Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nhân trần Adenosma cearuleum R. Br..doc

Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TRƯƠNG THỊ HỒNG HẠNH
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI NHÂN
TRẦN (ADENOSMA CEARULEUM R. Br.)
PHÂN BỐ
TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH THÁI NGUYÊN
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thanh Hương
THÁI NGUYÊN -

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực chưa từng được công bố trong
một công trình khoa học nào khác.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2017
Tác giả luận văn
Trương Thị Hồng Hạnh
Xác nhận Xác nhận
Của BCN khoa Hóa học của cán bộ hướng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Thị Thanh Hương
i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ này, tôi xin bày tỏ lòng biết
ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, khoa Sau Đại học, Ban chủ
nhiệm khoa Hóa học trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều
kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Học viên
Trương Thị Hồng Hạnh
ii

MỤC LỤC
Trang
TRANG BÌA PHỤ .............................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii
MỤC LỤC........................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT............................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ................................................................vii
DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH ...................................................................viii
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài.....................................................................................3
3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................3
4. Phương pháp nghiên cứu............................................................................3
5. Dự kiến kết quả đạt được...........................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.............................................................................5
1.1. Tổng quan về chi Adenosma và loài Adenosma cearuleum R.Br...........5
1.1.1. Tổng quan về chi Adenosma (Họ Scrophulariaceae)...........................5
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài Adenosma cearuleum R. Br............................6
1.1.3. Đặc điểm thực vật loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.....................9
1.1.4. Đặc điểm thực vật loài Adenosma bracteosa Bonati.........................11
1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thuộc chi
Adenosma .....................................................................................................13
1.2.1. Nghiên cứu về loài Adenosma caeruleum R. Br................................13
1.2.2. Nghiên cứu về loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.........................15
1.2.3. Nghiên cứu về loài Adenosma bracteosa Bonati...............................16
1.3. Policosanol............................................................................................16
1.4. Hoạt tính sinh học của loài Adenosma cearuleum R. Br. .....................20
iii

1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Adenosma ở Việt Nam....21
1.5.1. Tác dụng dược lý của loài Adenosma cearuleum R. Br. ...................21
1.5.2. Tác dụng dược lý của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. ............23
1.5.3. Tác dụng dược lý của loài Adenosma bracteosum Bonati.................25
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ......................................................................26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................26
2.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................26
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................26
2.2.2. Thiết bị ...............................................................................................27
2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập được .......................................................................................27
2.3.1. Xử lý mẫu thực vật.............................................................................27
2.3.2. Chiết tách các chất .............................................................................28
2.3.3. Xác định cấu trúc các chất .................................................................28
2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa từ dịch chiết nước phần
thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô...................................28
2.4.1. Xác định khả năng ức chế peroxidation lipid (thử nghiệm MDA)....28
2.4.2. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH..................................28
2.4.3. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng ABTS..................................29
2.5. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ dịch chiết
nước phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô.................29
2.6. Thực nghiệm .........................................................................................29
2.6.1. Quá trình phân lập các chất từ phần thân của loài Adenosma
cearuleum R. Br. ..........................................................................................29
2.6.2. Dữ kiện phổ của các chất phân lập được ...........................................31
2.6.3. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid (thử nghiệm MDA) ......32
2.6.4. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH..................................33
2.6.5. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng ABTS..................................33
iv

2.6.6. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư ........................................34
2.7. Phương pháp xử lí số liệu .....................................................................34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................35
3.1. Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat phần thân của loài Adenosma
cearuleum R. Br. ..........................................................................................35
3.2. Xác định cấu trúc chất tách được..........................................................35
3.2.1. Chất AC2: α, β-dilinoleostearin.........................................................35
3.2.2. Chất AC5: 1-heptacosanol .................................................................40
3.2.3. Chất AC6: Axit triacontanoic ............................................................44
3.3. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa từ dịch chiết nước phần thân loài
Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô.........................................................47
3.3.1. Khả năng chống oxi hóa thông qua việc ức chế peroxy hóa lipid màng
tế bào (thử nghiệm MDA)............................................................................48
3.3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hóa thông qua phép thử trung hòa gốc
tự do của DPPH............................................................................................50
3.3.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng ABTS .................................51
3.3.4. Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư của dịch chiết
nước phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô.................52
3.3.5. Kết luận về hoạt tính của dịch chiết nước phần thân của loài
Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô.........................................................54
3.4. So sánh loài Adenosma cearuleum R. Br. (Nhân trần) với loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. (Bồ bồ)....................................................55
KẾT LUẬN.....................................................................................................60
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................62
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
VĂN ................................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................64
PHỤ LỤC........................................................................................................67
v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AC2 α, β-dilinoleostearin
AC5 1-heptacosanol
AC6 Axit triacontanoic
ABTS 2,2’
-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)
13
C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của nguyên tử 13
C
DEPT Phổ DEPT
DMSO Dimetylsulfoside
DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl
GC-MS Sắc ký khí khối phổ
1
H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của nguyên tử 1
H
LC-MS Phổ khối lượng
IC50 Nồng độ gây ra tác động sinh học cho 50% mẫu thử nghiệm
MDA Malonyl diandehit
ODC Mật độ quang học của dung môi
ODT Mật độ quang học của mẫu thử
SC50
Nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH
Nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của ABTS+
SKC Sắc ký cột
TCA Axit tricloaxetic
TBA Axit thiobarbituric
vi

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ
Trang
Bảng 3.1. Số liệu phổ 1
H- NMR của chất AC2..............................................37
C-NMR của chất AC2 và α, β-dilinoleostearin[18] . 38
H của chất AC5 .........................................................41
C-NMR của chất AC5..............................................42
H của chất AC6 và axit triacontanoic [26]................45
Bảng 3.6. Kết quả xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid màng tế bào .. 50
Bảng 3.7. Khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH.......................................51
Bảng 3.8. Hoạt tính chống oxi hóa bằng ABTS..............................................52
Bảng 3.9. Kết quả xác định khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư của
dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô ...54
Bảng 3.10: So sánh hợp chất thực nghiệm tìm ra ở dịch chiết loài Adenosma
cearuleum R. Br. và loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. ở huyện Đại Từ -
Thái Nguyên....................................................................................................58
Sơ đồ 1.1: Cơ chế điều hòa men của policosanol (GDL-5)............................19
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết, tách các chất từ phần thân của loài Adenosma
cearuleum R. Br. .............................................................................................30
vii

DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH
Hình 1.1. Thân, lá, hoa của loài Adenosma caeruleum R. Br...........................7
Hình 1.2. Bụi cây của loài Adenosma caeruleum R. Br ...................................7
Hình 1.3. Hoa của loài Adenosma caeruleum R. Br. ........................................7
Hình 1.4. Hình vẽ mô tả của loài Adenosma caeruleum R. Br.........................7
Hình 1.5. Hoa, thân, lá của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. ...................9
Hình 1.6. Hình vẽ mô tả của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr..................9
Hình 1.7. Hoa, thân, lá của loài Adenosma bracteosa Bonati ........................11
Hình 1.8. Các chất phân lập được từ dịch chiết clorofom của loài Adenosma
caeruleum R. Br. .............................................................................................14
Hình 1.9. Hợp chất phân lập được từ dịch chiết methanol của loài Adenosma
caeruleum R. Br. .............................................................................................14
Hình 1.10. Các rượu béo trong policosanol cô lập từ nguyên liệu thô ...........17
Hình 3.1. Phổ LC-MS của chất AC2...............................................................36
Hình 3.2. Phổ 1
H–NMR của chất AC2...........................................................37
Hình 3.3. Phổ 13
C-NMR của chất AC2..........................................................39
Hình 3.4. Phổ 13
C-NMR và DEPT của chất AC2 ..........................................39
Hình 3.5. Công thức cấu tạo của chất AC2.....................................................40
Hình 3.6. Phổ LC-MS của chất AC5...............................................................41
Hình 3.7. Phổ 1
H–NMR của chất AC5...........................................................42
Hình 3.8. Phổ 13
C-NMR của chất AC5..........................................................43
Hình 3.9. Phổ 13
C-NMR và DEPT của chất AC5 ..........................................43
Hình 3.10. Công thức cấu tạo của chất AC5...................................................44
Hình 3.11. Phổ LC-MS của chất AC6 ............................................................45
Hình 3.12. Phổ 1
H–NMR của chất AC6.........................................................46
Hình 3.13. Công thức cấu tạo của chất AC6...................................................46
Hình 3.14. Hoa, thân, lá của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. ...............56
Hình 3.15. Hoa, thân, lá của loài Adenosma cearuleum R. Br. ......................56
viii

