Перспективы применения молекулярно-биологических методов в диагностике ИППП Гущин А.Е. Лаборатория молекулярной диагностики и эпидемиологии инфекций органов репродукции Референс-центр по лабораторной диагностике и мониторингу за ИППП Роспотребнадзора ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора г. Москва

1. Перспективы применения молекулярно-биологических методов в диагностике ИППП Гущин А.Е. Лаборатория молекулярной диагностики и эпидемиологии инфекций органов репродукции Референс-центр по лабораторной диагностике и мониторингу за ИППП Роспотребнадзора ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора г. Москва

2. Заболеваемость ИППП в РФ Государственная статистическая отчетность Минздравсоцразвития РФ за 2005-2007 г. 91.1 129.500 97.2 138 822 96.1 136 469 Хламидиоз 186.3 264 785 199.5 284 844 215.5 305 884 Трихомоноз 60.8 86 405 63.7 90 974 71.7 101 798 Гонококковая инфекция На 100 тыс. населен. Абс. На 100 тыс. населен. Абс. На 100 тыс. населен. Абс. 2007 2006 2005 Нозологическая форма

3. Уретрит (мужчины), цервицит, ВЗОМТ - Mycoplasma genitalium Уретрит, цервицит, ВЗОМТ Урогенитальный хламидиоз Chlamydia trachomatis (серотипы D-K ) Уретрит, цервицит, ВЗОМТ Гонорея Neisseria gonorrhoeae Уретрит (мужчины) - Ureaplasma urealyticum ( биовар Т-960) Уретрит (мужчины) Вагинит Урогенитальный трихомоноз Trichomonas vaginalis Эрозивно-язвенные поражения половых органов Сифилис Treponema pallidum Наиболее частая клиническая форма (клинический синдром) Нозологическая форма ( МКБ- X) Возбудитель

4. Нужна ли нам лабораторная диагностика ИППП?

6. N.gonorrhoeae - ? C.trachomatis - ? M.genitalium - ? - ?

13. Mycoplasma genitalium Средний размер – 0.1 – 0. 3 µm J.Jensen, 2006

16. Клинические проявления уретрита у мужчин, вызванного M.genitalium слизистые 23% гнойные 15% Нет выделений 23% Гнойно-слизистые 38% Дизурия ( зуд , жжение ) – 45 (100%) Наличие и характер выделений:

17. Пациентов с M.genitalium и разным количеством лейкоцитов при микроскопии N= 45

18. Адгезия M.genitalium на поверхности сперматозоиов при инкубации in vitro Svenstrup H.F., 2003

19. A.Baczynska, G.Christiansen, et al., Hum Rep 2007 Слизистая маточных труб Обработка C.trachomatis

20. A.Baczynska, G.Christiansen, et al., Hum Rep 2007 Слизистая маточных труб Обработка N.gonorrhoeae

21. A.Baczynska, G.Christiansen, et al., Hum Rep 2007 Слизистая маточных труб Обработка M.genitalium

22. A.Baczynska, G.Christiansen, et al., Hum Rep 2007 Слизистая маточных труб Обработка M.hominis

25. Лабораторные исследования - важнейший элемент ведения пациентов с УГИ

27. Этиология заболевания (инфекции) устанавливается на основании результатов прямых лабораторных методов

28. МАНК - Mycoplasma genitalium ПИФ, микроскопия, посев, ИФА-АГ, ИФА-АТ, МАНК Урогенитальный хламидиоз Chlamydia trachomatis (серотипы …) Микроскопия, посев, МАНК Гонорея Neisseria gonorrhoeae Посев, ПИФ, ИФА, МАНК - Ureaplasma urealyticum ( биовар Т-960) Микроскопия, посев, ИФА, МАНК Урогенитальный трихомоноз Trichomonas vaginalis Серология, ТПМ, ПЦР Сифилис Treponema pallidum Методы диагностики Нозологическая форма ( МКБ- X) Возбудитель

29. Какой метод является предпочтительным?

30. Используемые методы диагностики гонореи в КВД РФ (86 лабораторий-100%) * Фриго Н.В., Ротанов С.В. Лесная И.Н., соавт., Вестник дерматологии и венерологии № 5, 2008г. 95-98% (М и Ж) 35% ПЦР 87% 75(%) 96.3 (%) 13 (%)- единст. метод Применение в КВД ? Два метода 95-98 (М) 80-87% (Ж) Бак. посев. 80-95% (М) 30-50% (Ж) Микроскопия (по Граму) ДЧ метода Метод диагностики

