Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

1. 1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGUYỄN THỊ HÀ LY
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH
LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU HÀ THỦ Ô
ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2013

2. 2
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGUYỄN THỊ HÀ LY
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH
LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU HÀ THỦ Ô
ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. HDC: TS. PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG
2. HDP: PGS.TS TẠ THỊ THẢO
Hà Nội - 2013

3. 3
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phƣơng Thiện Thƣơng và
PGS.TS Tạ Thị Thảo đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong
suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu và
các anh chị, các bạn công tác tại khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu
đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong môi trƣờng hiện
đại.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá
trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá
k22, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm hoá phân tích k22 đã giúp đỡ, chia sẻ
những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, tháng 12 năm 2013
Học viên
Nguyễn Thị Hà Ly

4. 4
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….. 01
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................ 03
1.1.Tổng quan về dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………………………... 03
1.1.1 Cây hà thủ ô đỏ……………………………………………………... 03
1.1.2 Dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………………………………. 04
1.1.2.1 Thành phần hoá học………………………………………… 04
1.1.2.2 Công dụng và tác dụng sinh học của hà thủ ô đỏ…………... 05
1.2. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học……………. 07
1.2.1 Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học của dƣợc liệu ……. 07
1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dƣợc liệu hà thủ ô đỏ ………….. 08
1.2.3 Kiểm nghiệm dƣợc liệu hà thủ ô đỏ….…………………………….. 11
1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu……………………………………. 12
1.4. Các vấn đề cần giải quyết………………………………………………….. 13
1.5. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………….. 14
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM.................................................................................... 15
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………... 15
2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị………………………………………………. 16
2.2.1 Chất chuẩn………………………………………………………….. 16
2.2.2 Hóa chất…………………………………………………………….. 17
2.2.3 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………. 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.…………...……………………………………... 18
2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn và mẫu đối chiếu………………….. 18
2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………….. 18
2.3.3 Phƣơng pháp phân tích……………………………………………... 19
2.4. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích………… 21
2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho quá trình phân
tích HPLC………………………………………………………………… 21

5. 5
2.4.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích…………………………………… 22
2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại……………………………. 22
2.4.2.2 Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp………………………... 22
2.4.3 Phân tích mẫu thực tế………………………………………………. 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 24
3.1. Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký……………... 24
3.1.1 Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu….….. 24
3.1.2 Khảo sát thành phần pha động……………………………………... 25
3.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng pH của pha động và loại axit dùng trong pha
động………………………………………………………………………. 32
3.1.4 Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu tiêm vào cột………………… 36
3.1.5 Điều kiện tối ƣu cho quá trình tách các anthaquinon và stilben……. 38
3.1.6 Định tính các hợp chất THSG, RV và EM trong mẫu hà thủ ô đỏ…. 38
3.2. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng…………………. 39
3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn……………. 39
3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng…………………………. 42
3.2.3 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn……………………………….. 43
3.2.3.1 Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0…... 43
3.2.3.2 Kiểm tra sự sai khác giữa b và b′…………………………… 45
3.3. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………. 46
3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết………………………………………. 47
3.3.2 Khảo sát phƣơng pháp chiết siêu âm……………………………….. 48
3.3.2.1 Khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm…………………………….. 48
3.3.2.2 Khảo sát thời gian chiết siêu âm……………………………. 48
3.3.3 Khảo sát phƣơng pháp chiết hồi lƣu………………………………... 49
3.3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết hồi lƣu…………….. 49
3.3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết và số lần chiết…….. 50
3.3.4 Phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ……………………... 51
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích………………………………………….. 52

6. 6
3.4.1 Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp……………………………….. 52
3.4.1.1 Đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp……………………… 52
3.4.1.2 Đánh giá sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm
chuẩn………………………………………………………………… 54
3.4.2 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại…………………………………….. 55
3.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị……………………………… 55
3.4.2.2 Đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp của
phƣơng pháp phân tích……………………………………………… 56
3.5 Phân tích mẫu thực tế………………………………………………………. 58
3.5.1 Mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ…………………………………………... 58
3.5.2 Mẫu sản phẩm từ hà thủ ô đỏ……………………………………….. 61
BÀN LUẬN…………………………………………………………………….. 63
KẾT LUẬN…………………………………………………………………….. 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO

7. 7
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu phân tích…………………………………………. 16
Bảng 2.2: Chƣơng trình dung môi rửa giải…………………………………………. 21
Bảng 3.1: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH – nƣớc………………….. 27
Bảng 3.2: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với
từng chế độ gradient………………………………………………………………. 27
Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nƣớc…………………… 29
Bảng 3.4: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với
từng chế độ gradient………………………………………………………………... 29
Bảng 3.5: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nƣớc chứa 0,01% axit
photphoric………………………………………………………………………....... 31
Bảng 3.6: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng
với từng chế độ gradient…………………………………………………….. …….. 31
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH (axit axetic)……………………….. 34
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH (axit fomic)……………….............. 34
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH (axit photphoric)………….............. 35
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu tiêm vào cột……………. 37
Bảng 3.11: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất……………………… 40
Bảng 3.12: Phƣơng trình đƣờng chuẩn của các chất……………………………….. 41
Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các chất……………….. 43
Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phƣơng trình đƣờng
chuẩn THSG……………………………………………………………………....... 44
Bảng 3.15: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phƣơng trình đƣờng chuẩn
của THSG…………………………………………………………………………... 45
Bảng 3.16: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi chiết………………………. 47
Bảng 3.17: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết siêu âm……………….. 48
Bảng 3.18: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết siêu âm………………. 49
Bảng 3.19: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết hồi lƣu………………... 50