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm có những
điều kiện về khí hậu như nhiệt độ, lượng mưa, ánh sáng... và hơn hết là điều kiện
thổ nhưỡng đặc trưng thích hợp cho nhiều loại thực vật có giá trị tồn tại và phát
triển. Theo thống kê sơ bộ, Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và
đa dạng trong đó có khoảng 12 000 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800
loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Đó là nguồn tài nguyên sinh học
quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được. Từ xa xưa đến nay, con người thường
khai thác nguồn tài nguyên này để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh, các vật liệu
cũng như nhiên liệu cho cuộc sống thường ngày.[3]
Ngày nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để
làm thuốc là một xu thế được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Theo kết quả
điều tra của Viện Dược Liệu Việt Nam cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất
phong phú với 3948 loài thực vật và nấm lớn có công dụng làm thuốc; trong đó
90% là cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng. Nguồn
cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới trên 20.000 tấn mỗi năm. Với nguồn tài
nguyên dược liệu phong phú, cùng với vốn kinh nghiệm của cộng đồng các dân
tộc Việt Nam chính là một nguồn tiềm năng để nghiên cứu, chiết xuất các hoạt
chất và tạo ra những loại thuốc mới có hiệu lực chữa bệnh cao.[1]
Nhân trần có tên khoa học Adenosma cearuleum R. Br.; thuộc chi
Adenosma là loài thường mọc hoang phổ biến ở các vùng trung du và miền núi
Việt Nam, dùng để làm thuốc và chế biến nước uống quen thuộc có tính chất bản
địa ở Việt Nam và nhiều nước châu Á từ bao đời nay. Qua các nghiên cứu khoa
học của y học hiện đại, dựa trên nguồn gốc là các bài thuốc dân gian lưu truyền
từ bao đời nay thì Adenosma cearuleum R. Br. có tác dụng làm tăng tiết và thúc
đẩy quá trình bài xuất dịch mật, bảo vệ tế bào gan, ngăn ngừa tình trạng gan
nhiễm mỡ, thúc đẩy tuần hoàn, giải nhiệt, giảm đau và chống viêm. Nó có
1

khả năng ức chế một số vi khuẩn như tụ cầu vàng, thương hàn, phó thương hàn,
mủ xanh, E.coli, lỵ, song cầu khuẩn gây viêm não, viêm phổi và một số loại
nấm[1], [3], cải thiện công năng miễn dịch và ức chế sự tăng sinh của tế bào ung
thư [6]. Trên lâm sàng, nhân trần đã được sử dụng để điều trị các bệnh: viêm gan
truyền nhiễm cấp tính thể vàng da, vàng da tán huyết do thương hàn
ở trẻ sơ sinh, giun chui ống mật, rối loạn lipid máu, thiểu năng mạch vành,
eczema dai dẳng ở trẻ em, viêm loét miệng, nấm da...[6]
Thái Nguyên là tỉnh nằm ở vùng Đông Bắc của Việt Nam, là trung tâm
kinh tế - xã hội lớn của khu vực đông bắc hay cả vùng trung du và miền núi
phía Bắc. Cách thành phố Thái Nguyên 25km về phía Tây Bắc là huyện Đại
Từ được bao bọc xung quanh bởi các dãy núi với nhiều sông ngòi, hồ, đập.
Huyện Đại Từ có lượng mưa lớn, khí hậu ẩm ướt với độ ẩm trung bình từ 70 -
80%, nhiệt độ trung bình hàng năm từ 22 - 270
, rất phù hợp cho nhiều loại cây
trồng, nhất là loài cây làm thuốc phát triển[29]. Với điều kiện khí hậu và tự
nhiên rất thuận lợi, huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên là địa bàn có sự phân bố
tự nhiên của chi Adenosma, tiềm tàng một nguồn lợi lớn, có thể từ đó tạo ra
nguồn nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh, bổ dưỡng có giá trị trong dân gian
mà nhân dân gọi là trà nhân trần. Từ lâu nhân dân huyện Đại Từ mới chỉ sử
dụng Adenosma cearuleum R. Br. trên địa bàn như một loài cây có tính thanh
nhiệt, giải độc mà chưa có nghiên cứu nào bài bản về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của loài Adenosma cearuleum R.Br. phân bố ở địa bàn
huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên. Căn cứ các lý do trên, chúng tôi đã lựa
chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
loài Nhân trần Adenosma cearuleum R. Br. phân bố trên địa bàn tỉnh
Thái Nguyên."
2

2. Mục tiêu của đề tài
- Khảo sát thành phần hóa học trong cặn chiết etyl axetat phần thân của
loài Adenosma cearuleum R. Br. phân bố trên địa bàn huyện Đại Từ - tỉnh
Thái Nguyên.
- Xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết nước phần thân của
loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô trong phép thử chống lipit hóa
màng tế bào, trong phép thử trung hòa gốc tự do của DPPH và trong phép thử
bằng ABTS.
- Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan
HepG2 của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br.
dạng khô.
- Định hướng về việc sử dụng các chế phẩm từ phần thân của loài
Adenosma cearuleum R. Br.
3. Nội dung nghiên cứu
- Thu thập và xử lý mẫu của loài Adenosma cearuleum R. Br. phân bố
trên địa bàn huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên.
- Bằng các phép phân tích hóa học xác định thành phần hóa học trong
cặn chiết etyl axetat phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. phân bố
trên địa bàn huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên.
- Bằng phép thử chống lipit hóa màng tế bào, phép thử trung hòa gốc tự
do của DPPH và phép thử bằng ABTS xác định hoạt tính chống oxi hóa của
dịch chiết nước phần thân loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô.
dạng khô.
4. Phương pháp nghiên cứu
- Xử lý mẫu thực vật và chiết mẫu bằng dung môi thích hợp để thu được
các dịch chiết nhằm nghiên cứu thành phần hóa học.
3

- Dịch chiết được tinh chế sơ bộ bằng cách chiết phân đoạn trong các
dung môi như n-hexan, etyl axetat...
- Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các chất chính nhằm khảo
sát thành phần hóa học của mẫu.
- Sử dụng các phương pháp phổ để xác định thành phần hóa học của mẫu.
- Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết nước phần thân của loài
dạng khô.
5. Dự kiến kết quả đạt được
- Thành phần hóa học trong cặn chiết etyl axetat phần thân của loài
Adenosma cearuleum R. Br. phân bố trên địa bàn huyện Đại Từ - tỉnh Thái
Nguyên.
- Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính gây độc tế bào trên dòng
tế bào ung thư gan HepG2 của dịch chiết nước của thân loài Adenosma
cearuleum R. Br. dạng khô.
4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Adenosma và loài Adenosma cearuleum R.Br.
1.1.1. Tổng quan về chi Adenosma (Họ Scrophulariaceae)
Chi Adenosma xuất phát từ chữ Hy Lạp Aden: tuyến và osmé: mùi thơm,
hương thơm. Chi Adenosma có khoảng 15 loài phân bố ở khu vực Bắc Á,
Đông Nam Á, Trung Quốc và quần đảo Thái Bình Dương [3], [13].
- Trung Quốc có bốn loài chính, phân bố tập trung ở các tỉnh Phúc Kiến,
Quảng Tây, Hải Nam, Quảng Đông, Vân Nam, Phúc Kiến, Giang Tây, Vân
Nam, gồm: Adenosma glutinosum (Linn.) Druce., Adenosma indianum (Lour.)
Merr., Adenosma javanicum (B1.) Merr., Adenosma retusilobum Tsoong [13].
- Ở Ấn Độ có ba loài chính gồm: Adenosma indianum (Lour.) Merr.,
Adenosma malabaricum Hook.f. Fl. Brit, Adenosma bilabiatum (Roxb.) Merr,
Adenosma caeruleum R. Br. [13].
- Ở Australia có hai loài gồm: Adenosma caerulea R. Br. (Adenosma
glutinosum), Adenosma muelleri Benth. (Adenosma bracteosum).
- Ở Siri Lanca có một loài phân bố ở Pasdon Corle là: Adenosma
subrepens Benth. Ex Hook. F [13].
Các nước Đông Nam Á là các nước có nhiều nhất và phân bố ở các quốc
gia như sau:
- Inđonesia có hai loài chính gồm: Adenosma caeruleum R. Br. và
- Philipin có ba loài gồm: Adenosma indianum (Lour.) Merr. (Adenosma
bilabiatum (Roxb.) (Merr), Adenosma caeruleum R. Br. [13].
- Thái Lan có hai loài gồm: Adenosma caeruleum R. Br. và Adenosma
indiana (Lour.) Merr. [13].
- Lào có ba loài gồm: Adenosma glutinosum (L.) Druce, Adenosma
bracteosa Bonati, Adenosma indiana (Lour.) Merr. [13].
5

- Campuchia có bốn
Adenosma caeruleum R.
javanicum (Bl) Merr. [13].
loài gồm: Adenosma indiana (Lour.) Merr., Br.,
Adenosma bracteosa Bonati, Adenosma
- Mianma có hai loài gồm: Adenosma indiana (Lour.) Merr., Adenosma
ovatum (Benth.) Hook.f. [13].
- Malaixia có một loài phân bố ở Malacca là Adenosma capitatum
Benth.Ex Hance. [13].
- Singapo chỉ có một loài là Adenosma inopinatum Prain. [13].
- Việt Nam là quốc gia có sự phân bố của chi Adenosma nhiều nhất trong
các nước châu Á, có bảy loài phân bố khắp các tỉnh từ Bắc vào Nam, phổ biến
nhất là 3 loài: Adenosma bracteosa Bonati, Adenosma indiana (Lour.) Merr.
và Adenosma caeruleum R. Br. [3].
Dưới đây chúng tôi sẽ trình bày tổng quan về một số loài thuộc chi
Adenosma đã được nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học cũng như ứng dụng trong y học.
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài Adenosma cearuleum R. Br.
1.1.2.1. Tên khoa học
Tên khoa học: Adenosma cearuleum R. Br.
Giới : Thực vật
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Lamiales
Họ: Hoa mõm chó (Scrophulariaceae)
Chi: Adenosma
Tên tiếng Việt: Nhân trần; Tuyến hương lam; Chè nội; Chè cát, Nhân trần
Việt Nam.
6

