Downloaded 69 times
![The Birth of the Southern Blot, 1975
"Gels used for electrophoresis of nucleic acids and proteins are permeable
This obvious fact didn't dawn on me until I tried to dissolve some agarose
by floating it on a solution of sodium perchlorate and noticed a bead
of liquid form on the top. I reasoned that if DNA molecules were carried
through with the flow it would be possible to capture them on
a nitrocellulose membrane, using the setup shown in the sketch.
The big thrill came when, at the first attempt, I saw genes lit up as
bands after hybridizing with radiolabeled probes.
The Journal of Molecular Biology [initially] rejected the
first manuscript1 as a 'methods paper' and the sketch is
what I sent to people who had heard of the method and
wanted to get on and use it.“
-- Ed Southern, Oxford University](https://image.slidesharecdn.com/pcrii-170226032217/75/Pcr-ii-40-2048.jpg)
![DNA is transferred ("blotted") to filter paper
Filter is exposed to a DNA probe
Probe - single-stranded DNA, base-complementary
to gene of interest
Binds specifically to target DNA immobilized on filter
Radioactively labeled with 32P / 35S-dNTPs
exposes X-ray film
Autoradiogram shows presence / absence & size
of cloned DNA
RFLP differences
[click here for an animation of southern blotting]
DNA probe binds to RNA: "Northern Blot" Is a particular gene
(DNA) expressed as mRNA in a particular tissue?
[Antibody probe binds to protein: "Western Blot"]](https://image.slidesharecdn.com/pcrii-170226032217/75/Pcr-ii-41-2048.jpg)
Uploaded byUniversity of ganesha education
Pcr ii
Teknik PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA spesifik secara cepat dan akurat melalui siklus pengulangan proses pemanasan dan pendinginan yang memisahkan dan memperbanyak DNA target. Teknik ini memungkinkan deteksi dan karakterisasi DNA dalam jumlah sedikit untuk berbagai aplikasi medis dan forensik.
More Related Content
Pcr ii
- 1.
- 2. DNA : THEMOLECULE OF LIFE
- 3.
- 5.
- 6. DEVELOPMENT OF MOLECULARBIOLOGY TECHNIQUES DNA ISOLATION PURE DNA IN-VITRO MANIPULATION MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES
- 7. POLIMERASE CHAIN REACTION(PCR) • Kary Mullis (1984) • PENGGANDAAN FRAGMEN SPESIFIK DNA SECARA INVITRO JUTAAN KOPI FRAGMEN DNA SECARA CEPAT DAN AKURAT • Meniru replikasi in vivo • Teknik amplifikasi DNA spesifik secara in vitro
- 8. Prinsip PCR • PCR:dapat mengamplifikasi urutan DNA spesifik • Reaksi PCR: mengandung DNA target rantai ganda, dua primer yang dapat berhibridisasi pada urutan pada DNA target yang berlawanan, 4 dNTP, dan DNA polimerase • Karena, reaksi dipanaskan pada suhu tinggi, PCR tergantung pada DNA polimerase yang stabil terhadap panas • Beberapa DNA polimerasi yang tahan thd panas: diisolasi dari bakteri termofilik • Enzim pertama yang digunakan adalah Taq polimerase (dari Thermus aquaticus)
- 9. PCR terdiri dari3 tahap: Denaturasi: campuran reaksi dipanaskan sampai 95oC (15-30 detik) untuk mendenaturasikan DNA target menjadi rantai tunggal Penempelan primer: campuran didinginkan dengan cepat sampai suhu tertentu yang memungkinkan dua primer mengikat pada rantai tunggal DNA target Suhu penempelan ini ditentukan dengan hati-hati untuk menjamin primer hanya mengikat pada urutan DNA yang diinginkan. Satu primer mengikat pada masing-masing rantai.
- 11. Elongasi: suhucampuran dinaikkan menjadi 72oC dan dipertahankan yang memungkinkan DNA polimerasi mengelongasi primer dengan mengkopi DNA target rantai tunggal Pada akhir inkubasi, DNA target rantai tunggal menjadi rantai ganda. Tiga tahap siklus PCR diulangi. Pada siklus kedua, empat rantai DNA mengalami denaturasi, kemudian primer mengikat dan diperluas. Tidak ada reaktan lain yang perlu ditambahkan. Tiga tahap ini diulangi lebih dari sekali untuk siklus ketiga
- 12. Thermocycler otomatissekarang ini telah digunakan untuk mensklus reaksi tanpa interfensi manual Setelah 20 siklus, DNA target (asli) telah diamplifikasi berjuta kali lipat dan ini akan meningkat 1000 juta setelah 30 siklus Semuanya ini memmerlukan waktu kurang dari satu jam.
- 13. Aplikasi PCR • PCRdapat mengamplifikasi molekul DNA tunggal dari campuran kompleks, menghindari penggunaan kloning DNA dalam sel untuk mendapatkan molekul DNA murni yang diinginkan. • Penentuan urutan basa DNA dapat disederhanakan dengan PCR, dan aplikasi ini sekarang sangat umum. • Dengan menggunakan primer yang sesuai, melalui PCR dapat dibuat mutasi titik, insersi dan/atau delesi DNA target yang dapat membantu analisis ekspresi dan fungsi gen.