8. 8
Bảng 3.20: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết và số lần chiết……….. 51
Bảng 3.21: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phƣơng pháp
phân tích THSG…………………………………………………………………….. 54
Bảng 3.22: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phƣơng pháp
phân tích EM……………………………………………………………………… 54
Bảng 3.23: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thêm chuẩn….. 55
Bảng 3.24: Các đại lƣợng thống kê………………………………………………… 55
Bảng 3.25: Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của các chất………………….. 56
Bảng 3.26: Kết quả hàm lƣợng THSG và EM tìm lại đƣợc bằng phƣơng pháp
thêm chuẩn của 3 kỹ thuật viên khác nhau…………………………………………. 56
Bảng 3.27: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân
tích tiến hành bởi ba kỹ thuật viên khác nhau……………………………………… 57
Bảng 3.28: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp lại của phƣơng pháp phân tích……….. 58
Bảng 3.29: Kết quả phân tích mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………….. 59
Bảng 3.30: Kết quả phân tích mẫu sản phẩm hà thủ ô của công ty Traphaco……… 61

9. 9
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh cây hà thủ ô đỏ……………….……………………………….. 03
Hình 1.2: Hình ảnh dƣợc liệu và phiến dƣợc liệu hà thủ ô đỏ……………………... 04
Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số thành phần hóa học trong dƣợc liệu hà thủ ô
đỏ…………………………………………………………………………………… 05
Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu hà thủ ô đỏ và sản phẩm từ hà thủ ô đỏ……………. 16
Hình 3.1: Phổ UV-VIS của các chất……………………………………………….. 24
Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với
hệ dung môi MeOH – nƣớc………………………………………………………... 28
Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với
hệ dung môi ACN – nƣớc…………………………………………………………. 30
Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với
hệ dung môi ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric…………………………... 32
Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính THSG, RV, EM trong mẫu hà thủ ô đỏ…………… 39
Hình 3.6: Khoảng tuyến tính………………………………………………………. 40
Hình 3.7: Đƣờng chuẩn các chất…………………………………………………... 41
Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng THSG (A) và EM (B) trong các
mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………………………………………….. 60
Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng THSG (A) và EM (B) trong mẫu
thuốc T-TPC………………………………………………………………………... 62

10. 10
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt Tên đầy đủ
AC Aceton
ACN Acetonitril
Abs Absorbance: Độ hấp thụ quang
AS Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic
BuOH n-Butanol
DĐVN Dƣợc Điển Việt Nam
DĐTQ Dƣợc Điển Trung Quốc
EM Emodin
EtOH Etanol
GC Gas chromatography: Sắc ký khí
HPLC
High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu
năng cao
HPLC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ
HPLC-DAD/FLD Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và phát quang
HPLC-DAD-
APCI/MSn
Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và khối phổ với hệ ion
hóa hóa học ở áp suất khí quyển
LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng
MeOH Metanol
PDA Photo-diode-array: Mảng điot điện tử
ppm Parts per million: Phần triệu
ppb Parts per billion: Phần tỷ
ppt Parts per trillion: Phần nghìn tỷ
R Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan
RS Resolution: Độ phân giải
RP-HPLC Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo
% RSD % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối
% RSDR
% Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái
lặp tƣơng đối
RV Resveratrol
SD Standard deviation: Độ lệch chuẩn
tR Retention time: Thời gian lƣu
THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-Glucosid
UV-VIS Ultraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiến
VWD Variable Wavelength Detector
IR Infrared: Hồng ngoại