Tên khác: Adenosma caeruleum var. urticifolium Bonati, Adenosma
caeruleum var. racemosum Bonati, Adenosma glutinosum (L.) Druce var.,
Adenosma caeruleum (R. Br.) Tsoong, Adenosma cordifolium Bonati,;
1.1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố trong tự nhiên
Hình 1.1. Thân, lá, hoa của loài
Adenosma caeruleum R. Br.
Hình 1.2. Bụi cây của loài Adenosma
caeruleum R. Br
Hình 1.3. Hoa của loài Adenosma Hình 1.4. Hình vẽ mô tả của loài
caeruleum R. Br. Adenosma caeruleum R. Br.
Loài Adenosma cearuleum R. Br. là loài sống năm một. Cây thân cỏ cao từ
30 – 110 cm, thân tròn màu tím sẫm, trên thân có tuyến lông trắng mịn, cây có
khả năng phân cành nhiều. Lá mọc đối, hình trứng, đầu lá dài, mép lá có răng
cưa to, mặt trên và mặt dưới lá đều có nhiều lông mịn. Phiến lá dài từ 3 – 9 cm,
7

rộng từ 1 - 3,5 cm, có 7 đôi gân nổi rõ ở mặt dưới, cuống dài từ 5 - 10 mm. Hoa
màu tím, mọc đơn độc ở nách lá hay thành chùm ở đầu cành. Đài hình chuông xẻ
thành năm thùy sâu. Tràng hình ống màu tím-xanh dài từ 10 -14 mm, môi trên
hình lưỡi nhỏ, môi dưới xẻ thành 3 thùy đều nhau. Nhị dài 2 cm, bao phấn trước
với 1 ngăn hữu thụ, bao phấn sau có 2 ngăn hữu thụ. Bầu mang vòi nhụy có 2
thùy, vòi nhụy dài 2,2 cm. Quả nang hình trứng, dài bằng đài, nhiều hạt, hạt có
hình tam giác, 1 mặt lõm. Khi chín quả có màu nâu và tự tách ra, hạt nhỏ màu
nâu. Mùa hoa vào tháng 8 – 9. Mùa quả vào tháng 9 – 10. [1], [2], [3], [5]
Phân bố
Loài Adenosma caeruleum R. Br. là loài phát triển tốt ở nơi có khí hậu
nhiệt đới như Ấn Độ, Xri Lanca, Nam Trung Quốc, Campuchia, Lào, Việt
Nam, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia cho đến Ôxtrâylia...và là loài sống năm
một. Ở Việt Nam, loài Adenosma cearuleum R. Br. mọc ở khắp nơi từ Yên
Bái, Cao Bằng, Thái Nguyên vào tới Tây Ninh.
Thời gian gieo hạt của loài Adenosma caeruleum R. Br. bắt đầu từ cuối
tháng 2 sang tháng 3 khi cây được 6 lá đem trồng, sau khi trồng 5 - 6 tháng
cây bắt đầu ra hoa, kết hạt sau đó tàn lụi. Cây cũng có thể tái sinh nếu gặp
điều kiện thuận lợi, gốc cây có thể sống qua đông đến mùa xuân năm sau xuất
hiện các chồi mới. Nhiệt độ từ 15 - 30o
C là thích nghi cho cây sinh trưởng tốt,
nhiệt độ dưới 150
C cây phát triển kém. Là cây ưa sáng, không chịu được úng.
Những cây Adenosma caeruleum R. Br. mọc hoang dại trong rừng, độ khép
tán của rừng quá lớn, quá râm thì cây Adenosma caeruleum R. Br. mọc rậm
rạp, ít ra hoa kết quả, thậm chí không ra hoa kết quả. Còn cây Adenosma
caeruleum R. Br. mọc ở rìa rừng, ở đồi, ở ruộng, ánh sáng chiếu xuống tương
đối nhiều, cây tuy thấp nhưng đậu quả rất nhiều. Loài Adenosma caeruleum
R. Br. đòi hỏi nước rất nghiêm ngặt, lượng mưa hàng năm từ 1700
- 1800 mm, độ ẩm bình quân hàng năm trên 70% [1], [2].
8

Loài Adenosma caeruleum R. Br. không đòi hỏi đất đai tốt lắm, đất cát, đất
thịt đều có thể trồng được, tốt nhất là đất pha cát thoát nước tốt, giàu mùn, tơi
xốp, lớp đất dưới là đất thịt. Đất sét dễ úng nước, đất sỏi đá khô cằn, đất mặn,...
đều không nên trồng Adenosma caeruleum R. Br. Loài Adenosma caeruleum R.
Br. trước đây mọc hoang, sau đó nhân dân đưa về trồng ở các tỉnh vùng trung du
miền núi để khai thác các nguồn nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh, là thức uống
bổ dưỡng có giá trị trong dân gian nhân dân gọi là trà nhân trần[1], [2].
1.1.3. Đặc điểm thực vật loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Tên khoa học: Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Tên Việt Nam: Chè đồng, Chè nội, Chè cát, Nhân trần, Nhân trần hoa đầu,
Tuyến hương Ấn, Bồ bồ.
Tên khác: Manulea indiana Lour.; Stemodia capitata Benth.; Pterostigma
capitatum Benth.; Adenosma capitatum Benth. ex Hance; Adenosma
capitatum var. spicata Bonati; Erinus bilabiatus Roxb.; Adenosma bilabiatum
(Roxb.) Merr.; Adenosma buchneroides Bonati.
Đặc điểm thực vật
Hình 1.5. Hoa, thân, lá của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Hình 1.6. Hình vẽ mô tả của
loài Adenosma indiana (Lour.)
Merr.

9

Thân hình trụ, cành non mang nhiều lông về sau nhẵn, lúc đầu thân
màu xanh sau chuyển sang màu tím nhạt, chiều cao cây 70 cm - 100 cm. Lá
mọc đối, phiến lá hình mác, đầu nhọn, mép lá có răng cưa, gân lá hình lông
chim, mặt trên mang nhiều lông hơn mặt dưới, chiều dài lá 5 cm - 8 cm, rộng
lá 2 cm - 4 cm. Rễ thuộc loại rễ chùm, có nhiều lông tơ nhỏ màu trắng, rễ dài
10 - 18 cm. Hoa nhỏ, màu tím, mọc tụ tập thành đầu nang, đài có lông với hai
môi, môi trên nguyên, môi dưới xẻ bốn. Tràng cánh hợp với hai môi, môi trên
xẻ bốn, môi dưới nguyên, bốn nhị có hai chiếc dài, hai chiếc ngắn. Quả thuộc
loại quả nang nằm gọn trong đài hoa. Nhiều hạt nhỏ, hình trứng thuôn, có
nhiều gai, màu cánh gián. [3], [5]
Phân bố
Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. phân bố chủ yếu ở Xri Lanca, Ấn
Độ, Mianma, Nam Trung Quốc; ở Campuchia, Lào, Việt Nam, Thái Lan,
Malaixia, Inđônêxia và Philippin.
Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr là loài sống năm một và phát triển
tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới. Nhiệt độ từ 25-35o
C là thích nghi cho cây sinh
trưởng tốt, nhiệt độ thấp cây phát triển kém. Là loài ưa sáng, không chịu được
rét, không chịu được úng. Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. phát triển tốt
ở điều kiện độ ẩm cao, độ ẩm bình quân hàng năm 80-85% và ở độ cao từ
100–800 m so với mực nước biển.
Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. có phạm vi thích ứng về đất đaii
cũng khá rộng. Nhưng cây phát triển tốt nhất là ở vùng đất pha cát thoát nước
tốt, giàu mùn, tơi xốp, lớp đất dưới là đất thịt khi đó thân và lá của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. có màu xanh. Đất sét dễ úng nước, đất sỏi đá
khô cằn, đất mặn,... cây đều sinh trưởng, phát triển kém cây thường cằn cỗi,
thân và lá có màu tím. Cuối tháng 2 sang đầu tháng 3 cây bắt đầu mọc, mùa
hoa vào tháng 8- 9. Mùa quả vào tháng 9 – 10 sau đó tàn lụi.
10

