Download to read offline
28923ip
- 1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН (19) KZ(13) A4 (11) 28923 (51) C12N 7/00 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ (21) 2013/1344.1 (22) 16.10.2013 (45) 15.09.2014, бюл. №9 (72) Сансызбай Абылай Рысбайулы; Абдураимов Ергали Орынбасарович; Баракбаев Кайнар Базаркулович; Булатов Ербол Акенович; Ершебулов Закир Джапарович; Таранов Дмитрий Сергеевич; Саметова Жанна Жумабековна; Аманова Жанат Темирбаевна (73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения "Научно- исследовательский институт проблем биологической безопасности" Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (56) Балышева В.И., Сливко В.В., Жестерев В.И. и др. Культивирование вируса блютанга в культурах клеток животных. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2002, №6, с.46-48 (54) ШТАММ "ХУРОСОН-40/13/4" IV СЕРОТИП ВИРУСА КАТАРАЛЬНОЙ ЛИХОРАДКИ ОВЕЦ, ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности, к аттенуированному штамму вируса КЛО. Новый аттенуированный культуральный штамм вируса КЛО получен, путем пассирования в куриных эмбрионах, далее адаптированный к культивированию в перевиваемой линии культуры клеток почки сайги (ПС). Изобретение может быть использовано для изготовления вакцины, которое может быть применено для производства вакцины против заболевания овец в научно-исследовательских учреждениях и различных отраслях биологической промышленности. Предлагаемый аттенуированный штамм "Хуросон-40/13/4" 4-го серотипа имеет высокую инфекционную активность 107,5 ТЦД50/см3 , он является безвредным и иммуногенным в отношении восприимчивых животных. При введении его животным у последних образуется иммунитет к 4-му серотипу вируса. Штамм адаптирован для культивирования в перевиваемой культуре клеток почки сайгака (ПС) с хорошо выраженным цитопатическим эффектом (разрежение межклеточного вещества, округление клеток, отделение их от стекла, с последующей дезагрегацией клеточного монослоя и разрушением клеточных оболочек), период культивирования составляет 3 суток, в качестве питательной среды используется среда Игла-MEM с содержанием 5% сыворотки крови крупного рогатого скота (инактивированной при 56°С в течение 30 минут) при заражающей дозе 0,01-0,02 ТЦД50 на клетку, рН среды 7,2-7,5. (19)KZ(13)A4(11)28923
- 2. 28923 2 Изобретение относится кобласти ветеринарной вирусологии, в частности, к аттенуированному штамму вируса КЛО. Новый аттенуированный культуральный штамм вируса КЛО получен, путем пассирования в куриных эмбрионах, далее адаптированный к культивированию в перевиваемой линии культуры клеток почки сайги (ПС). Изобретение может быть использовано для изготовления вакцины и диагностических наборов. Уровень техники Известен 4 серотип вируса катаральной лихорадки овец (В.И.Балышева, В.В.Сливко, В.И.Жестерев и др. Культивирование вируса блютанга в культурах клеток животных. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2002. №6, 46-48), полученный путем культивирования вируса на культуре клеток ПСГК- 60 (почки сибирского горного козерога), с инфекционной активностью 106,5 ТЦД50/см3 . Иммунитет после первого введения инактивированной вакцины из этого серотипа проявляется на 21 сутки в виде образования вируснейтрализующих антител в титрах 1:16. Предлагаемый штамм получен путем пассирования в куриных эмбрионах, далее адаптированный к культивированию в перевиваемой линии культуры клеток ПС, относится к семейству Reoviridae, роду Orbivirus, депонирован 09.10.2013 г. под номером М-11-13/Д в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК, отличием от вышеуказанного способа является то что, полученный аттенуированный штамм "Хуросон-40/13/4" 4-го серотипа имеет более высокую инфекционную активность 107,5 ТЦД50/см3 , а также он является безвредным и иммуногенным в отношении восприимчивых животных, при введении его животным у последних образуется