước
hai lần Buồng cấy vô trùng Cân phân
tích Micropipet Jinson (Các loại 200 -
1000|jl)
Tủ ấm
Máy khuấy từ gia nhiệt

23. 16
Dung cu: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50 ml, 15 ml,...),
nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo,...
2.2.3. Môi trường nuôi cấy.
Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962):
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng: BAP, NAA (mg/l).
Các thành phần khác:
Đường saccarose: 30 g/1
Thành phần Nồng độ (mg/1)
Khoáng đa lượng NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2.2H20 440
MgS04.7H20 370
KH2PO4 170
Khoáng vi lượng MnS04.4H20 23,3
ZnS04.7H20 8,6
H3PO3 6,2
KI 0,83
Na2Mo04.2H20 0,25
CuS04.5H20 0,025
CoC12.6H20 0,025
Sắt EDTA Na2.EDTA 37,3
FeS04.7H20 27,8
Vitamin Myo-Inositol 100
Thiamin (BỊ) 0,5
Nicotinic acid 0,5
Pyridoxine (B6) 0,5
Glycine 2

24. 17
Agar: 8 g/1
Môi trường được điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng NaOH IN và HC1 IN) trước
khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 117°c, latm trong 15 phút (đối với các dụng
cụ thí nghiệm, dụng cụ thủy tinh không chứa môi trường thì khử trùng ở 121°c, latm
trong 15 phút).
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối Nhiệt
độ: 25 ± 2° c Độ ẩm: 50 - 60 %
Cường độ ánh sáng: 2000 lux.
2.3. Phương pháp nghiên cún
2.3.1. Bố trí thỉ nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được nhắc lại 3 lần,
50 mẫu/công thức.
2.3.2. Nội dung nghiên cửu
2.3.2.1. Thí nghiêm 1: Tao vât liêu in vitro từ chồi cây hoa Dã yên thảo.
o • • • • %} 1/
Chồi cây hoa Dã yên thảo được cắt dài khoảng 3-4 cm, cắt bỏ lá non, xử lý sơ bộ
bằng cách: Rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước máy, sau đó rửa trong dung dịch nước xà
phòng và được rửa lại bằng nước cất 2-3 lần, đưa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng:
- Rửa chồi bằng nước cất vô trùng.
- Lắc etanol 70% (v/v) trong 2 phút.
- Rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng.
- Lắc mẫu bằng hóa chất khử trùng với nồng độ và thời gian theo thí nghiệm.
- Rửa lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng.
Chồi cây hoa Dã yên thảo đã khử trùng sơ bộ được sử dụng làm nguyên liệu cho thí
nghiệm này theo các công thức bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử
trùng

25. 18
Mau cấy sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ được cắt bỏ bề mặt tiếp xúc với
chất khử trùng, vì các tế bào ở bề mặt tiếp xúc dưới tác dụng của chất khử trùng mạnh dễ
bị chết. Để đảm bảo cho chồi có thể hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường thì thao tác
này rất quan trọng. Sau khi cắt tiến hành thấm khô mẫu, cấy vào bình tam giác có chứa
môi trường MS cơ bản. Đặt mẫu lên giàn nuôi cấy theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu
sạch, tỷ lệ mẫu sống sau 7 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%): (Tổng số mẫu nhiễm / Tổng số mẫu cấy
vào)xl00
- Tỷ lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy vào)xl00
- Tỷ lệ mẫu chết (%): (Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu cấy vào)xl00
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi ỉn
vỉtro.
Trong thí nghiêm này chúng tôi sử dụng BAP và Kinetin là 2 chất điều hoà sinh trưởng
thực vật thuộc nhóm Cytokinin đế tìm hiếu ảnh hưởng của chúng đến khả năng tạo cụm
chồi in vỉtro cây hoa Dã yên thảo.
Chúng tôi bổ sung BAP với nồng độ thay đổi từ 0 - 1 mg/1 và kinetin nồng độ 0,3mg/l,
0,5mg/l vào môi trường MS để tiến hành thí nghiệm. Các mẫu sạch ở thì nghiệm 1 được
chuyển sang môi trường có bổ sung BAP và Kinetin và theo dõi theo từng tuần.
Công thức Chât xử lý/thòi gian
ĐC Xử lý sơ bộ
TI Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/5 phút
T2 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/l 0 phút
T3 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/12 phút
T4 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/15 phút
T5 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/3 phút
T6 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/5 phút
T7 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/7 phút

