Ppt menjelaskan mengenai vektor, struktur, jenis, manfaat, dan studi kasus pemanfaatan vektor ekspresi.

1.  
VEKTOR

2. VEKTOR
 Molekul DNA untuk “transpor” sekuens DNA.
 Syarat:
o Mampu bereplikasi mandiri
o Mengandung penanda/marker
o Berat molekul kecil
o Memiliki situs restriksi unik
o Memiliki beberapa kopi pada setiap sel
o Tidak berkonjugasi.
 Contoh: plasmid, bakteriofag lambda, YAC, BAC, cosmid.

3. PLASMID as VEKTOR
 Double-stranded, circular, self-replicating, extra-
chromosomal DNA molecules.
 Dalam satu sel bisa terdapat beberapa plasmid
 Ditemukan pada bakteri dan yeast
 Mengandung:
o ORI
o Selektif marker
o Multiple cloning site

4. ORI
 Titik inisiasi replikasi
 Tanpa ORI, DNA tidak akan dapat direplikasi.

5. MARKER SELEKTIF
 Diperlukan untuk maintenance plasmid di dalam sel.
 Kehadirannya membuat plasmid jadi berguna untuk sel.
 Di bawah kondisi selektif, hanya sel yang mengandung
plasmid dengan marker selektif yang dapat survive.

6. MULTIPLE CLONING SITE
 Disebut juga polylinker, merupakan situs yang dikenali oleh
restriksi endonuklease
 Bersifat spesifik
 Tempat penyisipan gen

7. MULTIPLE CLONING SITE

8. 
VEKTOR KLONING

9. VEKTOR KLONING
 Media untuk memperbanyak dan mentransformasi fragmen
DNA

10. TIPE VEKTOR
 Tiap tipe digunakan untuk tujuan eksperimen yang berbeda.
 Dipilih berdasarkan :
o Ukuran fragmen
o Ukuran vektor
o Situs restriksi
o Jumlah kopi
o Efisiensi kloning
o Kemampuan utk
ditapiskan
o Tujuan eksperimen

11. PLASMID

12. PLASMID
 Kloning DNA dengan ukuran >10kbp
Misal : pBR322, pUC18
 Kelemahan:
o Tidak untuk fragmen DNA besar
o Ukuran 0-10 kb
 Kelebihan:
o Berukuran kecil, mudah dihandle
o Cocok untuk kloning fragmen
kecil
o Transformasi efisien

13. JENIS PLASMID
F-plasmid R-plasmid
Col-plasmid Degradative plasmid
Virulence plasmid

14. BAKTERIOFAGA LAMBDA
 Virus penginfeksi E.coli
 Ukuran fragmen 5-25 kbp
 dsDNA
 Memiliki 5’ twelve-base-pair sticky end (cos site)
 Replikasi di dalam inang
 Harus membawa satu atau lebih marker selektif
 Harus memiliki situs restriksi pada bagian dna nonesensial.
 Contoh: λ gt 10 dan λZAP

15. BAKTERIOFAGA LAMBDA

16. VEKTOR BERKAPASITAS BESAR
 Cosmid (<50kbp), PAC dan BAC (100-300kbp), YAC (20-
2000kbp)
 Manfaat :
o Memperkecil jumlah klon pustaka DNA yang harus dibuat
o Memudahkan penyimpanan.
o Mempercepat proses seleksi transformant target

17. COSMID
 Dikembangkan dari plasmid, dilengkapi dengan sekuens
cos dan gen ori
 Ukuran fragmen yang diinsersi 35-57 kbp
 Bersifat seperti plasmid dan faga

18. TRANSFEKSI COSMID

19. PAC
 P1-derived Artificial
Chromosomes
 sistem kloning untuk isolasi
DNA genomik berdasarkan F-
factor plasmid
 mengandung beberapa elemen
dari klon bakteriofag P1
(recombination or packaging
site)
 Dapat membawa sekuens
insersi hingga beratus kbp.
 Perkembangbiakan di dlm sel
E.coli

20. BAC
 Bacterial Artificial
Chromosomes
 Sistem kloning utk isolasi
DNA berdasarkan F-faktor
plasmid dengan jumlah
kopian rendah
 Dapat diklon seperti
plasmid dalam sel bakteri
dan dapat membawa
sekuens insersi beberapa
ratus kbp (300kbp)
 lebih sedikit mengandung
khimera dan efisiensi
transformasi 100x
dibanding YAC