- 14. • PCR sangatsensitif dan dapat mengamplifikasi DNA dalam jumlah yang sedikit. Dengan menggunakan primer yang sesuai, DNA bakteri atau virus dalam jumlah sedikit dapat dideteksi dalam jaringan. Hal ini menyebabkan PCR tidak terlalu mahal untuk diagnosa medis. • PCR cukup murah untuk mengkarakterisasi sampel DNA secara medis. Misalnya, dalam penentuan penyakit genetik manusia. Pada penentuan penyakit genetik, PCR didasarkan pada analisis daerah microsatellites dalam DNA. Microsatellites ini merupakan urutan di, tri dan tetranukleotida berulang dalam DNA, yaitu jenis (CA)n atau (CCA)n di mana n adalah bilangan dari 10 sampai 30. Microsatellites dapat digunakan sebagai penanda, seperti pada RFLP. • Karena sensitivitasnya, PCR sangat penting dalam forensik. PCR mengamplifikasi DNA dari rambut manusia atau tetesan darah yang tertinggal pada tindakan kriminal untuk membuktikan tersangkanya.
- 15. Komponen PCR Templat DNA TaqDNA polymerase dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) Sepasang primer Buffer (MgCl2)
- 16.
- 17. Step 1 :Denaturation (separation of double-stranded DNA) by Heat (95° C) Step 2 : Primer Anneals (50 - 65° C) step 3 Primer Extension by Taq Polymerase (72° C) End of the 1st PCR Cycle Results in 2 Copies of Target Sequence
- 18. Polymerase Chain Reaction(PCR) View PCR
- 19. A. Double strand DNA B.Denature96º 50º C. Anneal primers 50º D. Polymerase binds 72º Taq Taq
- 20.
- 21. CYCLE NUMBER ANDAMPLICONS
- 22. • End-Point Detection Detectionof PCR product at the end of the PCR program Gel Based – electrophoresis (agarose or polyacrylamide gel electrophoresis) Real-Time Detection Detection during the PCR program Detection of PCR Product
- 23. Gel Electrophoresis Agarose gel Pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran Makin kecil ukuran migrasi makin cepat 1-2% + ethidium bromide Visualized using UV transilluminator
- 24. Gel Documentation Gel stainedwith Ethidium bromide and viewed under UV light. Gel Photo
- 25. Real-Time PCR Monitors thefluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle (in real time)
- 27. Real-time Principle METODE DETEKSIAMPLIFIKASI 1. Hydrolysis probes (TaqMan, Beacons, Scorpions) 2. Hybridisation probes (Light Cycler) 3. DNA-binding agents (SYBR Green)
- 28. Jika DNA terdenaturasi (ssDNA),SYBR Green tidak berfluoerescensi SYBR Green® SYBR Green® dye berfluorescensi jika terikat dengan dsDNA ada amplicon Makin banyak terjadi amplifikasi makin banyak amplicon makin banyak SYBR Green terikat dengan dsDNA intensitas fluorescensi makin tinggi
- 29.
- 30. Keunggulan PCR Sensitivitas tinggi(amplifikasi) Tidak perlu proses pembiakan Spesifisitas tinggi Cepat (dalam kurang dari 24 jam)
- 31. APLIKASI PCR • DIAGNOSTIK –INFEKSIOUS DISEASE – GENETIC DISEASES – DETEKSI MUTASI • RECOMBINANT TECHNOLOGY
- 32. DNA SEQUENSING PATHOGENDETECTION
- 40. The Birth ofthe Southern Blot, 1975 "Gels used for electrophoresis of nucleic acids and proteins are permeable This obvious fact didn't dawn on me until I tried to dissolve some agarose by floating it on a solution of sodium perchlorate and noticed a bead of liquid form on the top. I reasoned that if DNA molecules were carried through with the flow it would be possible to capture them on a nitrocellulose membrane, using the setup shown in the sketch. The big thrill came when, at the first attempt, I saw genes lit up as bands after hybridizing with radiolabeled probes. The Journal of Molecular Biology [initially] rejected the first manuscript1 as a 'methods paper' and the sketch is what I sent to people who had heard of the method and wanted to get on and use it.“ -- Ed Southern, Oxford University
- 41. DNA is transferred("blotted") to filter paper Filter is exposed to a DNA probe Probe - single-stranded DNA, base-complementary to gene of interest Binds specifically to target DNA immobilized on filter Radioactively labeled with 32P / 35S-dNTPs exposes X-ray film Autoradiogram shows presence / absence & size of cloned DNA RFLP differences [click here for an animation of southern blotting] DNA probe binds to RNA: "Northern Blot" Is a particular gene (DNA) expressed as mRNA in a particular tissue? [Antibody probe binds to protein: "Western Blot"]