Белорусская медицинская академия последипломного образования Таксономическое типирование хламидий и микоплазм при воспалительных процессах респираторного тракта у детей Глинкина Т.В. м.н.с. группы ПЦР диагностики ЦНИЛ БелМАПО Минск 2009

1. Белорусская медицинская академия последипломного образования Таксономическое типирование хламидий и микоплазм при воспалительных процессах респираторного тракта у детей Глинкина Т.В. м.н.с. группы ПЦР диагностики ЦНИЛ БелМАПО Минск 2009

2. усовершенствовать методику количественной ПЦР в реальном времени (Реал-тайм ПЦР) с использованием видо-, родо- и семейство- специфичных праймеров для детекции возбудителей хламидийно-микоплазменной природы в различных секретах респираторного тракта детей. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ :

4. Течение инфекционного процесса, индуцированного представителями семейства С hlamydiaceae , не патогномонично, что можно утверждать и для представителей рода Mycoplasma . Поэтому протоколы лечения как респираторных хламидиозов, так и респираторных микоплазмозов, схожи. 1 ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ : Оптимизация методики количественной Реал-тайм ПЦР с использованием Chlamydiaceae - специфичных и Mycoplasma - специфичных праймеров для детекции возбудителей семейства С hlamydiaceae ( С hlamydia trachomatis , Chlamydophila pneumoniae ) и рода Mycoplasma ( Mycoplasma hominis , Mycoplasma pneumoniae ). ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТЬ

5. Праймеры для детекции ДНК представителей семейства С hlamydiaceae (С hl . tr . и С hl . pn .) Chl . 1 – 5  - GATGCCTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA - 3  – forward ; Chl .2 – 5  - TGGCTCTCATGCAAAAGGCA - 3  – reverse , определяли границы 23 S рРНК фрагмента длиной 627 п.н. представителей семейства С hlamydiaceae (номер в GeneBank AE 004789). Зонд 5`( FAM ) AACTGATCGATAGATCGATGATCGATAATCGATAAT ( TAMRA )3` Праймеры для детекции ДНК представителей рода Mycoplasma ( M . h . и M . pn .) М.1 – 5  - CAGTACATGTTAATCCCAGAAGTATAGTTGG - 3  – forward ; М.2 – 5  - GCTGGATAATCGCCGTATGAACCTGC - 3  – reverse , ограничивали участок 16 S -23 S рРНК спейсерного региона в 550 пар оснований представителей рода Mycoplasma (номер в GeneBank X 03849). Зонд 5`(FAM) GTCAATCGATCGATAATCGATACGATATACTG ( TAMRA ) 3`

7. Реал-тайм ПЦР с родо- и видоспецифичными праймерами Инфекционный агент Пациент 1 Пациент 2 Пациент 3 Пациент 4 Количественное определение ДНК Chl . trachomatis и M . hominis методом Реал-тайм ПЦР с видоспецифичны ми праймерами Chl . tr . Концентрация Пороговый цикл (-) (-) (+) 6473 копий/мл СТ 24,78 (+) 10478 копий/мл СТ 22,49 M. h . Концентрация Пороговый цикл (-) (-) (+) 5290 копий/мл СТ 24,93 (-) Количественное определение ДНК представителей семейства Chlamydiaceae ( Chl . trachomatis и Chl . pneumoniae ) и рода Mycoplasma ( M . hominis и M . pneumonia е) методом Реал-тайм ПЦР с использованием Chlamydiaceae -специфичных и Mycoplasma -специфичных праймеров Chlamydiaceae Концентрация Пороговый цикл (-) (-) (+) 6461 копий/мл СТ 24,85 (+) 10468 копий/мл СТ 22,51 Mycoplasma Концентрация Пороговый цикл (+) 2592 копий/мл СТ 26,03 (+) 3890 копий/мл СТ 25,78 (+) 5294 копий/мл СТ 24,91 (+) 1758 копий/мл СТ 26,37

8. ВЫВОДЫ ПО АПРОБАЦИИ МЕТОДИКИ: 1. Оптимизированная реакция позволяет детектировать с достаточной надежностью представителей семейства С hlamydiaceae ( С hlamydia trachomatis , Chlamydophila pneumoniae ) и рода Mycoplasma ( Mycoplasma hominis , Mycoplasma pneumoniae ) при наличии даже 10 копий ДНК любого из них в биологической пробе; 2. Суммарная степень согласия для усовершенствованного метода и моноплексной Реал-тайм ПЦР - 98,9%; 3. Использование Chlamydiaceae - специфичных и Mycoplasma -специфичных праймеров для детекции возбудителей семейства Chlamydiaceae и рода Mycoplasma способствует сокращению времени и стоимости проводимых исследований за счет снижения потребности в реагентах и расходных материалах в 2 раза.