специфические антитела к вирусу КЛО в титре не менее 1:200 в ИФА. Аттенуацию вируса КЛО проводили методом последовательного пассирования в 11-13 сут РКЭ, проведено 40 последовательных пассажей с определением инфекционной активности каждого пассажного уровня и проведением контроля аттенуации. Для определения степени аттенуации исследуемого штамма, проводили интрацеребральное заражение 1-3 сут мышат. Для инфицирования использовали 20% гомогенат куриных эмбрионов. Степень аттенуации вируса, оценивали с интервалом 5 последовательных пассажа в куриных эмбрионах. В результате проведенных работ установлено, что с 35 по 40 пассаж исследуемый штамм не вызывал гибели. Исследована возможность восстановления вирулентных свойств аттенуированного штамма при культивировании в культуре клеток, для этого эмбриональный материал (20% суспензия) пропассирован в культуре клеток ПС, проведено 10 последовательных пассажа, с определением инфекционного титра вируса, при этом на первом пассаже вирус накапливался в титре 6,25±0,08 lg ТЦД50/см3 , при дальнейшем пассировании наблюдается подъем инфекционного титра до 7,25±0,12 lg ТЦД50/см3 . Далее с целью определения реверсибельности полученного аттенуированного вируса, культуральный материал 10 пассажного уровня пассировали на мышах 1-3 сут возраста и овцах 6-12 мес возраста. Для этого культуральный материал мышатам вводили интрацеребрально по 0,02 см3 , а овцам внутривенно по 10 см3 . Мышата и овцы остались живыми без проявления клинических признаков инфекции в течение 14 сут (срок наблюдения). Таким образом, получен аттенуированный вирус, который не обладал патогенными свойствами при введении его восприимчивым животным. Штамм адаптирован для культивирования в перевиваемой культуре клеток почки сайгака (ПС) с хорошо выраженным цитопатическим эффектом (разрежение межклеточного вещества, округление клеток, отделение их от стекла, с последующей дезагрегацией клеточного монослоя и разрушением клеточных оболочек), период культивирования составляет 3 суток, в качестве питательной среды используется среда Игла-MEM с содержанием 5% сыворотки крови крупного рогатого скота (инактивированной при 56°С в течение 30 минут) при заражающей дозе 0,01-0,02 ТЦД50 на клетку, рН среды 7,2-7,5. С помощью электронно-микроскопических исследований в культуральных концентрированных и нативных вируссодержащих препаратах обнаруживаются вирусные частицы размером 55-70 нм. Вирионы морфологически тождественны представителям рода Орбивирусов семейства Реовирусов, имеют типичную икосаэдрическую форму симметрии и располагаются одиночно или в виде скоплений. Антигенные свойства, иммуногенность. Внутримышечное введение вируса овцам в исходном виде по 1,0 см3 вызывает образование вируснейтрализующих антител в организме овец. Устойчивость. При температуре 6±2°С в нативном состоянии вирус сохраняется без существенного снижения инфекционной активности в течение 30 сут. Лиофилизированный вирус при минус 20±1°С и ниже сохраняется в течение 5 лет. Морфологические свойства, маркерные характеристики, генетические свойства. Маркерной характеристикой штамма "Хуросон-40/13/4" 4-го серотипа вируса катаральной лихорадки овец является V - признак, виремия обнаружение вируса в крови в высоких титрах, а также ТС - признак, способность вируса размножаться в культурах клеток: почки сайгака (ПС) и почки сирийских хомячков (ВНК-21). Генетические свойства штамма (стабильность) постоянные и не подвержены изменениям при пассировании на животных или культуре клеток. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм «Хуросон-40/13/4» IV серотип вируса катаральной лихорадки овец, семейства Reoviridae,
- 3. 28923 3 рода Orbivirus, депонированныйв Коллекции микроорганизмов РГП «НИИПББ» КН МОН РК под номером М-11-13/Д с инфекционной активностью 7,50 lg ТЦД50/см3 , для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Верстка Ж. Жомартбек Корректор Е. Барч