2. Tehnik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode
amplifikasi (penggandaan) fragmen DNA secara in vitro.
PCR merupakan proses yang berulang dan terdiri dari tiga tahapan
utama:
1. Denaturasi DNA template menggunakan pemanasan
2. Annealing atau penempelan primer (berupa oligonukleotida
rantai tunggal dan pendek)
3. Extension atau pemanjangan primer menggunakan enzim taq
polimerase
Polymerase Chain Reaction
3. EnzimTaq Polymerase
Taq Polymerase tahan dan stabil
pada suhu tinggi untuk
mengkatalisis terjadinya proses
elongasi primer pada DNA
template.
Enzim taq polymerase berasal dari
Thermus aquaticus yang hidup
dihabitat sumber air panas dan
sumber panas bumi dengan
ketahanan enzim pada suhu 50oC-
80oC.
Komponen Utama Proses PCR
4. Primer
Primer merupakan DNA rantai
tunggal tunggal atau sepasang
oligonukleotida dengan rantai yang
pendek untuk menginisiasi
terjadinya proses ekstension oleh
enzim taq polymerase.
Tanpa primer, enzim taq
polymerase tidak akan bekerja
untuk menginisiasi terjadinya
proses pemanjangan (extention)
pada tahapan PCR.
Komponen Utama Proses PCR
5. dNTPs
dNTPs (Deoxynucleoside
triphosphates) yang berupa dATP,
dTTP, dCTP, dan dGTP merupakan
basa nitrogen yang dibutuhkan
dalam proses PCR.
dNTPs berupa basa nitrogen bebas
yang akan mengisi DNA template
sesuai dengan basa nitrogen
template pada tahapan extention.
Komponen Utama Proses PCR
6. cofactor Enzim
Cofactor enzim merupakan
komponen non protein yang
diperlukan untuk aktivasi aktivitas
biologi suatu protein. Pada proses
PCR, enzim taq polymerase
diaktifkan dengan menambahkan
MgCl2 ke dalam PCR mix.
Komponen Utama Proses PCR
7. Buffer
Reaksi PCR hanya akan berlangsung
pada kondisi pH tertentu. Oleh karena
itu untuk melakukan proses PCR
diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di
sini adalah untuk menjamin pH medium.
Buffer PCR yang digunakan berkaitan
dengan pH dan kapasitas buffer nya.
Dalam perdagangan ada dua jenis buffer
PCR yaitu “Low-salt buffer” (pH 8,75 dan
kapasitas buffer rendah) dan “High-salt
buffer” (pH 9,2 dan kapasitas buffer
tinggi)
Komponen Utama Proses PCR
8. DNATemplate
DNA template adalah DNA yang
digunakan dalam analisis. Biasanya DNA
template adalah DNA hasil isolasi
terhadap objek penelitian yang telah
dilakukan.
Komponen Utama Proses PCR
25. PCR Replikasi DNA
Metode yang umum digunakan untuk
memperbanyak DNA pada segmen tertentu
Proses biologi untuk memproduksi dua DNA yang
identic dari satu template DNA
Terjadi secara in vitro dan prosesnya terjadi
menggunakan tube PCR
Terjadi secara in vivo dan prosesnya terjadi pada
sel hidup
Tujuan utamanya untuk memproduksi DNA secara
eksponensial pada fragmen DNA tunggal
Tujuan utamanya untuk menggandakan seluruh
DNA genom dalam sekali proses
DNA target lebih pendek DNA target lebih panjang
Tidak berkelanjutan, hanya sampai 30-40 siklus Proses berkelanjutan
Denaturasi DNA menggunakan suhu > 90oC Denaturasi DNA menggunakan enzim helicase
Polimerasi DNA menggunakan enzim taq
polymerase
Polimerasi DNA menggunakan enzim DNA
polymerase
Tidak memiliki garpu replikasi Memiliki garpu replikasi
Taq polymerase bekerja pada suhu 72oC DNA polymerase bekerja pada suhu tubuh 37oC
Pendekatan sederhana untuk penggandaan DNA Proses yang sangat kompleks dengan
memanfaatkan banyak enzim dan proses
Kecepatan sintesis 1-4 kb per menit Kecepatan sintesis 1 kb per menit
28. Reverse Transcriptase PCR merupakan sintesis
rantai ganda complementary DNA (cDNA) dari
rantai tunggal RNA template melalui suatu reaksi
dengan bantuan enzim reverse transcriptase.
Pada cDNA, intron tidak muncul karena mRNA
telah mengalami seleksi intron.
35. Prinsip DNA rekombinan
Prinsip dari DNA rekombinan adalah
penggunaaan DNA interest/target yang
digabungkan dengan DNA vector dengan
memanfaatkan enzim restriksi dan enzim
DNA ligase sehingga dihasilkanlah DNA
dengan komponen DNA asal dan DNA
vector yang kompatibel.
