Download luận văn thạc sĩ ngành di truyền học với đề tài: Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể Bách xanh tự nhiên (Calocedrus macrolepis Kurz) ở Tây Nguyên

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lê Thị Quỳnh
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ
BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS
MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lê Thị Quỳnh
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ
BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS
MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số : 60420121
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Đinh Thị Phòng
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Hà Nội – 2015

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung
thực và chƣa đƣợc sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015
Học viên
Lê Thị Quỳnh

4. LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Đinh Thị
Phòng đã tận tình, hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng cũng
nhƣ thực hiện nghiên cứu để thoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt
Nam, toàn thể cán bộ Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen đã
giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và
hoàn thiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Tiến Hiệp đã cung cấp mẫu cho
nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của trƣờng Đại
học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tâm truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt khóa học.
Luận văn này là một phần kết quả của đề tài TN3/T15 thuộc Chƣơng trình
Tây Nguyên 3. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Chƣơng trình.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên khích lệ của gia đình, bạn
bè và các đồng nghiệp trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015
Học viên
Lê Thị Quỳnh

5. 1
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................3
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................5
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................7
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................9
1.1. Giới thiệu tổng quát về loài Bách xanh................................................................9
1.1.1. Vị trí phân loại Bách xanh ................................................................................9
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Bách xanh ..................9
1.1.3. Tình hình phân bố Bách xanh ở Việt Nam .....................................................11
1.2. Tính đa dạng di truyền giữa các quần thể thực vật ............................................12
1.2.1. Khái niệm về quần thể thực vật.......................................................................12
1.2.2. Tính đa dạng di truyền của quần thể thực vật .................................................13
1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thƣờng đƣợc dùng trong nghiên cứu đa dạng
di truyền ở thực vật ...................................................................................................13
1.3.1. Kỹ thuật isozyme.............................................................................................13
1.3.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).............................14
1.3.3. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)......................15
1.3.4. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).......................15
1.3.5. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) .......................................................16
1.3.6. Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) .............................................17
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về đa dạng di truyền ở thực vật .....17
1.4.1. Thế giới ...........................................................................................................17
1.4.2. Trong nƣớc......................................................................................................18
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................22
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................22
2.2. Nội dung nghiên cứu..........................................................................................26
2.3. Địa điểm nghiên cứu ..........................................................................................26
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................26

6. 2
2.4.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ 70 mẫu Bách xanh .........................26
2.4.2. Phƣơng pháp nhân bản PCR ...........................................................................27
2.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu ...........................................................................27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................29
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số loài Bách xanh ...............................................29
3.2. Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ
thị ISSR .....................................................................................................................29
3.2.1. Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị ISSR ..........................29
3.2.2. Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR.......34
3.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR ...36
3.2.4. Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với
chỉ thị ISSR .............................................................................................................39
3.3. Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ
thị SSR.......................................................................................................................39
3.3.1. Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị SSR............................39
3.3.2. Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR..............43
3.3.3. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh của 3 quần thể Bách xanh
phân tích với chỉ thị SSR...........................................................................................48
3.3.4. Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với
chỉ thị SSR .............................................................................................................50
3.4. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR ...51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................58
1. KẾT LUẬN...........................................................................................................58
2. KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................59

7. 3
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin của các mẫu thu nghiên cứu phân tử........................................22
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 30 mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu.............23
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của 17 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu........24
Bảng 3.1. Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Bách xanh phân tích
với 30 mồi ISSR........................................................................................................30
Bảng 3.2. Thông số đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị
ISSR ..........................................................................................................................34
Bảng 3.3. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh
phân tích với chỉ thị ISSR .........................................................................................36
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng di truyền (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo
Nei (1973) giữa các quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR........................36
Bảng 3.5. Giá trị PIC, đa dạng gen trong một locus và tỷ lệ phân đoạn đa hình của
70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR............................................................42
Bảng 3.6. Một số thông số đa dạng di truyền của từng quần thể Bách xanh phân tích
với chỉ thị SSR ..........................................................................................................44
Bảng 3.7. Một số thông số di truyền chính của quần thể Bách xanh phân tích với 17
cặp mồi SSR..............................................................................................................46
Bảng 3.8. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh
phân tích với 17 cặp mồi SSR...................................................................................47
Bảng 3.9. Hệ số tƣơng đồng (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973)
giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR...............................................48
Bảng 3.10. Một số thông số di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ
hợp chỉ thị ISSR+SSR...............................................................................................52
Bảng 3.11. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh
phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR+SSR.....................................................................53
Bảng 3.12. Hệ số tƣơng đồng (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei
(1973) giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR vàSSR ..........53