21. YAC
 Tool untuk kloning pada sel eukaryotik
 Hasil perkembangan plasmid pBR322 dengan komponen gen yeast: SUP4,
7RP1, HIS3, URA3
 Yeast Artificial Chromosome mengandung:
o Yeast ORI/ARS
o Centromer
o Telomer pada tiap ujung
o Marker selektif
 Ukuran fragmen yang dapat diinsersi 500-2000 kbp
 Sering ditemukan khimaera (DNA yang disisipkan dalam vektor kloning berasal
dari 2 sumber/ area kromosom yang berbeda)

22. YAC

23. 
VEKTOR EKSPRESI

24. VEKTOR EKSPRESI
 Plasmid atau virus yang didesain untuk ekspresi protein.
 Digunakan misalnya untuk menghasilkan protein, misalnya
insulin.
 Vektor ekspresi harus memiliki element ekspresi seperti:
o Promotor, RBS, terminator, start codon.

25. SISTEM EKSPRESI
 Ekpresi dari vektor menyebabkan segmen DNA dapat
ditranslasikan di sel inang. Berikut tipe vektor dan inang
yang sesuai:
 Bakteri: plasmid, faga.
 Yeast: plasmid, YACs
 Sel serangga: Baculovirus, plasmid
 Mamalia:
o SV40
o Vaccinia virus
o Adenovirus
o Retrovirus
o CHO, HEK293

26. SISTEM EKSPRESI PROKARIOT
 E. coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus carnosus,
Streptomyces lividans
 Prokaryotic promoter—ribosome binding site—MCS—
transcription termination site
 Prokaryotic selectable marker

27. BEBERAPA MASALAH YANG TIMBUL PADA
SISTEM EKSPRESI BAKTERIAL
 Tingkat ekspresi rendah:
o Perubahan promoter
o Perubahan plasmid
o Perubahan tipe sel
 Degradasi protein
 Hilangnya post-translational modification
 Misfold protein
 Terbatasnya oksigen
 Pembentukan biofilm

28. SISTEM EKSPRESI PADA EUKARIOT
• Yeast, Aspergillus niger, Baculovirus-Insect Cells,
Mammalian Cells (e.g. Chinese Hamster Ovary cells)
• Eukaryotic promoter-MCS-transcription termination site
• Eukaryotic selectable marker
Dapat dilakukan post
translational
modification.
- Glikosilasi
- Fosforilasi
- Hidroksilasi

29. APLIKASI VEKTOR EKSPRESI
 Jurnal “Subkloning α-L- arabinofuranosidase (abfA) dalam
vektor ekspresi pYES2” (Wirajana dkk 2010: 149—157).
 LATAR BELAKANG
Semakin melimpahnya limbah hemiselulosa dari
pertanian. Oleh karena itu diperlukan suatu teknik bioproses
yang ramah lingkungan guna mengubah limbah pertanian
berupa hemiselulosa tersebut menjadi produk yang
bermanfaat, misalnya etanol, xilitol, dan lain-lain.

30. APLIKASI
Hemiselulosa terdiri atas utamanya berupa xilan,
arabinan, arabinogalaktan. Penelitian menggunakan enzim α-
L-arabinofuranosidase yang gennya diperoleh dari Geobacillus
thermoleovoans IT-08 termofilik yang telah diklon ke plasmid
pTP510 dalam E.coli DH5α.
BAHAN: E.coli DHα pembawa plasmid pTP510, E.coli Top10,
plasmid ekspresi pYES2.

31. Cara kerja
Perbanyakan plasmid pTP510 dan
pYES2
Isolasi pTP510 dan pYES2
Analisis restriksi pTP510 dan pYES2
Desain primer pFSacI-Af dan pXohoI-Af
Amplikon dielektroforesis agarosa

32. Cara kerja
Pemotongan fragmen DNA dan plasmid pYES2
SacI dan XhoI
Elektroforesis hasil restriksi
Ligasi dengan T4ligase
Transformasi hasil ligasi ke E.coli Top10
Kultivasi , isolasi, dan purifikasi
Analisis restriksi

33. Jurnal
3/30/2015

34. 
SELESAI
ANY QUESTIONS?