Ở Việt Nam, loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. phân bố ở Thái
Nguyên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây vào tới Đồng
Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Bình Dương. Loài này thường được thấy ở ruộng,
các rừng thưa cây rụng lá, nơi trống có cát và cỏ, trong các đầm lầy và đất ẩm,
từ độ cao 1200m so với mặt nước biển. Cây ra hoa kết quả từ tháng 4 - 10. [3]
1.1.4. Đặc điểm thực vật loài Adenosma bracteosa Bonati
Tên khoa học: Adenosma bracteosa Bonati
Tên Việt Nam: Nhân trần tía, Nhân trần Tây Ninh, nhân trần cái, chè cát,
Nhân trần có lá bắc, tuyến hương lá hoa.
Đặc điểm thực vật
Hình 1.7. Hoa, thân, lá của loài
Adenosma bracteosa Bonati
Cây thảo, cao 30 - 40cm. Thân hình trụ, phân cành từ gốc, phần ngọn
có 4 cánh. Cành mọc tỏa ngang hay đứng thẳng. Lá mọc đối, hình mác thuôn,
dài khoảng 2cm, rộng 7mm, không cuống, gốc gần như ôm thân, nguyên hoặc
có răng cưa tròn, gân lá rõ.
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành bông dày đặc, dài 1,5 - 3cm, tổng bao
gồm những lá bắc dạng lá, hình tim, đầu nhọn, méo nguyên, có lông thô dạng
11

mi; đài có 5 răng không đều, 3 răng ngoài rộng, 2 răng trong hẹp; tràng có
ống hình trụ chia hai môi, môi trên bằng đầu, chia đôi; môi dưới dài bằng môi
trên chia 3 thùy gần bằng nhau; nhị có 1 ô, bầu nhẵn.
Quả nang, hình trứng thuôn, thắt lại ở đầu, nằm gọn trong đài tồn tại.
Mùa hoa quả: tháng 5 - 9. [3], [5]
Phân bố
Loài Adenosma bracteosa Bonati có phạm vi phân bố hạn chế, chỉ phát
hiện thấy ở vài tỉnh phía Nam như Tây Ninh, Bình Dương, khu vực Vũng
Tàu, đảo Phú Quốc và Côn Đảo. Có tài liệu ghi nhận ở cả Kon Tum, Đắc Lắc.
Cây cũng phân bố khá phổ biến ở Lào và Campuchia[1].
Loài Adenosma bracteosa Bonati chỉ gặp vào thời gian từ giữa mùa
mưa đến đầu mùa khô hàng năm. Cây ưa sáng, ưa ấm và có thể chịu được khô
hạn sau khi đã ra hoa, kết quả. Cây thường mọc thành đám, có khi tới hàng
ngàn mét vuông trên những bãi đất bằng dưới chân đồi, trong thung lũng hay
những đám ruộng cao mới bỏ hoang. Nơi mọc của loài Adenosma bracteosa
Bonati thường là đất pha cát và hơi chua. Ở những nơi đất bị rửa trôi mạnh,
nghèo dinh dưỡng, cây chỉ cao không quá 15cm đã thấy có hoa quả. Sau khi
quả già, toàn cây tàn lụi. So với các loài Adenosma indiana (Lour.) Merr và
Adenosma caeruleum R. Br. mọc ở các tỉnh phía Bắc thì loài Adenosma
bracteosa Bonati có vòng đời ngắn hơn, chỉ tồn tại 3 - 4 tháng và mức độ khai
thác, sử dụng cũng ít hơn. Do đó, nguồn trữ lượng của nó ở các tỉnh phía nam
chưa có nguy cơ bị suy giảm[1], [2], [3].
Tiểu kết: Với địa bàn khảo sát là huyện Đại Từ - Thái Nguyên có điều kiện
khí hậu và tự nhiên thuận lợi, chúng tôi chỉ thấy có 2 loài Adenosma
caeruleum R. Br. và Adenosma indiana (Lour.) Merr. được trồng phổ biến
trên huyện Đại Từ, trong đó loài Adenosma caeruleum R. Br. được trồng
nhiều ở một số nơi trong huyện như xã Tiên Hội, xã Ký Phú... và mọc hoang
ở vùng đồi, bờ ruộng của tất cả các vùng đất thích hợp trên địa bàn huyện.
12

1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thuộc
chi Adenosma
Ở Việt Nam chi Adenosma phổ biến nhất là ba loài: Adenosma
caeruleum R. Br., Adenosma indiana (Lour.) Merr. và Adenosma bracteosum
Bonati, dù được nhân dân dùng rộng rãi dưới dạng nước sắc để uống do có tác
dụng thanh nhiệt, lợi mật, tăng thải độc cho gan, các bệnh phụ nữ sau khi sinh
nhưng hiện nay, theo tra cứu số liệu của đĩa CD-Rom Từ điển các hợp chất
thiên nhiên (Dictionary of Natural Products) hầu hết các loài này đều chưa
được nghiên cứu nhiều về hóa học và hoạt tính sinh học cả ở Việt Nam và
trên thế giới. Cho đến nay ở trên thế giới và ở Việt Nam chỉ có một số công
trình khoa học công bố về thành phần hóa học của hai loài Adenosma
caeruleum R. Br. và Adenosma indiana (Lour.) Merr.
1.2.1. Nghiên cứu về loài Adenosma caeruleum R. Br.
Năm 1975, Lê Tùng Châu và cộng sự phân tích trong Adenosma
caeruleum R. Br. có saponin tritecpenic, flavonozit, axit nhân thơm, cumari
và tinh dầu. Cả cây có 1% tinh dầu, hoa có 1,86% tinh dầu tỷ trọng 0,8042
(250
) nD=1,4705 (200
) aD= +40
8 [3].
Năm 1992, GS. Trần Văn Sung cùng các cộng sự đã phân lập từ dịch
chiết cloroform của loài Adenosma caeruleum R. Br lúc ra hoa thu được các
chất sau: sitosterol, stigmasterol, campesterol, axit betulinic(1), monoterpen
peroxit (2), enon(3), phenol (4), arbutin (5) và aucubin (6) trong đó có
monoterpen peroxit là chất mới (Hình 1.7) [3], [6], [7].
13

O
OH
HO
(1)
OH
HO
O
OH
HO
HO O
OH
OH
(5)
(2) (3)
OH
OH HO
O
HO
O OH
OH
O
(6)
(4)
OH
O OH
O
OH
O
OH
(7)
Hình 1.8. Các chất phân lập được từ dịch chiết clorofom của loài Adenosma
caeruleum R. Br.
Năm 2009, cũng từ loài Adenosma cearuleum R. Br. được tìm thấy ở Vườn
quốc gia Tam Đảo – Vĩnh Phúc, nhóm nghiên cứu của GS. Phan Văn Kiệm đã
phân lập được một iridoid glycoside mới có tên là adenosmoside(7) (Hình
1.8),(Hình 1.9) cùng với phenylpropanoid đã biết và hai flavonoid là apigenin 7-
O-β-D-glucuronopyranoside và apigenin 7-O-Β-D-glucopyranoside từ chiết xuất
methanol của loài Adenosma caeruleum R. Br. [21].
Hình 1.9. Hợp chất phân lập được từ dịch chiết methanol của loài Adenosma
caeruleum R. Br.
14

Đến nay, vẫn chưa có công trình khoa học nào công bố về hoạt tính sinh
học của các chất, đặc biệt là các chất mới như monoterpen peroxide (2) hay
adenosmoside (7) …đã được phân lập từ chi Adenosma.
1.2.2. Nghiên cứu về loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Năm 1939, F. Guichard và J. Clemensat phân tích loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr. dưới định danh Nhân trần và thấy 1,67% kali nitrat, một saponin
có chỉ số bọt 2.600, một glucozit tan trong axeton, trong ete, không tan trong
nước, khoảng 0,7% tinh dầu [3].
Năm 1950, P.V. Nair và cộng sự đã cất được từ loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr. 1% tinh dầu và đã phân tích thấy có 5 l.monoterpen và 2
d.secquiterpen trong đó có 38,5% cineol. Ngoài ra còn thấy saponin,
tritecpenic, flavonoit, axit nhân thơm và cumarin. Toàn cây có 0,912 (200
)
nD=1,4768, D-44,920
[3].
Từ dịch chiết n-hexan và etyl axetat từ phần trên mặt đất của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. (với định danh Adenosma capitatum),
Nguyễn Minh Phương và cộng sự đã phân lập được ba flavon metoxy hoá:
4’,5-dihydroxy-3, 3’, 6, 7-tetrametoxy-flavon (chrysosplenetin), artemetin và
quercertin 3,3’,7-trimetyl ete[22].
Năm 1974 Lê Tùng Châu đã phân tích thấy trong tinh dầu của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. Việt Nam có: 22,6 % l. limonen, 11,6%
humulen, 33,5 % l. feneccho và 5,9 % cineol. Ngoài ra còn thấy saponin,
tritecpenic, flavonoit, axit nhân thơm và cumarin. Toàn cây có 0,8% tinh dầu,
lá 2,15%, hoa 0,82%, tỷ trọng 0,912 (200
), nD = 1,4768; D= 44,920
[3].
Năm 2010 Md. Nazrul Islam Bhuiyan, Farhana Akter, Jasim Uddin
howdhury và Jaripa Begum (Bangladesh) đã công bố kết quả nghiên cứu
thành phần hóa học của tinh dầu từ các bộ phận trên mặt đất của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. Tinh dầu loài Adenosma indiana (Lour.)
15