11. 11
MỞ ĐẦU
Từ ngàn xƣa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn cây cỏ phong phú xung
quanh để làm thuốc trị bệnh, bồi bổ cơ thể, tăng cƣờng sức khỏe. Các dƣợc liệu quý
đã đƣợc ghi chép thành các bài thuốc cổ truyền với nhiều tác dụng quý báu. Một
trong số các dƣợc liệu quý đó là hà thủ ô đỏ. Trong một số tài liệu ghi chép còn lƣu
giữ, hà thủ ô đỏ đƣợc coi nhƣ vị thuốc trƣờng sinh, có khả năng làm ngƣời già thành
trẻ, tóc bạc lại đen. Theo quan điểm của y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có nhiều tác
dụng quý nhƣ bổ huyết, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng,
giúp ích cho sự tiêu hoá. Y học hiện đại còn phát hiện hà thủ ô đỏ có tác dụng làm
giảm lƣợng đƣờng trong máu, có tác dụng tốt đối với các trƣờng hợp suy nhƣợc
thần kinh và bệnh về thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của
ruột, có tác dụng chống viêm. Do đó, hà thủ ô đỏ đƣợc sử dụng rộng rãi để làm
thuốc phục vụ đời sống con ngƣời từ xƣa đến nay.
Tuy nhiên, hiện nay trên thị trƣờng, vị thuốc quý này đang bị giả mạo bằng
một số loại rễ củ nhƣ: hà thủ ô trắng, củ nâu, củ cọc... hoặc tình trạng ngƣời sử dụng
mua phải dƣợc liệu rác đã bị chiết hết các hoạt chất, gây ảnh hƣởng đến sức khoẻ
ngƣời bệnh và quyền lợi ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá chất
lƣợng, tiêu chuẩn hoá dƣợc liệu hà thủ ô đỏ là vấn đề hết sức cần thiết.
Ở Việt Nam, qui định chính thống việc kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ
ô đỏ còn rất sơ sài. Chuyên luận hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV (2009)
chỉ quy định hàm lƣợng chất chiết đƣợc trong etanol 30%, tiêu chí đánh giá này
không phản ánh đƣợc chính xác chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Trên thế giới đã
có rất nhiều công trình nghiên cứu về phƣơng pháp phân tích định tính, định lƣợng
dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Trong đó, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
thƣờng đƣợc sử dụng nhất bởi độ nhạy tốt, phù hợp với đối tƣợng phân tích là dƣợc
liệu và giá thành không quá cao. Dƣợc Điển Trung Quốc (2010) có sử dụng phƣơng
pháp này để định lƣợng hai thành phần emodin và 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-
β-D-glucosid trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, là tiêu chí đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu
hà thủ ô đỏ.

12. 12
Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định
tính, định lƣợng các hoạt chất chính trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson” chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện HPLC
thích hợp để định tính, định lƣợng các hoạt chất chính trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ.
Sau đó, áp dụng phƣơng pháp này để đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ và
các sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ. Kết quả của nghiên cứu này nhằm gợi ý cho
việc nâng cấp chuyên luận dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV.
Mục tiêu nghiên cứu:
 Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính ba hợp chất 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-
2-O-β-D-glucosid (THSG), resveratrol (RV) và emodin (EM) trong dƣợc liệu hà
thủ ô đỏ.
 Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất THSG và EM trong dƣợc
liệu hà thủ ô đỏ.
 Đánh giá hàm lƣợng THSG và EM trong một số mẫu hà thủ ô đỏ thu hái tại các
vùng khác nhau và trong sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ.

13. 13
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dƣợc liệu hà thủ ô đỏ
1.1.1 Cây hà thủ ô đỏ
Hà thủ ô đỏ có tên khoa học là: Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson,
thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chƣớng (Caryophyllales), còn có một số
tên khác nhƣ: dạ giao đằng, dạ hợp...
Cây hà thủ ô đỏ là loại dây leo, sống nhiều năm. Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn
vào nhau. Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên có hình giống nhƣ củ khoai
lang. Lá mọc so le, hình mũi tên, gốc hình tim, đầu thuôn nhọn, dài 5-8 cm, rộng 3-
4 cm; 3-5 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; cuống dài
khoảng 2 cm, phủ lông tơ, bẹ chìa mỏng, ngắn, có lông dài. Cụm hoa mọc ở kẽ lá
hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bấc ngắn; hoa nhỏ nhiều, màu
trắng; nhị 8, thƣờng dính vào gốc của bao hoa. Quả hình 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm
trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng. Mùa hoa từ tháng
9-11; mùa quả từ tháng 12-2 hàng năm. Bộ phận dùng là rễ củ của cây [3],[8].
Hình 1.1: Hình ảnh cây hà thủ ô đỏ
Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số vùng núi cao (từ 1000 m trở lên)
phía bắc, mọc nhiều ở Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La. Các tỉnh ít gặp hơn
nhƣ Hòa Bình (Mai Châu, Đà Bắc), Thanh Hóa (Sơn Bá Mƣời), Nghệ An (Kỳ Sơn),
Lạng Sơn (núi Mẫu Sơn), Cao Bằng (Bảo Lạc), Yên Bái (Mù Cang Chải). Hà thủ ô
đỏ là loại cây ƣa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ƣa
sáng và có thể hơi chịu bóng. Nơi mọc tự nhiên thích hợp nhất là các quần thể rừng

14. 14
núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm dƣới 20o
C. Hà thủ ô
đỏ thƣờng mọc ở đất ẩm, xốp, nhiều mùn, nhất là loại ở chân núi đá [3].
Hà thủ ô đỏ ra quả hàng năm, mỗi cây có thể ra nhiều quả. Sau khi quả già,
phần thân leo trên mặt đất làm hạt giống phát tán xung quanh và sẽ nảy mầm vào
mùa xuân hè năm sau [8].
1.1.2 Dược liệu hà thủ ô đỏ
Dƣợc liệu hà thủ ô đỏ (Radix Fallopia multiflora) là phần rễ củ phơi hay sấy
khô của cây Hà thủ ô đỏ [1], có dạng hình củ tròn, hoặc hình thoi, không đều, củ
nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to. Mặt
ngoài có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành. Mặt cắt ngang có lớp
bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ.
Vị chát [1].
Hình 1.2: Hình ảnh dược liệu và phiến dược liệu hà thủ ô đỏ
1.1.2.1 Thành phần hoá học
Qua nghiên cứu các nhà khoa học thấy rằng trong hà thủ ô đỏ có chứa một số
thành phần sau: anthraquinon nhƣ: emodin, chrysophanol, physcion, citreorosein,
chrysophanol-8-O-β-D-glucosid, physcion-8-O-β-D-glucosid, emodin-8-O-β-D-
glucosid, emodin-1,6-dimethylether, questin, questinol, 2-acetylemodin, 2-methoxy-
6-acetyl-7-methyljuglon, emodin-8-O-(6′-O-malonyl)-glucosid; các dẫn xuất stilben
nhƣ: resveratrol, 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, 2,3,5,4′-
tetrahydroxystilben- 2,3-di-O-β-D-glucosid [23]; protid; tinh bột; lipid; chất vô cơ;
các chất tan trong nƣớc, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin). Trong đó,
2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid và emodin là các thành phần chính