9. C окращение времени и количества проводимых реакций при расширении спектра определяемых концентраций возбудителей хламидийно-микоплазменной природы с получением легко интерпретируемого результата определения концентрации ДНК С hlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae в биологическом материале. 2 ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ : Разработка методики мультиплексной Реал-тайм ПЦР для одновременного количественного выявления ДНК С hlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae и апробация ее на биологическом материале (секретах респираторного тракта) детей с очаговой пневмонией. ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТЬ

10. Праймеры для детекции ДНК Chlamydophila pneumonia е Chl . pn. 1 – 5  - CATGGTGTCATTCGCCAAGT - 3  – forward ; Chl . pn. 2 – 5  - CGTGTCGTCCAGCCATTTTA - 3  – reverse , определили границы Pst-1 фрагмента длиной 82 п.н. Chlamydophila pneumonia е , кодирующего протеин клеточной адгезии (номер в GeneBank AE 001593 ) Зонд 5`( FAM ) T CTACGTTGCCTCTAAGAGAAAACTTCAAGTTGGA ( TAMRA )3` Праймеры для детекции ДНК Mycoplasma pneumoniae М. pn. 1 – 5  - CCAACCAAACAACAACGTTCA - 3  – forward ; М. pn. 2 – 5  - ACCTTGACTGGAGGCCGTTA - 3  – reverse , ограничивали участок P1 гена в 76 пар оснований Mycoplasma pneumoniae , кодирующий протеин клеточной адгезии (номер в GeneBank X 07191 ). Зонд 5`(FAM) TCAATCCGAATAACGGTGACTTCTTACCACTG ( TAMRA )3`

12. Кривые флюоресценции для определения порогового цикла амплификации специфического фрагмента ДНК Стандартная кривая для расчета количества копий специфического фрагмента ДНК

13. Лабораторно-диагностические критерии детекции С hlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae методом количественной мультиплексной Реал-тайм ПЦР Параметр С hlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Вольтаж концентраций ДНК, копий/мл 5633–10247 6789–13490 Пороговый цикл флюоресценции 24,95–22,26 24,56–22,03

14. Аналитическая чувствительность мультиплексной и моноплексной Реал-тайм ПЦР при тестировании со стандартом одного из возбудителей в различных концентрациях Матрица Формат анализа Пороговый цикл 10 4 10 3 10 2 10 1 С hl . pn . Мульти Моно 26,8±0,4 26,3±1,0 30,0±0,5 30,9±0,7 33,2±0,5 34,8±1,0 38,0±0,8 38,3±0,9 Myc . pn . Мульти Моно 24,7±0,6 24,2±0,5 27,9±0,6 27,5±0,7 31,6±0,8 31,3±0,4 35,4±0,8 35,5±0,6

15. Аналитическая чувствительность мультиплексной Реал-тайм ПЦР при коамплификации стандартов возбудителей Мультиплексная ПЦР Ct (пороговый цикл) С hl . pn . M . pn . Контроль (+) 10 4 копий 10 1 копий 10 4 копий 10 1 копий С hl . pn . 26 , 8±0 , 4 38 , 0±0 , 8 – – M . pn . – – 24 , 7±0 , 6 35 , 4±0 , 8 С hl. pn . и Myc.pn . 26 , 7±0 , 9 – – 35 , 5±1 , 0 С hl. pn . и Myc.pn . – 38,8±0,4 25,3±0,5 –

16. ВЫВОДЫ ПО АПРОБАЦИИ МЕТОДИКИ: 1. Мультиплексная реакция позволяет детектировать с достаточной надежностью возбудитель при наличии даже 10 копий ДНК С hlamydophila pneumoniae и 100 копий ДНК Mycoplasma pneumoniae в биологической пробе одновременно ; 2 . Суммарная степень согласия для мультиплексного анализа и моноплексной Реал-тайм ПЦР - 98,3% ; 3. Результаты доступны в течение 4–5 часов в высоко стандартизированном формате без обработки ПЦР продуктов. Это снижает риск ложноположительных результатов; 4. Появляется возможность количественного учета амплифицированного продукта, что позволяет выявлять различия в инфекционной нагрузке между асимптоматичными носителями инфекции и пациентами с соответствующей симптоматикой; 5. Детекция нескольких патогенов одновременно методически и экономически целесообразно для клинических образцов малого количества.

17. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!