Merr. chứa 46 thành phần trong đó chủ yếu là: limonen (24,74%), fenchon
(21,59%), 2-caren (17,64%), α-caryophyllen 1,62%), γ-terpinen (3,04%), β-
bisabolen (2,80%), Fenchyl alcol (2,08%), phytol (1,89%), caryophyllen
(1,14%). [9]
Năm 2013 các tác giả Trung Quốc là Zhi Zeng, Chunyan Meng, Xuening
Ye và Zhuo Zeng, phân tích các thành phần dễ bay hơi của Adenosma
indianum (Lour.) Merr. bằng chưng cất hơi nước và sắc ký khí khối phổ (GC-
MS). Có tổng cộng 49 thành phần dễ bay hơi được xác định bằng phương
pháp GC-MS. Các thành phần dễ bay hơi lớn là: α-limonen (20,59-35,07%),
fenchon (15,79-31,81%), α-caryophyllen (6,98-10,32%), β-caryophyllen
(6,98-10,19%), piperitenon oxit, (1,96-11,63%), Caryophyllen oxit (1,15-
3,55%) [28].
1.2.3. Nghiên cứu về loài Adenosma bracteosa Bonati.
Nguyễn Viết Tựu và cộng sự phân tích thấy trong Adenosma bracteosum
Bonati có 0,25% tinh dầu, mầu vàng sẫm, tỷ trọng 0,890, chỉ số khúc xạ
1,496, sắc ký khí thấy 19 pic trong đó có 5 pic lớn cineol khoảng 18%. Ngoài
ra còn có flavonoit, hợp chất polyphenol và cumarin [3].
Thành phần hóa học của loài Adenosma bracteosum Bonati mới chỉ dừng
lại ở nghiên cứu về thành phần tinh dầu của loài này [27].
1.3. Policosanol
Năm 1991, Cruz - Bustillo và cộng sự đã có công trình nghiên cứu đầu
tiên về công dụng của Policosanol trong việc điều trị rối loạn mỡ máu[10].
Tuy nhiên, đến tháng 5/2001, sau khi có nhiều kết quả nghiên cứu chứng
minh nhóm thuốc điều trị rối loạn mỡ máu (như Statin) gây ra nhiều tác dụng
phụ đối với cơ thể con người thì policosanol trở nên phổ biến và là một trong
những phương pháp phòng ngừa và điều trị rối loạn mỡ máu hiệu quả ở các
nước phương Tây như Mỹ, Đức, Canada... và các nước thuộc khu vực Địa
Trung Hải [12], [20].
16

Policosanol được tạo ra thông qua việc thủy phân các este tinh chiết từ
sáp ong sau đó cô lập lại các thành phần cồn[19]. Các rượu béo trong
policosanol được cô lập từ nguyên liệu thô là 1-tetracosanol(1); 1-
hexacosanol(2); 1-heptacosanol(3); 1-octacosanol(4); 1-nonacosanol(5); 1-
triacontanol(6); 1-dotriacontanol(7); và 1-tetratriacontanol(8) mỗi loại có 24
đến 34C [14], [15], [19].
(1) C24H50O (2) C26H54O
(3) C27H56O (4) C28H58O
(5) C29H60O (6) C30H62O
(7) C32H66O (8) C34H70O
Hình 1.10. Các rượu béo trong policosanol cô lập từ nguyên liệu thô
Policosanol có nguồn gốc thiên nhiên đã được nhiều công trình nghiên
cứu trên thế giới khẳng định tính hiệu quả trong việc điều hòa Cholesterol,
kiểm soát mỡ máu. Policosanol giúp tăng hoạt hóa Receptor tế bào, giúp tế
bào sử dụng Cholesterol một cách hiệu quả, giữ các thành phần mỡ máu ở
mức cần thiết và có lợi cho cơ thể. Từ đó giúp điều hòa mỡ máu, hỗ trợ kiểm
soát tăng huyết áp và các bệnh tim mạch từ gốc [16], [19], [23], [24].
Policosanol là một hỗn hợp có trọng lượng phân tử cao, rượu béo nguyên
sinh, trong đó 1-octacosanol là thành phần chính (khoảng 60%). Policosanol
được phân lập từ sáp ong mía hoặc sáp ong, nhưng các nguồn này có thể có tỷ
17

lệ khác nhau của các thành phần policosanol. Octacosanol và các chất liên
quan cũng được tìm thấy trong dầu mầm lúa mì, dầu thực vật, cỏ linh lăng và
các sản phẩm từ động vật. [16], [25]
GDL-5 là tên gọi được cấp phép độc quyền cho nhóm hoạt chất
policosanol thiên nhiên được chiết xuất từ phấn mía Nam Mỹ. Với công nghệ
chiết xuất hiện đại giữ lại 5 thành phần quan trọng là Octacosanol,
triacosanol, Nonacosanol, Heptacosanol, hexacosanol có hiệu quả vượt trội
trong việc điều hòa Cholesterol và kiểm soát mỡ máu [20], [23]. Nghiên cứu
khoa học cho thấy GDL-5 khi được hấp thu vào cơ thể qua đường uống sẽ tác
động đồng thời vào 2 quá trình:
- Tác động cơ thể để tự điều chỉnh men HMG-CoA (3-hydroxy-3-
methylglutaryl coenzyme A) - loại men có tác dụng tổng hợp Cholesterol một
cách tự nhiên nhằm tự kiểm soát lượng Cholesterol nội sinh phù hợp với nhu
cầu của cơ thể. Cơ chế này an toàn vì không ức chế trực tiếp lên men HMG-
CoA [8], [24].
Hình 1.11: Công thức cấu tạo của men HMG-CoA (3-hydroxy-3-
methylglutaryl coenzyme A)
18

Acetyl - CoA
Acetoacetyl - CoA
GDL - 5 Hydroxymethylglutaryl - CoA
HMG - CoA reductase
Mevalonate
5-Pyrophosphomevalonate
Isopentenyl
pyrophosphate
Dimethylalyl
pyrophosphate
Cholesterol
Sơ đồ 1.1: Cơ chế điều hòa men của policosanol (GDL-5)
- Tăng cường khả năng tiếp nhận Cholesterol ở các cơ quan đích. Đó là
làm tăng sự hình thành các Receptor thụ thể Cholesterol LDL (Cholesterol
xấu - các Cholesterol có thành phần cấu tạo đặc biệt khiến nó không chịu tác
động của các quy luật trao đổi chất trong cơ thể do đó không phân giải được
và tồn đọng lại trong mạch máu, khi bị tích tụ sẽ gây nên các vấn đề làm tắc
nghẽn mạch máu) trên màng tế bào, giúp các Cholesterol LDL được hấp thụ
vào tế bào thông qua các Receptor này một cách hiệu quả nhằm sinh năng
lượng hình thành các hooc mon và sự chuyển hóa Cholesterol LDL thành
Cholesterol HDL (Cholesterol tốt - các khối cholesterol tuân thủ đúng theo
19

các cơ chế chuyển hóa và bài tiết của hệ tuần hoàn và tuyến gan – mật – thận
nên có thể được luân chuyển đến gan và xử lý triệt tiêu). Qua đó làm giảm
đáng kể số lượng Cholesterol LDL, tăng số lượng Cholesterol HDL trong
máu, kiểm soát các thành phần mỡ máu khác luôn nằm trong mức cần thiết và
có lợi cho cơ thể. Đây là cơ chế quan trọng giúp điều hòa các thành phần mỡ
máu, từ đó giảm thiểu và ngăn ngừa các biến chứng của bệnh cao huyết áp,
rối loạn mỡ máu gây ra. [23], [24]
Đặc biệt, khác với octocosanol được tổng hợp từ hóa chất, GDL-5 thiên
nhiên có tác động hiệu quả cao mà không gây tác dụng phụ khi sử dụng lâu
dài. Kết quả thực nghiệm lâm sàng tại Mỹ được tiến hành trên 30000 bệnh
nhân rối loạn mỡ máu theo nguyên tắc ngẫu nhiên mù, đôi, đa trung tâm đối
chứng với giả dược tại nhiều bệnh viên uy tín của Mỹ đã cho thấy sử dụng
Policosanol (GDL-5) từ 4 - 8 tuần giúp giảm Cholesterol toàn phần từ 13,9%,
giảm Cholesterol LDL từ 19,3%, giảm Triglyceride từ 14,1%, đồng thời làm
tăng Cholesterol HDL từ 18,4%. Nghiên cứu này cũng theo dõi 4 năm trên
30000 người và cho thấy hầu như không có bất cứ tác dụng phụ nào[23].
1.4. Hoạt tính sinh học của loài Adenosma cearuleum R. Br.
Thành phần hoá học của Nhân trần có các Flavonoid, hợp chất
polyphenol, phenollic, saponin, Coumarin, tinh dầu [3].
Tinh dầu chiếm 0,6% lượng chất khô trong cây. Thành phần chính gồm
Carvacrol 27%, Carvacrol methyl ethe 28% và β- bisabolen 34,4%. Đáng chú ý
là Carvacrol. Hợp chất này là dẫn xuất phenol có tác dụng kháng khuẩn mạnh
nhất trong thành phần của các loại tinh dầu thực vật đã biết hiện nay [3].
Theo sách thuốc cổ, nhân trần vị hơi đắng, tính hơi hàn; vào được bốn
đường kinh tỳ, vị, can và đờm; có công dụng thanh nhiệt lợi thấp, lợi mật
thoái hoàng được dùng để chữa các chứng hoàng đản, tiểu tiện bất lợi, viêm
loét da do phong thấp. [1], [3]
20