15. 15
trong hà thủ ô đỏ. Dƣợc Điển Trung Quốc (2010) quy định hàm lƣợng 2,3,5,4′-
tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid không đƣợc thấp hơn 1,0%, hàm lƣợng
emodin và physcion không đƣợc thấp hơn 0,1%. Đặc biệt, hàm lƣợng các hoạt chất
này thay đổi rõ rệt sau khi chế biến. Lúc chƣa chế, hà thủ ô đỏ chứa 7,68% tanin;
0,25% dẫn chất anthraquinon tự do; 0,8058% dẫn chất anthraquinon toàn phần. Sau
khi chế, còn 3,82% tanin; 0,1127% dẫn chất anthraquinon tự do và 0,2496% dẫn
chất anthraquinon toàn phần [3].
2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-
glucosid
Emodin
Resveratrol Physcion
Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số thành phần hóa học trong dược liệu hà
thủ ô đỏ
1.1.2.2 Công dụng và tác dụng sinh học của hà thủ ô đỏ
Hà thủ ô đỏ có vị đắng chát, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng bổ huyết, cố
tinh, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân xƣơng, nhuận tràng. Nó đƣợc dùng
để điều trị thần kinh suy nhƣợc, ngủ kém, thiếu máu, đau lƣng, mỏi gối, di mộng
tinh, bạch đới, đại tiểu tiện ra máu, mẩn ngứa. Uống lâu làm đen râu tóc đối với
ngƣời bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô, đỡ rụng [3],[4],[8].

16. 16
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, hà thủ ô đỏ sống tƣơi và khô có tác dụng
thông tiểu, giải độc, tiêu ung thũng, chữa táo bón cho phụ nữ sau khi đẻ hoặc ngƣời
già, mụn nhọn, ghẻ lở, tràng nhạc. Hà thủ ô đỏ chế có tác dụng bổ gan thận, ích tinh
huyết, dùng làm thuốc an thần, bổ và tăng lực trong các chứng thân thể suy yếu, hoa
mắt, chóng mặt, tim hồi hộp, nhức đầu, mất ngủ,… Ở Ấn Độ, rễ hà thủ ô đỏ đƣợc
dùng làm thuốc bổ và làm đen tóc [3].
Theo y học hiện đại, hà thủ ô đã đƣợc chứng minh là có tác dụng làm giảm
lƣợng đƣờng trong máu, chống viêm, chống ho, lợi tiểu, điều kinh, hạ sốt, kích
thích tiêu hóa, có tác dụng tốt đối với các trƣờng hợp suy nhƣợc thần kinh, làm tăng
hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, kích thích tiêu hóa, cải thiện dinh
dƣỡng [3].
Trong hà thủ ô đỏ có ba thành phần hóa học có nhiều tác dụng sinh học lý
thú đã đƣợc tìm thấy là 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, emodin,
resveratrol. Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng emodin có nhiều đặc tính
đáng quý nhƣ:
 Tác dụng làm giảm yếu tố gây bệnh tiểu đƣờng typ 2 [16].
 Tác dụng chống một số căn bệnh ung thƣ trong đó có cả ung thƣ tuyến
tụy [25], [29], [20].
 Tác dụng bảo vệ hệ thần kinh, ngăn ngừa độc tính của các glutamat [17].
 Tác dụng an thần, chống rối loạn thần kinh cho bệnh nhân tâm thần phân
liệt. Các anthraquinon là dẫn xuất của emodin giúp cải thiện sự thiếu hụt của chức
năng an thần [33].
 Tác dụng nhanh làm liền vết thƣơng [22].
Các dẫn xuất stilben (2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid,
resveratrol) cũng đƣợc tìm thấy trong hà thủ ô đỏ với nhiều tác dụng sinh học nhƣ:
 Tác dụng chống oxi hóa.
 Điều hòa cân nặng.
 Tác dụng trên tim mạch [22].
 Tác dụng chống dị ứng [32].