26. 19
a) Thí nghiệm 2a: Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Dã yên thảo
in vitro.
b) Thí nghiệm 2b: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên
thảo
Bảng 2.2. Ảnh hưỏìig của 6AP và Kinetỉn đến khả năng tạo cụm chồi cây
Các chồi phát sinh sau khi thực hiện thí nghiệm 2 có kích thước 2-3 cm được đưa vào
các môi trường có bố sung a-NAA hoặc có bố sung nước dừa với nồng độ khác nhau,
nhằm xác định nồng độ a-NAA và nước dừa thích họp cho quá trình tạo rễ và tạo cây con
khỏe mạnh. Nồng độ a-NAA thay đối từ 0,1 - 0,5mg/l, nồng độ nước dừa thay đối từ 5%
- 15%, các chồi sau khi cấy vào được theo dõi theo từng tuần.
Bảng 2.3. Ảnh hương của a-NAA và nước dừa đến tạo rễ cây Dã yên
Dã yên thảo
Công thức Thành phần môi trường
CT1 MS (Đối chứng)
CT2 MS + 0,5 mg/1 BAP
CT3 MS + 0,7 mg/1 BAP
CT4 MS+ 1,0 mg/1 BAP
CT5 MS + 0,3 mg/1 Kinetin
CT6 MS + 0,5 mg/1 Kinetin
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi = X chồi tạo thành
/ X chồi đưa vào 2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo rê cây Dã
yên thảo in vitro

27. 20
Chỉ tiêu theo dõi:
- Công thức nào tạo rễ (+) và công thức nào không tạo rễ (-) sau 4 tuần nuôi cấy.
- Chiều dài trung bình rễ (cm), số rễ/chồi sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.2.4. Thí nghiệm 4: Rèn luyện cây Dã yên thảo ỉn vỉtro ngoài môi trường tự nhiên
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng cây ỉn vỉtro đã hoàn chỉnh có đủ rễ, thân, lá
để làm thí nghiệm.
Đe cho cây ra ngoài tự nhiên cần có túi bầu, giá thế thích hợp, cây ở ống nghiệm lấy
ra nhẹ nhàng tránh làm gãy, rửa sạch thạch còn bám ở rễ cây không rũ tránh làm đứt rễ.
Vì hệ rễ của cây còn yếu và chưa thích nghi với
việc hút nước, muối khoáng từ đất lên khi cho cây ra ngoài chúng tôi sử dụng giá thể
xốp như bảng 2.4.
thảo in vitro
Công thức Thành phân môi trường
CT1 MS (Đôi chứng)
CT2 MS + 0,1 mg/1 NAA
CT3 MS + 0,3 mg/1 NAA
CT4 MS + 0,5 mg/1 NAA
CT5 MS + 5% nước dừa
CT6 MS + 10% nước dừa
CT7 MS + 15% nước dừa
Bảng 2.4. Ánh hưởng của giá thể tới tỷ lệ sống của Dã yên thảo
Giá thê Sô cây cây
Cát âm 20
Đât thịt + cát + mùn cưa 20
Tro trâu + sơ dừa +đât thịt +cát 20

28. 21
Chỉ tiêu theo dõi là số cây chết và số cây sống sau 4 tuần.
Tỷ lệ sống của cây = ( X cây sống / X cây cấy ) X 100
2.3.2. Phương pháp phân tích số liệu
Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng chương trình Excel 2007 theo mô
tả của Nguyễn Văn Mã và ctv, 2013 [5].
CHƯƠNG 3: KẾT QƯẲ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ chồi cây hoa Dã yên thảo
Môi trường nuôi cấy mô thực vật (trong đó có môi trường MS) là môi trường
thích họp cho nấm mốc và vi khuấn phát triển. Khi môi trường bị nhiễm mốc thì cây
in vỉtro sẽ không sạch bệnh, cây giống ra ngoài môi trường sau này cũng không bằng
cây ngoài tự nhiên, như vậy thì nuôi cấy mô sẽ vô nghĩa. Còn khi môi trường bị
nhiễm khuẩn thì cây ỉn vỉtro sẽ bị thối và chết, chính vì vậy mà thí nghiệm nuôi cấy
mô đòi hỏi mức độ vô trùng là tuyệt đối. Thí nghiệm 1 này có vai trò quyết định trong
nuôi cấy mô tế bào, nếu thí nghiệm không thành công thì sẽ không có mẫu vô trùng
để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Mục đích của thí nghiệm 1 là tìm ra công thức khử trùng tối ưu, vừa vô trùng mà
mẫu vẫn sống và sinh trưởng tốt. Công thức khử trùng này phụ thuộc vào nồng độ các
chất khử trùng, thời gian khử trùng, thao tác của người làm... Neu nồng độ các chất
khử trùng và thời gian khử trùng quá cao hoặc quá thấp thì khử trùng đều không cho
kết quả tốt, bên cạnh đó thao tác của người làm cũng rất quan trọng. Trong khi thực
hiện các thao tác người làm cần chú ý hạn chế cho tay ra khỏi buồng vô trùng, thường
xyên khử trùng tay bằng cách xịt cồn, khử trùng dụng cụ bằng cách đốt cồn. Ket quả
cần đạt được trong thí nghiệm này là tạo được vật liệu khởi đầu (mẫu đã vô trùng và
sống tốt) để làm nguyên liệu phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Xử lý sơ bộ đóng vai trò quan trọng tới sự thành công của quá trình tạo vật liệu
in vitro. Trong giai đoạn này, chúng tôi sử dụng etanol 70% để khử trùng sơ bộ, vì
etanol là chất lỏng, có sức căng bề mặt thấp, tạo điều kiện cho các chất khử trùng khác
có thể xâm nhập tốt hơn.