8. 4
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Bách xanh ở Vƣờn quốc gia Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk ......................10
Hình 2.1. Vị trí thu mẫu các quần thể Bách xanh trong nghiên cứu.........................22
Hình 3.1. DNA tổng số tách từ lá đại diện của một số mẫu Bách xanh điện di trên
gel agarose 0,9% . .....................................................................................................29
Hình 3.2. Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR3
trên gel agarose 1,5% ................................................................................................32
Hình 3.3. Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR62
trên gel agarose 1,5% ................................................................................................33
Hình 3.4. Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR tính
theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA ................................37
Hình 3.5. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị
ISSR...........................................................................................................................38
Hình 3.6. Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm3
trên gel polyacrylamide 5% ......................................................................................40
Hình 3.7. Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm7
trên gel poly acrylamide 5% .....................................................................................41
Hình 3.8. Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR tính
theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA ................................49
Hình 3.9. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ
thị SSR.......................................................................................................................50
Hình 3.10. Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh
phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR tính theo phƣơng pháp của Jacccard và
kiểu phân nhóm UPGMA..........................................................................................54
Hình 3.11. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với
chỉ thị ISSR và SSR ..................................................................................................55

9. 5
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP
Đa hình chiều dài phân đoạn DNA nhân bản (Amplified Fragment
Length Polymorphism)
AOO Phạm vi cƣ trú (Area of Occupancy)
bp Cặp bazơ (Base pair)
BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam
cpSSR
Trình tự lặp lại đơn giản của vùng gen lục lạp (Chloroplasts Simple
Sequence Repeat)
dNTP Deoxyribonucleoside 5‟ Triphosphate
kb 1000 cặp bazơ (Kilobase pair)
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EOO Phạm vi khu phân bố (Estimating Extent of Occurrence)
Genbank Ngân hàng gen quốc tế
CTAB Cetyl Trimethyl Amonium Bromide
DNA Axit Deoxyribo Nucleic (deoxyribonucleic acid)
IUCN
Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (International Union for
Conservation of Nature)
ISSR
Vùng giữa các đoạn trình tự lặp lại đơn giản (Inter Simple Sequence
Repeat)
ITS Vùng sao chép nội bộ (Internal Transcribed Spacer)
mtDNA ADN ty thể (mitochondrion Deoxyribo Nucleoic Axit)
NJ Phƣơng pháp tạo cây phân loại Neighbor Joining (Neighbor Joining)
OD Mật độ quang học (Optical Density)
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)
RAPD
Đa hình các đoạn ADN đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên (Random
Amplified Polymorphic DNA)

10. 6
RFLP
Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn
(Restriction Fragment Length Polymorphism)
SSR Trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat)
TAE Tris Acetate EDTA
TE Tris EDTA
Tm Nhiệt độ biến tính (Melting temperature)
UPGMA
Phƣơng pháp phân cặp nhóm không có trọng số dùng trung bình số học
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)
VQG Vƣờn Quốc gia
VU Sẽ nguy cấp (Vulnerable)