Theo y học hiện đại thì nhân trần có tác dụng làm tăng tiết và thúc đẩy quá
trình bài xuất dịch mật, bảo vệ tế bào gan, ngăn ngừa tình trạng gan nhiễm mỡ,
làm hạ huyết áp, thúc đẩy tuần hoàn, giải nhiệt, giảm đau và chống viêm. Nó có
khả năng ức chế một số vi khuẩn như tụ cầu vàng, thương hàn, phó thương hàn,
mủ xanh, E.coli, lỵ, song cầu khuẩn gây viêm não, viêm phổi và một số loại
nấm, cải thiện công năng miễn dịch và ức chế trực tiếp sự tăng sinh của tế bào
ung thư. Ngoài ra, nhân trần còn có tác dụng lợi niệu và bình suyễn [1], [2], [3].
Trong y học hiện đại, nhân trần đã được Bộ môn truyền nhiễm Trường đại
học Y khoa Hà Nội dùng điều trị thực nghiệm bệnh viêm gan do virus. Kết quả
cho thấy men gan của các bệnh nhân trở về mức bình thường, bệnh nhân hết mệt
mỏi, hết đau vùng gan, ăn ngon. Nhân trần có thể kết hợp với một số thảo dược
bổ gan khác để tăng tác dụng như: diệp hạ châu, cúc hoa…[3], [6]
Kết quả đã cho thấy men gan của các bệnh nhân đều trở về mức bình
thường, bệnh nhân hết mệt mỏi, hết đau vùng gan, ăn ngon [1], [2], [3].
Nhân trần có thể kết hợp với một số thảo dược bổ gan khác để tăng tác
dụng như: diệp hạ châu, cúc hoa…Các tác dụng trên đã được nghiên cứu và
ứng dụng thực tế để chữa bệnh trong y học cổ truyền từ rất lâu. [3], [6]
1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Adenosma ở Việt Nam
1.5.1. Tác dụng dược lý của loài Adenosma cearuleum R. Br.
Tên đông y là Nhân trần hoặc Nhân trần nam. Loại cây này được biết đến
không chỉ là một loại thức nước uống giải khát; mà còn là một vị thuốc được
dùng để chữa nhiều loại bệnh đem lại hiệu quả cao. Theo Đông y, nhân trần vị
hơi đắng, tính hơi hàn; vào được bốn đường kinh tỳ, vị, can và đởm. Có công
dụng thanh nhiệt lợi thấp, lợi mật thoái hoàng, được dùng để chữa các chứng
hoàng đản, tiểu tiện bất lợi, viêm loét da do phong thấp [3].
Theo y học hiện đại, loài Adenosma cearuleum R. Br. có tác dụng làm
tăng tiết và thúc đẩy quá trình bài xuất dịch mật. Thí nghiệm được tiến hành
trên chuột lang, thuốc được cho thẳng vào dạ dày rồi so sánh lượng dịch mật
21

và cặn khô của mật tiết ra trước và sau khi dùng thuốc. Kết quả thí nghiệm
cho thấy loài Adenosma cearuleum R. Br. với liều 10g/kg cân nặng có tác
dụng làm tăng tiết mật, lượng mật tiết ra sau khi chỉ dùng thuốc tăng
24,4%[3],[6]. Bên cạnh đó, loài Adenosma cearuleum R. Br. cũng làm tăng
chức năng thải trừ của gan. Thí nghiệm được tiến hành bằng cách dùng
nghiệm pháp BSP (Bromo sufophtalein) trên chuột lang. Cho chuột uống mẫu
thử 30 phút trước khi tiêm BSP. Sau khi tiêm BSP 15 phút, xác định lượng
thuốc còn lại trong cơ thể, từ đó suy ra lượng BSP đã thải trừ. Kết quả cho
thấy loài Adenosma cearuleum R. Br. với liều 10g/kg cân nặng làm tăng chức
năng thải trừ của gan đến 187,5% so với lô đối chứng [3], [6]. Tuy nhiên khi
so sánh tác dụng lên gan, mật của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. và
loài Adenosma caeruleum R. Br. thì tác dụng của loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr. mạnh hơn.[3]
Loài Adenosma caeruleum R. Br. cũng có tác dụng chống viêm. Trên mô
hình giai đoạn cấp tính của phản ứng viêm, gây phù bàn chân chuột cống
trắng bằng caolin, loài Adenosma caeruleum R. Br. có liều tác dụng ức chế
phù 50% là ED50 = 6,3g/kg. Trên mô hình viêm mạn gây u hạt bằng cách cấy
dưới da chuột cống trắng viên amian thì loài Adenosma caeruleum R. Br. có
liều ức chế 50% trọng lượng u hạt là ED50 = 25,5g/kg. Như vậy, loài
Adenosma caeruleum R. Br. có tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính,
mạnh hơn giai đoạn mãn tính. Ngoài ra, trên mô hình gây thu teo tuyến ức của
chuột cống trắng còn non, loài Adenosma caeruleum R. Br. với liều dùng
15g/kg có tác dụng gây thu teo tuyến ức đạt 31,4%. Đem so sánh với loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr., loài Adenosma caeruleum R. Br. có tác
dụng chống viêm tương đương ở mô hình phù caolin và teo tuyến ức nhưng
đối với mô hình u hạt thì loài Adenosma caeruleum R. Br. chưa bằng 1/2 của
loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. Trên phù caolin với liều 15g/kg thể
trọng thì ức chế phù của loài Adenosma caeruleum R. Br. lại giảm [3].
22

Bằng phương pháp khuếch tán thuốc trong môi trường nuôi cấy, dịch loài
Adenosma caeruleum R. Br. có nồng độ 1:1, tác dụng ức chế vi khuẩn được
biểu thị bằng đường kính vòng vô khuẩn do thuốc gây nên. Theo kết quả sau:
Shigella dysenteriae - 16,27mm; Shigella shigae - 15,00mm; Shigella sonnei -
11,92mm; Streptococcus hemolyticus - 24,08mm; Staphylococcus aureus -
17,58mm; Diplococcus pneumoniace - 15,75mm; Enterococus - 11,55mm;
Bacillus subtilis - 11,00mm còn đối với Shigella Ilexneri không có tác dụng
ức chế. Từ kết quả trên cho thấy, tác dụng kháng khuẩn của loài Adenosma
caeruleum R. Br. kém hơn so với loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. nhất là
với trực khuẩn lỵ. Nhưng loài Adenosma caeruleum R. Br. ức chế mạnh hơn
với Staphyllococcus và Steptococcus [3].
Loài Adenosma caeruleum R. Br. tác dụng không rõ rệt lên tiết dịch vị:
không giảm loét dạ dày, không giảm tiết vị, có làm giảm axit tự do và axit toàn
phần tuy nhiên hai tác dụng này lại giảm khi dùng liều cao; không độc [3].
Ngoài ra, loài Adenosma caeruleum R. Br. còn có tác dụng diệt giun. Thí
nghiệm trên giun đũa của lợn (Ascaris summ) sơ bộ thấy loài Adenosma
caeruleum R. Br. có tác dụng tốt [3].
Loài Adenosma caeruleum R. Br. không độc, khi sử dụng với liều lượng
cao không gây độc. Khi thí nghiệm thử độc tính cấp trên chuột nhắt, uống với
liều cao gấp 20 lần liều thường dùng, chuột vẫn sống bình thường. Khi thử
độc tính bán mãn, thí nghiệm trên thỏ với liều dùng 10g/kg/ngày trong 4 tuần
liên tiếp, qua theo dõi kiểm tra các chỉ tiêu hồng bạch cầu, huyết sắc tố, ure
huyết, GOT (Glutamic Oxaloacetic Transaminase), GPT (Glutamic Pyruvic
Transaminase) và các xét nghiệm vi thể các cơ quan gan, thận, thượng thận
không phát hiện các hiện tượng nhiễm độc do thuốc [3].
1.5.2. Tác dụng dược lý của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Tên đông y còn gọi là Nhân trần đực, hay Nhân trần Bồ bồ. Năm 1939,
Guichard và Clemensat nghiên cứu tác dụng của nước cất loài Adenosma
23