17. 17
 Tác dụng kháng viêm [14].
 Tác dụng chống khối u, đặc biệt là ngăn ngừa ung thƣ vú, ở liều thấp
cũng chỉ ra khả năng làm giảm quá trình di căn [13].
Với nhiều công dụng nhƣ vậy, nhu cầu sử dụng của ngƣời tiêu dùng ngày
càng lớn, hà thủ ô đỏ và các sản phẩm từ hà thủ ô đỏ ngày càng xuất hiện nhiều trên
thị trƣờng. Nhằm kiểm soát chất lƣợng hàng hoá, đảm bảo lợi ích cho ngƣời tiêu
dùng, công tác kiểm tra chất lƣợng đóng vai trò vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, việc
kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ ở Việt Nam hiện nay còn rất sơ sài.
Chuyên luận hà thủ ô đỏ - DĐVN IV (2009) chỉ quy định chỉ tiêu định lƣợng chất
chiết đƣợc trong EtOH 30% [1] sử dụng phƣơng pháp cân. Tiêu chí này không đánh
giá đƣợc chính xác chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ và kết quả thu đƣợc có độ tin
cậy không cao, gây khó khăn và hạn chế trong công tác kiểm tra chất lƣợng dƣợc
liệu hà thủ ô đỏ. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng một phƣơng
pháp định lƣợng đồng thời các hoạt chất thuộc nhóm anthaquinon và stilben nhằm
đánh giá đúng chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, gợi ý cho việc nâng cấp chuyên
luận dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV.
1.2.Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học
1.2.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu
Dƣợc liệu là đối tƣợng phân tích có thành phần nền phức tạp. Thông thƣờng,
trong dƣợc liệu không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau, mà
thƣờng chứa một nhóm các chất có tính chất tƣơng đối giống nhau (flavonoid,
anthraquinon, terpenoid, nhóm các dẫn xuất stilben,…). Các chất trong cùng một
nhóm chất đều giống nhau về khung cơ bản, khác nhau một vài nhóm thế hoặc các
thành phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tính chất hoá
học. Chính vì vậy, việc sử dụng các phƣơng pháp quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh
quang,…) để phân tích định lƣợng một thành phần trong dƣợc liệu gặp nhiều khó
khăn và hầu nhƣ là không thể thực hiện đƣợc.
Sắc ký là một trong những phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất thông
dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại. Khác với các phép định lƣợng hoá học,

18. 18
các phƣơng pháp sắc ký cho phép định lƣợng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn
hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dƣợc liệu. Ngƣời ta có thể định lƣợng
một chất hay định lƣợng đồng thời nhiều chất trong một lần định lƣợng nếu chọn
đƣợc điều kiện thích hợp. Các phƣơng pháp sắc ký thƣờng dùng là: sắc ký khí (GC),
sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) [2]. Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp có nhiều
ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dƣợc
liệu nói riêng. Ƣu điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là có thể phân tích nhiều loại
hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký khí
(thƣờng dùng với các đối tƣợng dễ bay hơi). Có thể dùng HPLC để phân tích các
chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi,
từ các chất trung tính tới các chất điện ly,…Trong lĩnh vực dƣợc liệu, HPLC thƣờng
đƣợc sử dụng nhất trong định lƣợng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của
dịch chiết dƣợc liệu bằng việc so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều
kiện phân tích. Với pha tĩnh ngày càng đƣợc hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu
năng tách, detector ngày càng nhạy, HPLC ngày nay có thể dễ dàng phân tích các
chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt [2]. Với mục tiêu đặt ra là xây
dựng một phƣơng pháp phân tích định lƣợng nhanh, chính xác các hợp chất thuộc
nhóm anthraquinon và dẫn xuất stilben trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, chúng tôi lựa
chọn phƣơng pháp nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dược liệu hà thủ ô đỏ
Có rất nhiều kỹ thuật HPLC đã đƣợc dùng để phân tích các chất thuộc nhóm
stilben và anthraquinon nhƣ: HPLC – ESI – MS/MS, HPLC – DAD/FLD, HPLC –
DAD – APCI/MSn,… Các kỹ thuật này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền
nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất. Kỹ thuật
HPLC – UV/VIS khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên vì vậy chúng tôi chọn
phƣơng pháp này để phân tích các thành phần hóa học trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ.
Một số tác giả [24] đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để
xác định EM, THSG, physcion trong mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trên hệ thống HPLC