11. 7
MỞ ĐẦU
Tây Nguyên là một trong những vùng giàu loài lá kim nhất Việt Nam. Hầu
hết những loài lá kim ở Tây Nguyên đều là những loài có giá trị khoa học và kinh tế
cao trong đó có loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz). Bách xanh có khu
phân bố rộng với số lƣợng cá thể lớn, nhƣng gần đây đã bị khai thác nhiều để lấy gỗ
và làm bột hƣơng, nên môi trƣờng sống của loài đang bị thu hẹp dần.
Theo số liệu điều tra gần đây nhất của Nguyễn Tiến Hiệp năm 2013, hiện ở
vùng suối Đatanla (Đà Lạt) chỉ còn những cây nhỏ, đƣờng kính dƣới 10cm, ven
thác Darơcao (Đà Lạt) chỉ còn hơn 50 cây có đƣờng kính trên 5cm (số liệu chƣa
công bố). Ƣớc tính cả nƣớc ta hiện tại không còn quá 500 cây Bách xanh có đƣờng
kính trên 10cm [6]. Môi trƣờng sống của Bách xanh cũng đang bị thu hẹp dần do
nạn phá rừng và nạn nƣơng rẫy. Theo tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN)
2014, Bách xanh đƣợc xếp vào bậc bị đe dọa (VU A2cd). Vì vậy, việc bảo tồn hữu
hiệu nguồn gen Bách xanh là nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu. Tuy
nhiên, các nghiên cứu trƣớc đây mới chỉ tập trung vào việc phân loại dựa trên đặc
điểm hình thái và nơi phân bố, còn các nghiên cứu về đa dạng di truyền nguồn gen
vẫn rất hạn chế và mới chỉ tập trung cho một số loài [6], [8]. Đặc biệt các dẫn liệu
về đa dạng nguồn gen di truyền của loài Bách xanh ở Tây Nguyên hầu nhƣ chƣa
đƣợc nghiên cứu.
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, nhiều loại chỉ thị
phân tử đã đƣợc sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen làm cơ sở cho
nghiên cứu bảo tồn và tái tạo nguồn gen ở đối tƣợng sinh vật nói chung và ở các
loài cây lá kim nói riêng. Trong các loại chỉ thị thì chỉ thị ISSR (Inter Simple
Sequence Repeat) và SSR (Simple Sequence Repeat) đang đƣợc ứng dụng rộng rãi
và có hiệu quả trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở cả mức độ quần thể và loài
cả trên giới và Việt Nam. Chẳng hạn nhƣ Wang và cộng sự (2004) đã sử dụng chỉ
thị ISSR phân tích đa dạng di truyền của 5 quần thể Bách xanh ở Tây Nam Trung
Quốc [56] và đã chỉ ra tỉ lệ locus đa hình P = 26,9%. Hay năm 2010, Wang và Hao
cũng đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 13 quần thể thông

12. 8
tự nhiên ở Trung Quốc (Pinus tabulaeformis Carr.) [55]. Kết quả chỉ ra rằng mức độ
biến đổi di truyền trong quần thể Thông ở Trung Quốc chủ yếu duy trì bên trong
quần thể. Sự đa dạng di truyền có xu hƣớng giảm từ quần thể trung tâm đến quần
thể trung gian và quần thể biên. Cả hai yếu tố phân bố tự nhiên và hoạt động của
con ngƣời đều ảnh hƣởng đến sự hình thành cấu trúc di truyền của loài này. Tuy
nhiên, ở Việt Nam cho đến nay mới chỉ có nhóm tác giả Vũ Thị Thu Hiền và cộng
sự (2009) đã sử dụng chỉ thi RAPD và cpDNA để nghiên cứu đa dạng di truyền của
20 mẫu Bách xanh thu đƣợc Hà Nội, Lâm Đồng, Quảng Bình. Kết quả phân tích đã
chỉ ra các mẫu phân tích có hệ số di truyền dao động từ 0,75 đến 1, kết quả thu đƣợc
còn cho thấy tính bảo thủ di truyền rất cao trong hệ gen lục lạp ở loài Bách xanh [5].
Xuất phát từ các cơ sở khoa học trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu
đa dạng di truyền quần thể Bách xanh tự nhiên (Calocedrus macrolepis Kurz) ở
Tây Nguyên” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau:
- Xác định mức độ đa dạng nguồn gen di truyền cho 3 quần thể Bách xanh tự
nhiên thu tại 3 tỉnh Lâm Đồng, Đắk Lắk và Gia Lai ở Tây Nguyên bằng chỉ thị
ISSR và SSR làm cơ sở cho nghiên cứu giải pháp khai thác, bảo tồn và tái tạo
nguồn gen.
- Xây dựng cây phát sinh chủng loại quần thể loài Bách xanh trên cơ sở phân
tích chỉ thị ISSR và SSR.