indiana (Lour.) Merr. (ngâm tinh dầu với nước trong vài giờ) trên giun
Lombricus thì thấy ngay từ đầu con giun quằn quại trong vòng 10-15 phút.
Nước bão hòa tinh dầu có tác dụng mạnh hơn nước cất của loài Adenosma
indiana (Lour.) Merr. Đối với giun đũa (Ascaris) cũng có hiện tượng như trên
nhưng yếu hơn và con giun chỉ chết sau 2 đến 3 giờ. Đối với giun móc câu
con giun chết ngay sau 10 đến 15 phút. Thí nghiệm độ độc trên thỏ, với liều
cao hơn tinh dầu giun thường dùng cho người cũng không thấy hiện tượng
ngộ độc nào. Hai tác giả đã đi tới kết luận: Có thể dùng tinh dầu của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. làm thuốc tẩy giun [3].
Về tác dụng thông mật của hai loài Adenosma caeruleum R. Br. và
Adenosma indiana (Lour.) Merr. Việt Nam theo như kinh nghiệm dùng trong
dân gian. Năm 1957, Lê Tùng Châu (Viện dược liệu Hà Nội) và Nguyễn Viết
Tựu (PV dược liệu TP. Hồ Chí Minh) đã nghiên cứu tác dụng dược lý của loài
Adenosma caeruleum R. Br. và loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. và loài
Adenosma bracteosa Bonati đã có kết quả: loài Adenosma indiana (Lour.)
Merr làm tăng tiết mật rõ rệt ở cả 3 lô thí nghiệm (cao etanol 400
, cao nước và
tinh dầu). Tác dụng mạnh nhất ở cao etanol, tác dụng tăng thải độc của gan
chỉ có ở cao etanol và tinh dầu [3].
Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr có tác dụng kháng khuẩn trên nhiều
loại vi khuẩn mạnh nhất là trên 2 chủng trực khuẩn lỵ (Sh. Dyénteriae 111 và
Sh. Shigae 39) và 2 chủng cầu khuẩn (Staphylococcus aureus 109P và
Streptococcus hemolyticus S84). Tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất ở cao
etanol và cao nước, yếu ở tinh dầu.
Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. có tác dụng rõ rệt làm giảm tiết
dịch vị, giảm độ axit tự do và axit toàn phần của dịch vị, làm giảm loét dạ dày
của thực nghiệm.
Độc tính của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. không đáng kể, với
liều có tác dụng dược lý, dùng liên tục trong thời gian dài không thấy biểu
24

hiện nhiễm độc thuốc. Với liều cao hơn liều tác dụng 20 lần không làm súc
vật chết [3].
1.5.3. Tác dụng dược lý của loài Adenosma bracteosum Bonati.
Tên đông y là Nhân trần tía. Dịch chiết etanol 900
có độc tính cao hơn
dịch nước sắc loài Adenosma bracteosum Bonati. Khi thử độc tính cấp, loài
Adenosma bracteosum Bonati được chặt nhỏ, phơi khô, chiết với cồn 400
rồi
cô cách thủy đến dịch đậm đặc, cho chuột uống với liều lượng 300g/kg thể
trọng dịch chiết nước không thấy chuột lang chết. Làm tăng lượng tiết mật
trên chuột lang. Lượng mật tăng gần 25% so với lô đối chứng [3].
Bệnh viện Chợ Quán - Thành phố Hồ Chí Minh đã dùng loài Adenosma
bracteosum Bonati để chữa viêm gan virus trên lâm sàng. Kết quả là số bệnh
nhân khỏi hẳn là 24%, số bệnh nhân có chuyển biến khá và tốt là 46,6% [3].
So sánh đối chiếu thành phần hóa học với nhóm dược liệu chữa bệnh gan
như Artichoke, Sylybum marianum (cây kế)... có thể dự đoán thành phần hóa
học giúp chữa bệnh gan chủ yếu của loài Adenosma bracteosum Bonati là
nhóm flavonoid, axit nhân thơm. Các nhóm hydroxy phenolic trong những
hợp chất này làm tăng cường khả năng chống oxy hóa của tế bào gan. Mặt
khác các saponin có vai trò chính trong việc kích thích ăn uống, hỗ trợ tiêu
hóa [6].
25

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành khảo sát thực địa, thu thập thông tin, thu hái tiêu bản
bao gồm cả phần rễ, lá, thân, hoa của loài Adenosma cearuleum R. Br. tại địa bàn
các xã Tiên Hội, Ký Phú thuộc huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên vào thời điểm
cây phát triển trong năm là tháng 4 và 5 năm 2016. Mẫu tiêu bản được ghi vùng,
thời điểm, định danh và khẳng định loài bởi Tiến sĩ Thực vật học Nguyễn Thế
Anh - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.2.1. Hóa chất
2.2.1.1. Hóa chất dùng để phân lập các chất từ phần thân của loài Adenosma
cearuleum R. Br.
Sử dụng các dung môi n–hexan, etyl axetat để ngâm chiết mẫu.
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel
60 F254, Merck, có độ dày 0,2 mm.
Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 197–400 mesh (0,040 –
0,063 mm).
Sắc ký cột nhanh: sử dụng silicagel cỡ hạt 70–200 mesh.
Bản mỏng: được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng ngắn và dài
(254; 365 nm), sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanilin–H2SO4 (vanilin 1,2 g;
MeOH 200 ml; CH3COOH 25 ml; H2SO4 11 ml), hơ nóng trên bếp điện cho
đến khi các vệt trên bản mỏng hiện màu rõ nhất.
2.2.1.2. Hóa chất dùng để thử hoạt tính chống oxi hóa từ phần thân của loài
Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng từ 23-26g
Hoá chất: DPPH (Sigma) ; 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonate) hay ABTS (Sigma) ; Trolox (Sigma Aldrich), Axit Ascorbic
(Sigma Aldrich) ; Postassium persulphate (Scharlau), acetate buffer
26

(Scharlau) ; Dimetylsulfoside (DMSO) (Fisher Scientific) ; Đệm phosphat
hoặc Kali clorid 1,15% (KCl), Methanol, Axit tricloaxetic (TCA, Fisher), Axit
thiobarbituric (TBA) (Sigma Aldrich) ; FeSO4.7H2O, H2O2 ; DMSO (Fisher)
và các dung môi thông thường khác.
2.2.1.3. Hóa chất dùng để xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ phần
thân của loài Adenosma cearuleum R. Br.
Vật liệu và hóa chất: FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB
(Sigma) ; Chất tham khảo Elippticine và các hóa chất thông thường khác.
Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học
Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
2.2.2. Thiết bị
Máy cất quay chân không, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập
chất hữu cơ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance
500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS.
Đĩa 96 giếng, pipet, eppendorf và các thiết bị phụ trợ khác.
Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader.
Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELSA
96 giếng (Bio-rad).
2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập được
2.3.1. Xử lý mẫu thực vật
Mẫu thân cây Nhân trần được thu hái tại các xã Tiên Hội và Ký Phú
thuộc huyện Đại từ, tỉnh Thái Nguyên (tháng 4 - 5 năm 2016). Mẫu nguyên
liệu được rửa sạch, sau khi hong gió 3-4 giờ, xử lý diệt men mẫu bằng cách
27

hấp nguyên liệu bởi hơi etanol 700
trong 3-4 phút. Nguyên liệu sau diệt men
tiếp tục xử lý để có mẫu tươi.
Khi chiết mẫu tươi, phần thân mẫu sau khi diệt men sẽ chiết nước ngay.
2.3.2. Chiết tách các chất
Mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. được rửa sạch, hong
khô tự nhiên, sấy khô bằng thiết bị sấy thực vật ở nhiệt độ 40o
C, xay nhỏ và
ngâm chiết với metanol (4x24 giờ) ở nhiệt độ phòng. Quay cất dung môi dưới
áp suất giảm thu được cặn chiết metanol. Thêm 50 ml nước, khuấy đều và
chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat.
Sau đó lọc và gộp các dịch chiết của từng loại dung môi với nhau, quay cất
dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng.
Phân lập cặn chiết n-hexan và etyl axetat thu được bằng phương pháp sắc
ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp.
2.3.3. Xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương
pháp phổ hiện đại như phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) và phổ cộng
hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR, 13
C-NMR, DEPT).
2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa từ dịch chiết nước
phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô
2.4.1. Xác định khả năng ức chế peroxidation lipid (thử nghiệm MDA)
Được thực hiện theo phương pháp của Ngô Quốc Hận, Nguyễn Thị Thu
Hương (2011), Jelili A Badmus và đồng tác giả (2011) có sự thay đổi cho phù
hợp với các điều kiện của phòng thí nghiệm. Xác định khả năng ức chế
peroxy hoá lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl
dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào.
MDA có khả năng phản ứng với axit thiobarbituric để tạo thành phức hợp
trimethin (có màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm.
2.4.2. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH
Được tiến hành theo phương pháp của P. Yuvaraj và cộng sự.
28

2.4.3. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng ABTS
Được tiến hành theo phương pháp của Saeed N et al.
2.5. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ dịch chiết
nước phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. dạng khô
Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc
gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào
chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc
diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp
của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số
dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần
protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy
đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào
càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
2.6. Thực nghiệm
2.6.1. Quá trình phân lập các chất từ phần thân của loài Adenosma
cearuleum R. Br.
2.6.1.1. Chiết, tách mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br.
Quy trình chiết mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. (2,4
kg) được nêu trong sơ đồ 2.1.
Mẫu phần thân của loài Adenosma cearuleum R. Br. đã sấy khô, nghiền
nhỏ (2,4 kg) được ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (4 lần). Quay cất
dung môi dưới áp suất giảm, cặn thu được được thêm 50 ml nước. Sau đó,
được chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl
axetat (4 lần đối với mỗi loại dung môi). Cất loại dung môi dưới áp suất giảm
ở nhiệt độ 40o
C thu được các cặn chiết có khối lượng tương ứng là: 17,6 g cặn
chiết n–hexan và 26 g cặn chiết etyl axetat.
29