36. Enzim Restriksi
Enzim restriksi merupakan
enzimyang memotong DNA pada
titik khas, tergantung dari jenis
enzim restriksi yang digunakan.
Gambar disamping
menggambarkan pemotongan
DNA menggunakan enzim Hpal
yang memotong dan
menghasilkan ujung tumpul.
38. Enzim Restriksi
Nama Enzim Titik Pemotongan Sumber Enzim
Pada awalnya, enzim restriksi merupakan enzim
yang dihasilkan oleh berbagai bakteri sebagai
mekanisme pertahanan bakteri tersebut terhadap
DNA asing yang masuk ke dalam bakteri. DNA
asing yang masuk ke dalam tubuh bakteri akan
dirusak dan didegradasi menggunakan enzim
restriksi dengan cara memotong-motong DNA
tersebut sehingga tidak fungsional.
40. Enzim DNA Ligase
Enzim DNA ligase
menggabungkan DNA yang
terputus dengan cara
mengikat gugus OH bebas
dengan gugus fosfat untuk
membentuk ikatan
fosfodiester.
41. Vektor Kloning
Vector cloning adalah agen yang
membawa fragmen DNA yang
diinginkan masuk ke dalam sel
target. Umumnya vector cloning
yang digunakan dalam teknologi
rekayasa genetika adalah plasmid,
vector lamda, virus, kromosom
artificial bakteri, kromosom artificial
khamir, dan cosmid.
42. Vektor Kloning
Plasmid Episom
Plasmid adalah molekul DNA
ekstrakromosom bakteri yang
kecil, melingkar, dan
berikatan ganda
Episom adalah tipe DNA
ekstrakromosom yang lebih
besar daripada plasmid
Mengandung informasi
penting untuk pereplikasian
diri
Tidak mengandung informasi
untuk pereplikasian diri
Tidak bisa berikantan dengan
DNA kromosom bakteri
Mereka bisa terintegrasi
dengan DNA kromosom
Beberapa gen yang berada di
plasmid memberikan ciri khas
pada bakteri seperti resistensi
antibiotik, toleransi logam
berat, dll.
Episom tidak mengandung
gen spesial. Plasmid F
mengandung hanya DNA
faktor F.
Plasmid digunakan sebagai
vektor
Episoms tidak digunakan
sebagai vektor
43. Vektor Kloning
Bakteri memiliki kemampuan
untuk mentransfer plasmid
melalui mekanisme konjugatif dari
satu sel bakteri ke sel target
bakteri yang lain.
44. Vektor Plasmid
Salah satu plasmid yang umum
digunakan sebagai vector adalah
plasmid pBR322 yang
mengandung wilayah resisten
tetrasilin dan resisten ampisilin.
45. Vektor Plasmid
Plasmid vector pBR322
membantu bakteri untuk
bertahan terhadap antibiotic
ampicillin dan tetrasilin karena
pada plasmid terdapat gen
resisten ampisilin dan tetrasilin.
47. Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri vector
dalam teknologi rekayasa genetika. Infeksi tanaman
oleh bakteri A. tumefaciens menyebabkan
pembentukan tumor-tumor kecil pada jaringan
tanaman.
49. Agrobacterium tumefaciens
Struktur kimia dari tiga opine (molekul
seperti asam amino) yang diproduksi oleh
plasmid A. tumefaciens diekspresikan
dalam tanaman yang terinfeksi;Opine
digunakan sebagai makanan oleh A.
tumefaciens.
Zat ini menimbulkan bintil tumor kecil
pada jaringan tanaman sehingga plasmid
dari A. tumefaciens dinamakan denganTi-
plasmid atau Tumor Infection plasmid.
52. Agrobacterium tumefaciens
Kemampuan Agrobacterium tumefaciens menginfeksi
tanaman dengan cara mentransformasi plasmid nya
pada DNA tanaman target menjadikan bakteri ini
sebagai vector yang pontesial dikembangkan dalam
teknologi DNA rekombinan dan rekayasa genetika
tanaman.
55. Produk Bioteknologi
Larva serangga akan memakan daun pada tanaman jagung
Racun Bt pada tanaman jagung berikatan dengan system
pencernaan larva serangga
Racun Bt menghambat penyerapan nutrisi pada larva
serangga sehingga menyebabkan larva kekurangan nutrisi
Racun Bt juga menyebabkan infeksi pada saluran
pencernaan larva serangga
Larva serangga mati karena
56. Produk Bioteknologi
1991
1938
1990
1995
Bacillus thuringiensis berhasil
diisolasi dari lambung serangga
yang mati
Bacillus thuringiensis untuk
pertama kali dikomersilkan
sebagai biopestisida di francis
Ratusan Bacillus thuringiensis
diisolasi
Gen yang berhubungan dengan
gen racun Bt berhasil di sisipkan
pada tanaman kapas
57. Produk Bioteknologi
Golden rice, merupakan
padi dengan kandungan
gen yang berasal dari
tanaman kacang, jamur,
padi liar, dan bakung.