13. 9
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quát về loài Bách xanh
1.1.1. Vị trí phân loại Bách xanh
Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) là loài cây thân gỗ, thân thẳng,
phân cành sớm và phân tán rộng. Bách xanh phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc và
vùng núi đất phía Nam, trong các cánh rừng nguyên sinh rậm thƣờng xanh hỗn giao
nhiệt đới gió mùa núi thấp và ở độ cao 800 - 1500m trên mặt biển. Theo phân loại
khoa học, Bách xanh thuộc:
Giới (regnum): Plantae
Ngành (phylum): Pinophyta
Lớp (class): Pinopsida
Bộ (order): Pinales
Họ (familia): Cupressaceae
Chi (genus): Calocedrus
Loài (species): macrolepis
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Bách xanh
Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) là loài cây gỗ lớn, thƣờng xanh,
chiều cao từ 20 – 25m có khi trên 30m, đƣờng kính 0,6 – 0,8m [8]. Vỏ màu nâu
sẫm, nứt dọc sau bong mảng, vết vỏ đẽo màu hồng dày 4 – 10mm có nhiều sợi dài.
Cành lớn xoè rộng, cành non dẹt, mọc cách, xếp thành mặt phẳng. Lá hình vảy mọc
đôi, từng đôi xếp lợp lên nhau, đôi ở giữa lớn hơn, dài 5mm, đôi ở mép gấp nếp, dài
2mm. Mặt trên màu xanh thẫm mặt dƣới có nhiều phấn trắng. Nón đơn tính cùng
gốc, mọc lẻ đầu cành. Nón đực hình trứng dài, mang 6 – 8 đôi nhị. Nón cái hình
trứng trái xoan, dài 12 – 15mm, rộng 4mm mang 3 đôi vảy nón. Thƣờng chỉ đôi vảy
ở giữa mang 2 noãn. Khi chín vảy nón hoá gỗ, hạt có 2 cánh, cánh lớn hình trứng,
cánh nhỏ hình dải. Hạt rụng tháng 10 – 12 (hình 1.1). Tái sinh bằng hạt tốt, đặc biệt
ở nơi có nhiều ánh sáng. Cây con mọc nhiều nhƣ mạ nhƣng chỉ một số rất ít phát
triển thành cây trƣởng thành. Ở Việt Nam, Bách xanh đƣợc phân bố tự nhiên ở
nhiều tỉnh thành trên cả nƣớc, thƣờng mọc thành đám nhỏ hoặc rải rác trên độ cao

14. 10
900 – 1100m vùng Ba Vì (Hà Tây) và Đà Lạt (Lâm Đồng). Trên thế giới, loài Bách
xanh đƣợc phân bố ở nhiều quốc gia nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ và Thái
Lan.
Bách xanh là loài có giá trị kinh tế cao, gỗ thƣờng dùng trong xây dựng nhà
cửa, đóng đồ gỗ cao cấp, tiện đồ mỹ nghệ và làm đồ dùng văn phòng. Hơn nữa gỗ
Bách xanh có mùi thơm dịu nên còn đƣợc dùng làm bột hƣơng. Ngoài ra cây có
dáng đẹp, có thể trồng làm cảnh.
Hình 1.1. Cây Bách xanh ở Vƣờn quốc gia Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk
(A: Cây trƣởng thành, B: tiêu bản của loài) (Ảnh: Nguyễn Tiến Hiệp, 2013)
Hiện nay, môi trƣờng sống của Bách xanh đang bị thu hẹp dần do nạn phá
rừng và nạn nƣơng rẫy. Bách xanh tái sinh bằng hạt tốt nhƣng tỷ lệ cây con sống sót
rất thấp. Những cá thể Bách xanh hiện nay nếu còn trong tự nhiên với độ tuổi rất cổ,
hơn 400 năm tuổi. Vì thế số lƣợng cây con không đủ thay thế cho lớp cây trƣởng
AB