2.6.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat
Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng chúng tôi thấy dịch chiết etyl axetat khả
thi nên tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học trên dịch chiết etyl axetat.
Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat phần thân của loài
Adenosma cearuleum R. Br. được trình bày theo sơ đồ 2.1.
Mẫu phần thân loài
(2,4 kg)
1. Phơi khô, nghiền nhỏ
2. Ngâm chiết với MeOH
3. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm
trong máy cất quay chân không, loại metanol
Cặn MeOH
(50.0g)
Cặn EtOAc
(26g)
SKC silicagel: n-hexan: EtOAc,
lượng EtOAc 0-100%
Phân đoạn 2 Phân đoạn 7
Kết tinh với
CCl4 lạnh
Chất AC2 Chất AC5
(45 mg) (18mg)
Phân đoạn 13
SKC silicagel: n-
hexan: EtOAc (9: 1.5)
Chất AC6
(8.5 mg)
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết, tách các chất từ phần thân của loài
Dịch chiết etyl axetat được hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi
CH2Cl2/MeOH và trộn với 20 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền
thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch
chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.
30

Silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm; 200 g) được nhồi vào cột sắc ký
có kích thước 5cm x 27cm theo phương pháp nhồi ướt với dung môi ban đầu là
n-hexan 100%. Sau khi cột đã ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên
cột và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là n-hexan: EtOAc có độ phân cực tăng
dần (lượng EtOAc tăng dần từ 0→100%) thu được 35 phân đoạn khác nhau.
Phân đoạn thứ 2 của cột này (khi giải hấp với hệ dung môi n-hexane :
EtOAc = 10 : 0.5) thu được 45 mg chất AC2. Chất rắn xuất hiện ở phân đoạn
7 được rửa lại trong CCl4 lạnh thu được 18 mg chất AC5. Sắc kí lại phân
đoạn 13 trên cột silica gel (dung môi rửa giải: n-hexane : EtOAc (9 : 1.5) thu
được 8,5 mg chất AC6.
2.6.2. Dữ kiện phổ của các chất phân lập được
2.6.2.1. Chất AC2: α, β-dilinoleostearin
- Là dạng dầu, màu vàng, khối lượng 45 mg.
- ESI-MS m/z: 263.3 [C17H31CO]+
, 266.7 [C17H35CO]+
.
- 1
H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5.39-5.31 (8H, m, α, β-H9, H10, H12,
H13), 5.26 (1H, dt, J=5.5, 4.5 Hz, β-CH-O), 4.29 (2H, dd, J=12.0, 4.5 Hz, α-
CH2O), 4.14 (2H, dd, J=12.0, 5.5 Hz, α’-CH2O), 2.77 (4H, t, J=7.5 Hz, α, β-
H11), 2.32 và 2.31 (6H, 2хt, J=7.5 Hz, α, β, α’-H2), 0.88 và 0.92 (9H, 2хt,
J=7.0 Hz, α, β, α’-H18).
- 13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 173.28 (α’-C1), 173.24 (α-C1), 172.83
(β-C1), 130.23 (α, β-C13), 130.02 (α-C9), 129.99 (β-C9), 128.10 (β-C10),
128.09 (α-C10), 127.92 (α-C12), 127.91 (β-C12), 68.92 (β-CH-O), 62.12
(α,α’-CH2O), 34.21 (β-C2), 34.07 (α’-C2), 34.04 (α-C2), 31.93 (α’-C16),
31.54 (α, β-C16), 29.78, 29.71, 29.67, 29.63, 29.53, 29.49, 29.35, 29.28,
29.20, 29.18, 29.13, 29.10, 29.06, 27.21, 25.65 (α, β-C11), 24.89, 24.85,
22.69 (α’-C17), 22.57 (α, β-C17), 14.10 (α’-C18), 14.06 (α, β-C18).
31

2.6.2.2. Chất AC5: 1-heptacosanol
- Là chất rắn, màu trắng, khối lượng 18 mg.
- ESI-MS m/z: 397.2 [M+H]+
.
- 1
H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 3.64 (2H, t, J = 6.5 Hz, H-1), 1.59-1.54
(4H, m, H-2 và H-3), 1.25 (s, H-4-26), 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-27).
- 13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 63.1 (C-1), 32.8 (C-2), 31.9 (C-3),
29.7-22.7 (C-4-26), 14.1 (C-27).
2.6.2.3. Chất AC6:Axit triacontanoic
- Là chất rắn, khối lượng 8,5 mg.
- ESI-MS m/z: 453.4 [M+H]+
.
- 1
H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 2.28 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2), 1.59 –
1.53 (2H, m, H-3), 1.18 (52H, s, H-4 - H-29), 0.81 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-30).
2.6.3. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid (thử nghiệm MDA)
Được thực hiện trên não chuột với chất đối chứng tham khảo là Trolox
(Sigma Aldrich), đồng phân của vitamin E. Cụ thể như sau:
- Mẫu thử được pha ở các nồng độ: 10000 µg/ml, 2000 µg/ml, 400
µg/ml, 80 µg/ml, 16 µg/ml, 3.2 µg/ml (mẫu pha trong nước khử ion).
- Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat
(pH=7.4) theo tỷ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-4o
C.
- Lấy 1ml dịch đồng thể thêm vào 0.1ml mẫu thử ở các nồng độ hoặc
chất đối chứng tham khảo Trolox và 0.8ml đệm phosphat thêm 0.1ml hệ
- Ủ hỗn hợp ở 37o
C trong 15 phút.
- Dừng phản ứng bằng 1 ml axit tricloaxetic 10%.
- Ly tâm 12000 vòng trong 5 phút.
- Lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml axit thiobarbituric 0,8% (theo tỉ lệ 2:1).
- Ủ ở nhiệt độ 100o
C 15 phút.
- Làm lạnh và tiến hành đo ở bước sóng λ = 532 nm.
32

- Trolox (Sigma Aldrich), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm
chất đối chứng tham khảo.
2.6.4. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH
Mẫu thử được pha stock trong DMSO. Sau đó được pha thành dải nồng
độ thích hợp với nước cất khử ion. Axit ascorbic (đối chứng tham khảo) được
pha thành dải nồng độ 200; 40; 8; 1.6g/ml với nước cất khử ion.
- DPPH pha trong metanol (100%) nồng độ 0.25M.
- Hút mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào ống thủy tinh, thêm dung dịch
DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các ống đã có sẵn mẫu nghiên cứu (theo tỉ lệ 1:1).
- Ống không có mẫu thử chỉ có DPPH và nước khử ion (thí nghiệm được
lặp lại 3 lần).
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng λ = 517nm.
Vì mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được đưa vào ống theo tỷ lệ 1:1 nên
nồng độ mẫu nghiên cứu trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa, nồng độ axit
ascorbic (VitC) trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa còn 100; 20; 4; 0.8g/ml.
Ống không có mẫu thử chỉ có DPPH và nước khử ion được xem là giếng
đối chứng. Ống có sử dụng Axit ascorbic và DPPH là chất đối chứng tham khảo.
2.6.5. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng ABTS
- Pha mẫu thành các nồng độ thích hợp trong nước khử ion giống như thí
nghiệm MDA. Trolox (đối chứng tham khảo) được pha thành dải nồng độ
giống như thí nghiệm MDA.
- Trộn ABTS (7mM) và postassium persulphate (2.45mM) để trong tối
16 giờ ở nhiệt độ phòng. Trước khi thí nghiệm ABTS+
được pha loãng trong
acetate buffer sao cho giá trị OD là 0,70 ± 0,02 ở bước sóng λ = 734nm. Sau
đó, 1900l ABTS+
được thêm vào 100l mẫu đã pha ở trên.
- Đọc kết quả ở bước sóng λ = 734nm.
33

2.6.6. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Phép thử được thực hiện trong các điều kiện cụ thể như sau:
- 100l chất thử được cân và pha trong DMSO với tỉ lệ 1:1 để được nồng
độ gốc là 500 mg/ml. Sau đó pha chất thử thành các dải nồng độ thích hợp.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng
đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào
đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất
thử trong giếng là 10000g/ml; 2000g/ml; 400g/ml; 80g/ml và 16g/ml.
- Ủ trong tủ ấm 48 giờ.
- Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (180l) sẽ được sử dụng làm
đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định
bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng
SRB trong 30 phút ở 37o
C, rửa 3 lần bằng axit axetic rồi để khô ở nhiệt độ phòng..
- 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút.
- Đọc kết quả OD ở bước sóng λ = 515-540 nm trên máy ELISA Plate
Reader (Bio-Rad).
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các
nồng độ 10g/ml; 2g/ml; 0.4g/ml; 0.08g/ml được sử dụng như là chất
đối chứng dương.
2.7. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lí trên hệ thống Excel và GraphPad Prism.
34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nhân trần Adenosma cearuleum R. Br..doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nhân trần Adenosma cearuleum R. Br..doc

Similar to Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nhân trần Adenosma cearuleum R. Br..doc (20)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (19)

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nhân trần Adenosma cearuleum R. Br..doc