19. 19
của hãng Agilent, bơm G1311A Quart, bộ đuổi bọt khí G1322A, bộ tiêm mẫu tự
động G1313A và detector PDA. Quá trình phân tích sử dụng cột phân tích pha đảo
Alltima C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm). Hệ dung môi pha động gồm kênh A là
ACN chứa 0,1% axit fomic, kênh B là nƣớc chứa 0,1% axit fomic, sử dụng chế độ
rửa giải gradient:
T (phút) 0 – 8 8 – 20 20 – 25 25 – 35
A (%) 23 23 – 70 70 – 75 75 - 100
Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 20 μl và detector đƣợc đặt tại
bƣớc sóng 290 nm. Kết quả cho thứ tự các chất ra khỏi cột là THSG → EM →
physcion. Tổng thời gian chạy một mẫu là 35 phút. Ngoài ra, nghiên cứu này đã đƣa
ra một phƣơng pháp xử lý mẫu sử dụng 50 ml MeOH và chiết hồi lƣu với 0,3 g mẫu
trong 120 phút. Các tác giả còn khẳng định rằng phƣơng pháp này cho hiệu suất
chiết cao hơn so với các phƣơng pháp chiết soxhlet và chiết siêu âm. Phƣơng pháp
này đã đƣợc thẩm định về tính tuyến tính, độ thu hồi, độ lặp lại và tái lặp lại, độ
chụm, giới hạn định lƣợng và đƣợc dùng để đánh giá chất lƣợng các mẫu dƣợc liệu
hà thủ ô đỏ trên thị trƣờng ở Quảng Đông – Trung Quốc.
Nhóm các tác giả [19] cũng đã sử dụng đồng thời hai phƣơng pháp HPLC-
PDA và HPLC-VWD để tách 13 chất thuộc các nhóm anthraquinon, stilben, axit
phenolic và flavonoid, nhằm đánh giá chất lƣợng 3 loài dƣợc liệu thuộc cùng một
chi là: hà thủ ô đỏ, cốt khí củ và đại hoàng. Các mẫu đƣợc chiết siêu âm bằng
MeOH 70% trong 60 phút, sau đó lọc qua màng cellulose axetat 0,45 μm để thu
đƣợc dịch chạy sắc ký HPLC. Các chất đƣợc dùng để phân tích gồm: axit gallic,
epicatechin, piceid, THSG, sennosid A, sennosid B, RV, aloe-emodin, rhein, EM,
chrysophanol, physcion, emodin-8-O--D-glucosid. Hệ dung môi pha động gồm
kênh A là ACN, kênh B là nƣớc chứa 0,1% axit fomic, chế độ rửa giải gradient:
T (phút) 0 – 2 2 – 4 4 – 10 10 – 11 11 – 14 14 – 21
B (%) 5 - 10 10 - 15 15 15 - 21 21 21 - 29
T (phút) 21 – 23 23 – 25 25 – 26 26 – 28 28 – 30 30 – 32
B (%) 29 - 40 40 – 50 50 50 – 80 80 - 100 100

20. 20
Tốc độ dòng là 0,8 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 5 μl. Đối với hệ HPLC-
PDA, detector đƣợc đặt quan sát tại ba bƣớc sóng 280 nm, 254 nm và 320 nm. Đối
với hệ HPLC-VWD, detector VWD đƣợc đặt theo một chƣơng trình nhƣ sau: 0 – 6
phút (280 nm), 6 – 12 phút (320 nm), 12 – 14,5 phút (254 nm), 14,5 – 18 phút (320
nm), 18 – 24 phút (280 nm), 24 – 32 phút (254 nm). Kết quả cho thấy cả hai kỹ
thuật sử dụng đều cho độ nhạy tốt, có thể xác định các chất có hàm lƣợng cỡ ng
trong mẫu. Kỹ thuật HPLC-PDA vốn đƣợc sử dụng rộng rãi do có thể quan sát tại
nhiều bƣớc sóng sau một lần phân tích và cho ta nhiều thông tin về đối tƣợng phân
tích hơn detector VWD. Tuy nhiên, kỹ thuật HPLC-VWD cho các kết quả về độ
chọn lọc, độ chụm và độ tuyến tính tốt hơn so với kỹ thuật HPLC-PDA. Điều này
đƣợc giải thích bởi sử khác nhau về cấu tạo và sơ đồ truyền ánh sáng trong từng loại
detector [26].
Thêm một nghiên cứu nữa về phƣơng pháp định lƣợng EM và THSG, theo
tài liệu [31], tác giả Yu Jie và các cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phƣơng pháp
HPLC-PDA xác định EM, THSG và physcion trong các mẫu hà thủ ô sống và hà
thủ ô chế. Sử dụng hệ máy Dionex Ultimate 3000 (Dionex Technologies, USA), cột
Zobax SB-C18 (4,6 mm x 250 mm). Pha động gồm kênh A là nƣớc chứa 0,1% axit
photphoric (H3PO4) và kênh B là MeOH, sử dụng chế độ rửa giải gradient:
T (phút) 0 – 5 5 – 10 10 – 15 15 – 20 20 – 25
B (%) 40 - 70 70 - 80 80 – 85 85 - 90 90
Tốc độ dòng là 1 ml/phút, thời gian chạy là 25 phút, nhiệt độ cột là 300
C và detector
đƣợc đặt tại 254 nm. Kết quả thu đƣợc cho thấy hàm lƣợng THSG trong các mẫu hà
thủ ô chế thấp hơn trong các mẫu hà thủ ô sống, ngƣợc lại, hàm lƣợng EM và
physcion thì tăng sau quá trình chế hà thủ ô đỏ. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là sử
dụng MeOH là dung môi rẻ tiền hơn ACN, thời gian phân tích ngắn hơn (25 phút)
so với các nghiên cứu [24],[19].

