Teknik RP-HPLC untuk Analisis Protein sebagai Tugas Mata kuliah Bioanalisis

1. Teknik RP-HPLC untuk pemisahan protein
Hasib Habibie, 1208105033 Bioanalisis

2. Kromatografi
 Prinsip & teori dasar Kromatografi
 Kromatografi Cair untuk Bioanalisis
 Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography (Marie-
Isabel Aguilar)

3. Prinsip dan teori dasar
kromatografi
Kimia Bioanalisis

4. Prinsip Kromatografi
• Awalnya ditemukan oleh ilmuwan botani Rusia Mikhail SemenovichTswett
di awal abad 20
• Merupakan metode pemisahan dimana analitnya berada dalam fasa gerak
(cair maupun gas) yang dipompakan pada fasa diam
• Salah satu fasa hidrofilik, lainnya lipofilik.
• Tergantung polaritasnya.
• Secara garis besar dapat berupa KromatografiGas dan Kromatografi Cair.
Pada GC untuk molekul yang heat-stable dan volatile. Pada LC, sampel harus
terlarut secara sempurna dalam fasa gerak.

5. Komponen sampel berinteraksi
dengan fasa diam dan fasa gerak
berbeda tergantung waktu retensi
tiap komponen
Prinsip pemisahan
Kromatografi.

6. Teori Dasar
Kromatografi
• Faktor kapasitas
• Faktor selektivitas
• Efisiensi
• PersamaanVan deemter
• PlotVan deemter : Difusi Eddy, Difusi Longitudinal,
transfer massa

7. Teori dasar Kromatografi
Faktor
Kapasitas
Faktor
Selektivitas
Persamaan
Van deemter

8. Aplikasi Kromatografi untuk
Bioanalisis
Kimia Bioanalisis

9. Pemisahan Protein
Sifat/Karakteristik Metode Pemisahan
Hidropobisitas K. Fasa terbalik
Muatan K. Pertukaran Ion
Biospesifisitas K. Affinitas
Ukuran, bentuk K. Size exclusion

10. Kromatografi untuk Bioanalisis
Fasa-terbalik
• Pemisahan
biomolekul ex.
peptida, asam
amino,
karbohidrat &
steroid, yang
larutan dalam
campuran air-
asetonitrile.
Pertukaran ion
• Pemisahan
seluruh molekul
bermuatan, ex.
Protein large,
nukleotida dan
asam amino
• Bergantung
pada pH
Afinitas
• spesifik untuk
biomolekul
tertentu
• Tahapannya
sample
introduction,
adsorpsi,
washing &
desorpsi
Size Exclusion
• Bergantung
pada ukurannya
atau BM.
• Pemisahan
polimer dalam
media non-cair.

11. Gambar atas : Urutan pelarut
bergantung pada polaritas dan
keccapatan elusi
Gambar Bawah : Instrumen HPLC
Kromatografi Fasa
Terbalik

12. Fasa diam yang biasa
digunakan
Etil silana (C2) hingga n- octadesil
silane (C18). Adapun yang paling sering
digunakan yakni oktil silane (C8) dan
(C18)

13. Perbedaan dalam RP-HPLC

14. Reversed-Phase High-Performance
Liquid Chromatography (Marie-Isabel Aguilar)
Kimia Bioanalisis

15. Kelebihan & Kekurangan RP-HPLC
• Resolusi yang tinggi dalam berbagai kondisi bahkan untuk gugus yang punya
kemiripan tinggi.
• Selektivitasnya dapat dimodifikasi dengan mengubah karakteristik fasa diam
• High Recovery dan produktivitas yang tinggi
• Reprodusibilitas yang baik dalam pemisahan berulang2 dalam waktu yang
lama dikarenakan fasa diam/sorbent yang stabikl dalam berbagai fasa gerak
yang digunakan.
• Namun, RP-HPLC dapat menyebabkan denaturasi sampel protein karena
penggunaan asetonitril.

16. Prinsip KCKT-Fasa terbalik

17. Alat dan Bahan
Alat
• Kolom oktadesil silika
• Saringan pelarut
• Saringan sampel
• Buffer A: 0.1% (v/v)TFA dalam air
• Buffer B: 100% CH3CN mengandung
0.1% (v/v)TFA
• Sistem HPLC dan detektor UV
Bahan
 Asetonitril (CH3CN),
 Air
 AsamTrifluoroasetat (TFA).

18. Metode
• Preparasi Sampel
• Preparasi Pelarut
• Ekuilibrasi Kolom/Instrumen
• Injeksi Sampel

19. Preparasi Sampel
• 1 mg sampel dilarutkan dalam 1 mL bufferA. Jika ada material tidak terlarut,
sampel disaring pada saringan 0.22-μm.
Preparasi Pelarut
• Semua pelarut disaring pada a 0.22-μm filter
• Untuk menghilangkan partikulat yang dapat menghalangi pelarut.
• If the HPLC instrument is not installed with on-line degassing capability, check
with your instrument requirements to assess whether further degassing is
required.

20. Column Equilibration and Blank Run
1. Kondisi optimal standar HPLC
• a. Pelarut: 100% BufferA
• b. Laju aliran: 1 mL/min
• c. Panjang Gelombang deteksi: 215 nm
• D. Suhu: Ambient
2. 10 μL water dimasukkan/diinjeksi.

21. Injeksi Sampel & Analisis
• Sebanyak 10 μL sampel
diinjeksi. Gradien linear yang
digunakan yakni 0 sampai
100% buffer B selama 30
menit.
• Gambar di samping
menunjukkan kromatogram
tipikal peptida

22. Monoclonal antibodies yang di analisis
dalam waktu 9 menit memberikan
puncak yang tajam.
Biotherapeutic proteins
are a growing class of
pharmaceutical drugs.

23. InsulinVariants

24. Notes
• Fase diam
• Diameter Kolom
• Ukuran Pori
• Buffer A
• Buffer B
• Laju Aliran
• Suhu
• Gradien Linear

25. Thankyou
  

26. Fasa Gerak
• Awalnya, fasa gerak yang digunakan di
RP-HPLC menggunakan air saja namun
sangat hidrofobik. Sehingga
dibutuhkann pelarut organik untuk elusi.
Pelarut organik akan menurunkan
polaritas fasa gerak.
• Penambahan pelarut organik dapat
menyebabkan denaturasi protein karena
mengganggu interaksi hidrofobik antara
rantai samping non-polar dari protein
dan ikatan hidrogen dalam ikatan
peptida. Sehingga waktu retensi
semakin lama.
Ion Pairing Agent
• TFA dapat juga memiliki efek ion pairing
agent. IPA ini berfungsi untuk mengikat
molekul sampel dengan interaksi ionik,
mengubah hidrofobisitasnya. Sehingga
waktu retensi dan selektivitas dapat
lebih baik.
• IPA ini dibutuhkan untuk mengikat analit
ke fasa diam

27. Ion Surpression
• Stabilitas gel silika tergantung pH harus dibawah 7.5. Untuk mengatasinya, asam kuat spt
TFA/ asam ortofosfat digunakan sehingga pH 2-3.
• Menggunakan pH rendah pada fasa gerak, protein juga mengandung gugus ionizable dan
tingkat ionisasi ini dapat berefek pada waktu retensi. Pada kondisi pH rendah, ionisasi
gugus karboksil dapat terjadi dan gugus amino sepenuhnya terdeprotonasi.
• Sehingga solut dapat dilihat sbg suatu species tunggal ionized.TI kebanyakan peptida dan
protein kebanyakan di atas angka pH tsb. Selektivitas yang tinggi bisa didapatkan di bawah
TI peptida.