15. 11
thành già cỗi và những cây bị khai thác vì mục đích thƣơng mại. Bách xanh đang có
nguy cơ tuyệt chủng trên phạm vi toàn cầu. Vùng suối Đatanla (Đà Lạt) chỉ còn
những cây nhỏ đƣờng kính dƣới 10cm, ven thác Darơcao (Đà Lạt) chỉ còn hơn 50
cây có đƣờng kính trên 5cm, ƣớc tính cả nƣớc ta hiện tại không còn quá 500 cây
Bách xanh có đƣờng kính trên 10cm. Cần gấp rút khoanh vùng bảo vệ và đƣa vào
gieo trồng ở một số nơi quanh Đà Lạt và trên đỉnh núi Ba Vì [2]. Theo Tổ chức Bảo
tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2014, Bách xanh đƣợc xếp vào bậc bị đe dọa (VU
A2cd) [6]. Vì vậy, việc bảo tồn hiệu quả nguồn gen Bách xanh là nhiệm vụ cấp
bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu.
1.1.3. Tình hình phân bố Bách xanh ở Việt Nam
Ở Việt Nam, Bách xanh đƣợc ghi nhận có cả ở các vùng núi đá vôi phía Bắc
và các núi đất phía Nam. Các quần thể phía Nam Việt Nam phân bố ở Đắk Lắk,
Lâm Đồng, Khánh Hòa và Ninh Thuận). Những cây trên các vùng núi đá vôi ở phía
Bắc (Sơn La, Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Kạn, Hòa Bình và Nghệ An) cho thấy sự
khác nhau về hình thái của các bộ phận sinh dƣỡng. Đó có thể là điều kiện môi
trƣờng khắc nghiệt hơn hoặc là một loài khác. Trên thế giới Bách xanh (C.
macrolepis) gặp ở Đông Bắc Myanma, Thái Lan, Lào và Đông Nam Trung Quốc
[6].
Bách xanh gặp thành từng đám nhỏ trong các rừng nguyên sinh rậm thƣờng
xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp (nhiệt độ trung bình năm 15 - 200
C, lƣợng
mƣa trên 1500mm) ở độ cao 800 – 1500m trên mặt biển, ở các loại đất sét.
Mối đe dọa chính đối với loài Bách xanh là việc khai thác quá mức để lấy gỗ
trên toàn bộ vùng phân bố của loài. Ở phía Nam Việt Nam, đặc biệt là ở Tây
Nguyên, Bách xanh còn bị đe dọa tuyệt chủng do các khu rừng bị chia cắt, lửa rừng
và do chuyển đổi nơi sống của cây thành đất nông nghiệp. Bách xanh đã đƣợc xếp
vào nhóm IIA của Danh mục các loài động vật và thực vật quí hiếm [6] nên việc
khai thác bị luật pháp hạn chế. Để bảo tồn loài Bách xanh, Sở Khoa học và Công
nghệ tỉnh Lâm Đồng đã giao cho xí nghiệp giống Lâm nghiệp vùng Tây Nguyên và
Dự án giống Lâm nghiệp Việt Nam có nhiệm vụ nhân giống một số loài cây lâm

16. 12
nghiệp trong đó có Bách xanh để cung cấp cây con phục vụ cho việc trồng bổ sung
cho rừng nguyên sinh. Các quần thể Bách xanh chính đƣợc xác định nằm ngoài các
khu bảo tồn nhƣng vẫn thuộc diện rừng phòng hộ nhƣ ở khu vực Thƣợng Đa Nhim
(Lâm Đồng), Tân Tiến (Ninh Thuận), Khánh Sơn (Khánh Hòa). Vì việc khai thác
loài cây này bị luật pháp hạn chế nên cần nâng cao nhận thức về bảo tồn tại các khu
vực này [6], [8].
1.2. Tính đa dạng di truyền giữa các quần thể thực vật
1.2.1. Khái niệm về quần thể thực vật
Quần thể là tập hợp các cá thể trong cùng một loài, cùng sinh sống trong một
khoảng không gian xác định, vào một thời gian nhất định, có khả năng sinh sản và
tạo thành những thế hệ mới [1]. Quần thể là một tổ chức sinh học ở mức cao, đƣợc
đặc trƣng bởi những tính chất mà cá thể không bao giờ có nhƣ cấu trúc về giới tính,
về tuổi, mức sinh sản, mức tử vong – sống sót và sự dao động số lƣợng cá thể của
quần thể. Do là một nhóm cá thể của loài nên những loài nào có vùng phân bố hẹp,
điều kiện môi trƣờng khá đồng nhất thƣờng hình thành một quần thể.
Những quần thể nội phối điển hình là các quần thể thực vật tự thụ phấn, động
vật tự thụ tinh. Các quần thể thực vật tự thụ phấn gồm những dòng có kiểu gen khác
nhau. Tự phối hay giao phối gần gọi chung là nội phối làm cho quần thể dần dần bị
phân thành những dòng thuần có kiểu gen khác nhau. Trải qua nhiều thế hệ nội
phối, các gen ở trạng thái dị hợp chuyển sang trạng thái đồng hợp. Số thể dị hợp
giảm dần, số thể đồng hợp tăng dần. Quần thể thực vật sinh sản bằng thụ phấn cận
noãn sẽ dẫn đến sự khác nhau về di truyền giữa các quần thể là lớn, mất tính đa
dạng di truyền và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ.
Giao phối ngẫu nhiên (ngẫu phối) giữa các cá thể trong quần thể là nét đặc
trƣng của quần thể giao phối. Trong quần thể ngẫu phối nổi lên mối quan hệ phụ
thuộc lẫn nhau giữa các cá thể về mặt sinh sản. Vì vậy quần thể giao phối đƣợc xem
là đơn vị sinh sản, đơn vị tồn tại của loài trong tự nhiên. Chính mối quan hệ về sinh
sản là cơ sở đảm bảo cho quần thể tồn tại trong không gian và qua thời gian. Quần
thể giao phối nổi bật ở đặc điểm đa hình. Quá trình giao phối là nguyên nhân làm