29. 22
Chồi Dã yên thảo sau khi xử lý sơ bộ được sử dụng làm nguyên liệu cho các
công thức khử trùng như bảng 2.1. Ket quả sau khi đánh giá được thể hiện trong bảng
3.1 và hình 3.1 như sau:
©
Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng đối vói chồi cây hoa Dã yên thảo
Công thức Tỷ lệ mẫu nhiễm
(%)
Tỷ lệ mâu chêt
(%)
Hiệu quả khử trùng
(%)
ĐC 100 0 0
TI 100 0 0
T2 46 24 30
T3 40 14 46
T4 18 28 54
T5 52 6 42
T6 10 32 58
T7 4 96 0
/
m í
/
a 1 ^
1
ỵ
■ I I I
ỵ
1 I I
■ ■
1 1 1
y
y
■ ■
■ I
ĐC T1 T2 Tỉ T4 15 T6 T7
Công thúc

30. 23
Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng
cây Dã yên thảo
Ket quả cho thấy, mẫu khử trùng ở các công thức ĐC và CT1 (Javen 5%/5 phút)
không cho hiệu quả khử trùng, mẫu khử trùng bị nhiễm khuẩn và mốc sau vài ngày
nuôi cấy. Còn CT7 (Javen 10%/7 phút) cũng không cho hiệu quả khử trùng vì thòi
gian khử trùng và nồng độ Javen cao làm chết các tế bào thực vật. Các công thức còn
lại cho hiệu quả khử trùng vẫn ở mức thấp, trong đó hiệu quả cao nhất là CT6 (Javen
10%/5 phút) đây được coi là công thức tối ưu vì nồng độ và thời gian khử trùng phù
hợp với cây. Các công thức: CT2(Javen 5%/10 phút), CT3(Javen5%/12 phút) Javen
cũng cho thấy hiệu quả khử trùng nhưng hiệu quả chưa cao. Vì nồng độ Javen thấp
khả năng diệt nấm mốc và khuẩn thấp lên tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn ở mức cao. Còn
CT4(Javen 5%Ị5 phút) tuy nồng độ Javen thấp nhưng vì thời gian khử trùng cao lên
số mẫu chết vẫn nhiều, CT5 (Javenl0%/3 phút) tuy nồng độ Javen cao nhưng vì thời
gian khử trùng ngắn lên số mẫu nhiễm vẫn cao, hiệu quả khử trùng vẫn thấp.
Hình 3.2. Chồi cây hoa Dã yên thảo. (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi
cấy, (Phải) mẫu ỉn vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy

32. 24
Bước 4. Khử trùng mẫu
Sơ đồ quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Dã
yên thảo ở hình 3.3.
Bước 1. Dã yên thảo
ngoài tự nhiên
Bước 2. Đỉnh sinh trưởng
sử dụng làm thí nghiệm
Bước 3. Rửa mâu với xà
phòng dưới vòi nước máy
Bước 5. Thâm khô, căt
mẫu
Bước 6. Mầu sau khử trùng
được cấy vào môi trường
Hình 3.3. Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của
cây Dã yên thảo

33. 25
3.2. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi in vỉtro