31. Используемые методы диагностики хламидиоза в КВД РФ (86 лабораторий-100%) * Фриго Н.В., Ротанов С.В. Лесная И.Н., соавт., Вестник дерматологии и венерологии № 5, 2008г. 50% 79.3% ИФА (серолог.) 10-12% 33 % Микроскопия (по Романовскому) 95-98% 46% ПЦР 87% 3.7% 96.3 % Применение в КВД (%) ? Два метода 60-80% Бак. посев. 40-60% ПИФ ДЧ метода Метод диагностики

32. Используемые методы диагностики трихомониаза в КВД РФ (86 лабораторий-100%) * Фриго Н.В., Ротанов С.В. Лесная И.Н., соавт., Вестник дерматологии и венерологии № 5, 2008г. ? 74% ИФА (серолог.) 10-20% (М) 50-60 (Ж) 100 % Микроскопия 90-96% 35% ПЦР 87% 56% 96.3 % Применение в КВД (%) ?% Два метода 70-95% Бак. посев. 40-60% ПИФ ДЧ метода Метод диагностики

33. Заболеваемость ИППП в РФ Государственная статистическая отчетность Минздравсоцразвития РФ за 2005-2007 г. 91.1 129.500 97.2 138 822 96.1 136 469 Хламидиоз 186.3 264 785 199.5 284 844 215.5 305 884 Трихомоноз 60.8 86 405 63.7 90 974 71.7 101 798 Гонококковая инфекция На 100 тыс. населен. Абс. На 100 тыс. населен. Абс. На 100 тыс. населен. Абс. 2007 2006 2005 Нозологическая форма

37. Микроскопия окрашенного препарата доминирующий метод лабораторной диагностики трихомонадной инфекции в РФ. Следовательно – высокая субъективность анализа результатов!

38. Диагностические возможности методов амплификации нуклеиновых кислот на современном этапе

39. Полимеразная цепная реакция 1 копия фрагмента ДНК 10 10 -10 12 копий фрагмента ДНК амплификация ( копирование) фрагмента ДНК

40. Диагностика клинических синдромов и скрининг на ИППП

42. Полимеразная цепная реакция 1 копия фрагмента ДНК 10 10 -10 12 копий фрагмента ДНК амплификация ( копирование) фрагмента ДНК

43. Универсальный протокол выявление возбудителей с помощью ПЦР ПЦР на N.gonorrhoeae ПЦР на C.trachomatis ПЦР на T.vaginalis ПЦР на M.genitalium ПЦР на Urealasma

44. Гибридизационно-флуоресцентная детекция – расширение возможностей ПЦР

45. Одновременная амплификация и детекция нескольких мишеней Real-time Joe Fam Rox Cy5

46. Выявление возбудителей ИППП с помощью «АмплиСенс- NG/CT/MG/TV- мультипрайм » ПЦР на: N.gonorrhoeae T.vaginalis C.trachomatis M.genitalium

48. Измерение концентрации ДНК с помощью ПЦР в реальном времени – оценка плотности колонизации возбудителем

50. Проблема подтверждения результатов ПЦР-исследований

51. Выявление C.trachomatis разными методами

52. Выявление C.trachomatis разными методами

53. Screening Tests To Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Infections --- 2002 … Because of the greater sensitivity of NAATs, a NAAT is the only recommended additional test to verify a result from another NAAT… … В связи с более высокой чувствительностью амплификационных методов, верификацию их результатов, следует проводить на основе альтернативных амплификационных тестов…

54. Реакция транскрипционной амплификации NASBA-Real-Time NASBA – N ucleic A cid S equence- B ased A mplification

55. NASBA - Real-Time Leone G., et al, 1998 Линейная фаза (получение первых РНК-ампликонов) Фаза амплификации (экспоненциальное Нарастание количества РНК-ампликонов) РНК-мишень 10-100 копий РНК-ампликоны 10 9 -10 12 копий

57. Достоверность лабораторного диагноза NASBA ПЦР + =

58. Выявление C.trachomatis разными методами

59. Гонококковая инфекция: МАНК 1 МАНК 2 ≈ + Бак. Посев * Harrison`s Principles of Internal Medicine 16 th Edition , 2006 … Two positive NAATs, each targeting a different nucleic acid sequence, may be substituted for culture of the cervix or the urethra as legal evidence of infection... * Кроме случаев обследования детей и образцов экстрагенитальной локализации

60. N.gonorrhoeae: ПЦР, посев + NASBA N= 213 Истинно положительные результаты n= 59 Совместно с С.В. Сехиным и соавт., 2005

63. Особенности эрадикации C.trachomatis при терапии разными препаратами A.Savicheva et al., 2006г. Джозамицин Доксициклин Окончание приема Окончание приема

64. Амплификация и автоматический анализ результатов ПЦР и НАСБА Контроль теста Полож. пробы Отриц. пробы

66. Спасибо за внимание!