21. 21
1.2.3 Kiểm nghiệm dược liệu hà thủ ô đỏ
Dƣợc điển là tài liệu chính thống thƣờng đƣợc các đơn vị nghiên cứu, kiểm
nghiệm và sản xuất áp dụng để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu ở Việt Nam
cũng nhƣ các nƣớc khác trên toàn thế giới.
Ở Việt Nam, việc kiểm nghiệm chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thƣờng
đƣợc thực hiện theo chuyên luận hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV (2009)
[1] với các chỉ tiêu nhƣ: mô tả, soi bột, vi phẫu, định tính, định lƣợng chất chiết
đƣợc, độ ẩm, tạp chất và độ tro. Các chỉ tiêu này không phản ánh đƣợc chính xác
chất lƣợng dƣợc liệu, đặc biệt chỉ tiêu định lƣợng chất chiết đƣợc bằng phƣơng
pháp cân không đặc trƣng nên không thể đánh giá chính xác chất lƣợng dƣợc liệu hà
thủ ô đỏ.
Dƣợc Điển Trung Quốc (2010) có qui định sử dụng HPLC để định lƣợng
THSG, EM và physcion trong các mẫu hà thủ ô đỏ. Đối với chỉ tiêu định lƣợng hỗn
hợp antharquinon (EM và physcion), thành phần pha động là MeOH : nƣớc chứa
0,01% axit photphoric (80 : 20), detector UV 254 nm và quy định hàm lƣợng hỗn
hợp anthraquinon không đƣợc thấp hơn 0,1%. Đối với chỉ tiêu định lƣợng THSG,
mẫu chuẩn đƣợc hoà tan trong EtOH, 0,2 g mẫu dƣợc liệu đƣợc chiết hồi lƣu với 25
ml EtOH trong 30 phút. Hệ dung môi pha động sử dụng là ACN : H2O (25 : 75), cột
C18, detector UV 320 nm và quy định hàm lƣợng THSG trong các mẫu hà thủ ô đỏ
không đƣợc thấp hơn 1,0% (tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối). Nhƣợc điểm của
chuyên luận này đó là hai phƣơng pháp sử dụng khác nhau về thành phần pha động,
vì vậy không định lƣợng đồng thời đƣợc các chất trong cùng một lần phân tích [28].
Dƣợc Điển Hồng Kông [18] cũng quy định hàm lƣợng THSG và EM là tiêu
chí định lƣợng để đánh giá chất lƣợng các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Phƣơng pháp
sử dụng là HPLC với hệ dung môi gồm kênh A là nƣớc chứa 0,1% axit photphoric
và kênh B là ACN. Chƣơng trình rửa giải gradient tƣơng đối đơn giản:
T (phút) 0 – 35 35 – 55 55 – 70
B (%) 10 - 40 40 - 100 100

22. 22
Tốc độ dòng là 1 ml/phút, sử dụng cột ODS (4,6 x 250 mm). Ứng với chƣơng trình
này, THSG và EM có thời gian lƣu lần lƣợt là 19,5 phút và 49 phút. Nhận xét thấy
phƣơng pháp này có ƣu điểm là phân tích đồng thời đƣợc cả hai thành phần THSG
và EM, tuy nhiên nhƣợc điểm là thời gian phân tích dài, gây tốn kém về thời gian và
nguyên vật liệu, hoá chất.
1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phƣơng pháp định
lƣợng đó là phƣơng pháp xử lý mẫu. Thông thƣờng, đối với các mẫu thực vật, sử
dụng dung môi hữu cơ hoặc nƣớc để lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật, quá trình
đó gọi là chiết xuất. Sản phẩm thu đƣợc của quá trình này là một dung dịch các chất
tan hoà tan trong dung môi, gọi là dịch chiết [2]. Có nhiều cách chiết, phổ biến nhất
là chiết bằng nƣớc đun sôi, tuy nhiên, trong thực vật có rất nhiều chất không tan
trong nƣớc, khi đó ta phải dùng thay thế bằng các dung môi hữu cơ nhƣ: EtOH,
MeOH, AC, CHCl3,… Hiệu quả của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào bản chất của
chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào,… [2].
Có rất nhiều kỹ thuật chiết khác nhau. Trong phòng thí nghiệm, một số các
phƣơng pháp chiết xuất cổ điển thƣờng đƣợc sử dụng ở quy mô phân tích nhƣ: chiết
soxhlet, chiết hồi lƣu, chiết siêu âm,…Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa
học công nghệ, có nhiều phƣơng pháp chiết khác đƣợc sử dụng với mục đích giảm
lƣợng dung môi, hoá chất sử dụng để tránh độc hại và không gây ô nhiễm môi
trƣờng nhƣ: chiết pha rắn, chiết bằng chất lỏng quá tới hạn,… tuy nhiên, các kỹ
thuật này đều tƣơng đối phức tạp và kinh phí tốn kém, vì vậy khó có thể áp dụng
rộng rãi ở mọi đơn vị kiểm nghiệm.
Với mục đích chiết tách và phân lập chất, các tác giả [12] đã chiết tách và
tinh chế đƣợc 6 hợp chất từ 14,5 kg dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, trong đó có 5 hợp chất
thuộc nhóm stilben glycosid. EtOH 95% là dung môi đƣợc sử dụng để chiết các
chất này ra khỏi dƣợc liệu, cao EtOH 95% đƣợc hòa tan trong nƣớc và chiết lỏng
lỏng với lần lƣợt các dung môi ete dầu hỏa, etylaxetat và BuOH. Phân đoạn BuOH
đƣợc xác định là chứa các hợp chất định tách. Phân đoạn này đƣợc tách sơ bộ bằng