17. 13
cho quần thể đa hình về kiểu gen, do đó đa hình về kiểu hình. Thụ phấn chéo có thể
sản sinh những cá thể lai đa dạng. Cấu trúc di truyền của những cá thể này có nhiều
cơ hội đóng góp vào tính đa dạng trong quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao
trong hoàn cảnh môi trƣờng sống.
Tác động của con ngƣời đến môi trƣờng sống làm phá vỡ cấu trúc quần thể, mất
tính đa dạng, số cá thể còn lại ít sẽ không đủ sức hỗ trợ cho sự tồn tại của một quần thể,
quần thể dễ bị tiêu diệt, tuyệt chủng vì những thay đổi bất thƣờng. Tính đa dạng di
truyền của những quần thể này thấp nên khó thích nghi với các biến động khí hậu.
1.2.2. Tính đa dạng di truyền của quần thể thực vật
Đa dạng sinh học là sự phong phú về gen, loài sinh vật và hệ sinh thái trong
tự nhiên. Đa dạng loài là số lƣợng và sự đa dạng của các loài đƣợc tìm thấy tại một
khu vực nhất định của một vùng nào đó. Đa dạng loài là tất cả sự khác biệt trong
một hay nhiều quần thể của một loài cũng nhƣ đối với quần thể của các loài khác
nhau. Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền đƣợc
trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa
dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài,
các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình
tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền.
Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài xử lý những biến đổi bất lợi của
môi trƣờng sống và có khả năng tự phục hồi trong môi trƣờng sống của chúng [1].
Nhƣ vậy, đa dạng di truyền đƣợc đề cập đến nhƣ là mức độ đa hình của mỗi cá thể
trong suốt thời gian sống của nó, hoặc đƣợc phản ánh bởi số alen của quần thể tại
một nơi và thời gian cụ thể hoặc số alen của một loài trong phạm vi phân bố địa lý
và lịch sử tồn tại của nó.
1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thƣờng đƣợc dùng trong nghiên cứu đa
dạng di truyền ở thực vật
1.3.1. Kỹ thuật isozyme
Kỹ thuật Isozyme là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme. Phƣơng pháp

18. 14
này đƣợc Hunter và Market đƣa ra từ năm 1957, đƣợc Harris hoàn thiện vào năm
1966 và bắt đầu đƣợc sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay. Di truyền quần thể
cần thiết phải nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến đổi di truyền
trong/giữa các quần thể. Kỹ thuật isozyme đƣợc sử dụng nhƣ dấu phân tử cho mục
tiêu này. Mặc dù hiện nay đã có nhiều kỹ thuật DNA phát triển nhƣng kỹ thuật
isozyme vẫn đƣợc sử dụng vì cách thức thực hiện tƣơng đối nhanh, chi phí thấp,
thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp.
Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA
cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện
khác nhau của môi trƣờng [11].
1.3.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA - Đa hình các đoạn DNA
đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sự
hoàn thiện năm 1991. Phƣơng pháp này sử dụng cùng một số mồi ngẫu nhiên (mồi
ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide gồm khoảng 8 đến 20 nucleotide) để thực
hiện phản ứng PCR nhằm nhân các đoạn DNA đặc trƣng của các mẫu nghiên cứu.
Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu đƣợc
gồm các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về kích thƣớc và cấu trúc. Khi bộ gen của
các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân đƣợc các đoạn khác
biệt nhau [4], [11].
 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần
biết trƣớc trình tự bộ gen của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất
lƣợng DNA khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gian thực hiện nhanh, khả
năng nhân bản cao.Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp. Trong
nghiên cứu, kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao
cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy
cao [12].

19. 15
 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức
độ lặp lại giống nhau thấp). Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả
năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao [11], [12].
1.3.3. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các
đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn). Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các
enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt đƣợc
bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn đƣợc gọi là các “dấu vân tay” đặc trƣng cho từng
phân tử DNA. Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thƣờng đƣợc
sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các cá thể, các loài
sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc
hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật [4], [11].
Kỹ thuật này đƣợc dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay. Kỹ thuật RFLP
đƣợc sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật
Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh
sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật... Kỹ thuật RFLP đƣợc thực hiện trên
nguyên lý cắt enzyme giới hạn. DNA của mẫu nghiên cứu sau khi đƣợc tách chiết và
tinh sạch sẽ đƣợc cắt với cùng 1 số loại enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn sẽ
nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc
khác nhau sẽ cho ra số lƣợng và kích thƣớc các đoạn cắt DNA khác nhau, những bộ
gen giống nhau thì sẽ cho ra số lƣợng, kích thƣớc các đoạn cắt giống nhau, kích thƣớc
và số lƣợng các đoạn cắt này sẽ quan sát đƣợc trên điện di đồ.
1.3.4. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), đƣợc hiểu là
sự đa dạng của các đoạn DNA đƣợc nhân lên có định hƣớng sau khi bị cắt bởi 2 RE,
sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR). Kỹ
thuật này đƣợc Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 và ngay lập tức trở thành 1
công cụ hữu ích để nhận biết nhiều locus trong sự đa hình DNA mà không cần biết

20. 16
trƣớc thông tin về trình tự DNA của chúng. Phƣơng pháp này có thể đƣa ra nhanh
chóng một ƣớc lƣợng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau.
1.3.5. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat)
Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat), còn đƣợc gọi là microsaterlite (vi
vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản, đây là những
trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp bazơ) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ 2 đến 40
đơn vị. Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và thực vật, mật độ
các trình tự dao động rất lớn. Chúng đƣợc phân bố trong hệ gen và có tính đặc trƣng
cho từng loài [11].
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên
là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này
đƣợc nhận dạng, bƣớc tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi. Các
trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. Chỉ thị SSR sau đó đƣợc sử
dụng tƣơng tự nhƣ các mồi RAPD. Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả
năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt đƣợc sự sai khác mà không xác
định đƣợc bằng các mồi khác nhƣ RAPD và RFLP. Phản ứng không quá tốn kém,
tiết kiệm đƣợc thời gian và hoá chất. Mồi sử dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và
dựa trên trình tự đặc trƣng và vì thế đáng tin cậy khi phát hiện cùng một locus và
thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ gen. Chỉ thị SSR là các locus đặc trƣng, nên
cung cấp nhiều thông tin rất có ích cho việc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm.
SSR là loại chỉ thị đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD và trở
thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di
truyền.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại chỉ
thị chỉ đặc trƣng cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách
dòng và đọc trình tự một số lƣợng lớn các đoạn DNA của genome có chứa SSR. Hiện
nay, số lƣợng mồi thiết kế cho các loại cây trồng còn hạn chế, làm giảm hiệu quả của
SSR trong việc lập bản đồ gen. Một vấn đề khác cũng thƣờng gặp phải trong sử dụng
SSR là việc xác định quan hệ giữa các alen với các chỉ thị phân tử là rất khó. SSR có

21. DOWNLOAD ĐỂ XEM ĐẦY ĐỦ NỘI DUNG
MÃ TÀI LIỆU: 50238
DOWNLOAD: + Link tải: Xem bình luận
Hoặc : + ZALO: 0932091562