23. 23
cột HP-20 và cột silica gel pha thƣờng trƣớc khi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng
điều chế với cột tách sử dụng là cột pha đảo. Hệ dung môi rửa giải là MeOH – H2O
với tỷ lệ biến đổi dần từ 35 : 65 đến 100 : 0, tại tỷ lệ dung môi MeOH : H2O (35 :
65) thu đƣợc 2 g THSG.
Với mục đích phân tích định lƣợng [30], các tác giả đã sử dụng EtOH 70%
làm dung môi để chiết 2 hợp chất stilben và 6 hợp chất flavonoid ra khỏi nền mẫu
dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Phƣơng pháp chiết siêu âm đƣợc áp dụng sau khi đã khảo sát
các ảnh hƣởng về thời gian chiết, dung môi chiết và tỷ lệ dung môi chiết/dƣợc liệu.
Các tác giả đã khẳng định điều kiện chiết tốt nhất là tại nhiệt độ phòng, thời gian
siêu âm 30 phút và tỷ lệ dung môi chiết/dƣợc liệu là 30 ml/0,5 g. Phƣơng pháp này
đã đƣợc kiểm tra về độ lặp lại, độ đúng, độ thu hồi và đã đƣợc áp dụng để phân tích
các mẫu rễ, thân và lá của cây hà thủ ô đỏ.
Ngoài ra, một số công trình khác [19],[31],[24] sử dụng MeOH hoặc
MeOH/H2O làm dung môi chiết trong quá trình xử lý mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ.
Nhận xét thấy, việc sử dụng EtOH làm dung môi chiết có nhiều ƣu điểm hơn
MeOH, đặc biệt EtOH ít gây độc hại và thân thiện với môi trƣờng hơn, vì vậy có thể
áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất.
1.4. Các vấn đề cần giải quyết
Theo tài liệu [6], tổng nhu cầu sử dụng hà thủ ô đỏ ở nƣớc ta khoảng 500 tấn
khô/năm. Trong đó, riêng công ty Traphaco hàng năm dùng khoảng 100 tấn để sản
xuất thuốc. Nguồn nguyên liệu này một phần đƣợc thu hái tự nhiên ở Việt Nam, còn
lại chủ yếu đƣợc nhập từ Lào, Trung Quốc nên rất dễ bị giả mạo bằng các dƣợc liệu
khác có hình thái khá giống nhƣ: hà thủ ô trắng, củ nâu, củ cọc,... Vì vậy việc kiểm
soát tính đúng và chất lƣợng nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng. Tuy nhiên, việc
kiểm nghiệm chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ ở nƣớc ta vẫn còn nhiều hạn chế dẫn
tới tình trạng ngƣời dân sử dụng nhầm dƣợc liệu hoặc mua phải dƣợc liệu rác đã bị
chiết hết hoạt chất, kém chất lƣợng. Điều này không những gây ảnh hƣởng đến sức
khỏe của ngƣời bệnh, quyền lợi ngƣời tiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi

24. 24
ngƣời khi sử dụng thuốc từ dƣợc liệu nói chung, hà thủ ô đỏ nói riêng, gây tổn hại
cho ngành Y tế và Kinh tế của đất nƣớc.
Trƣớc tình tình đó, việc xây dựng một phƣơng pháp định tính (để kiểm tra
tính đúng) và định lƣợng (để đánh giá chất lƣợng) dƣợc liệu hà thủ ô đỏ là rất cần
thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 03 chất (THSG, EM, RV) dùng làm
chất đánh dấu để xác định tính đúng của dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, và định lƣợng 02
chất (THSG, EM) bằng phƣơng pháp HPLC để nhằm đánh giá chất lƣợng của dƣợc
liệu hà thủ ô đỏ. Các chất đánh dấu đƣợc lựa chọn đều là những chất có hoạt tính
sinh học, rất hay gặp trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ vì vậy, hàm lƣợng của chúng trong
dƣợc liệu sẽ là “thƣớc đo” chính xác để đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ.
Các công trình nghiên cứu [18],[19],[26],[28],[31] đều đƣa ra các phƣơng
pháp HPLC với từng điều kiện khác nhau để phân tích các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô
đỏ, tuy nhiên mỗi phƣơng pháp đều có các ƣu, nhƣợc điểm và chƣa đạt đƣợc các
điều kiện tối ƣu về: định lƣợng đồng thời, thời gian phân tích, giá thành. Vì vậy
trong nghiên cứu này, chúng tôi hƣớng tới xây dựng một phƣơng pháp phân tích
định tính, định lƣợng đồng thời 03 chất bằng HPLC với các ƣu điểm về độ nhạy, độ
lặp lại tốt, thời gian phân tích nhanh và giá thành không quá đắt, để có thế áp dụng
rộng rãi ở mọi đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất.
1.5. Mục tiêu nghiên cứu
 Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính ba hợp chất 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-
2-O-β-D-glucosid (THSG), resveratrol (RV) và emodin (EM) trong dƣợc liệu hà
thủ ô đỏ.
 Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất THSG và EM trong dƣợc
liệu hà thủ ô đỏ.
 Đánh giá hàm lƣợng THSG và EM trong một số mẫu hà thủ ô đỏ thu hái tại các
vùng khác nhau và trong sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ.

25. 25
CHƢƠNG 2 – THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Hầu hết các mẫu hà thủ ô đỏ đều có thành phần THSG, RV và EM với hàm
lƣợng rất khác nhau. Trong đó, hàm lƣợng THSG thƣờng khá lớn (> 1,0%) [25],
hàm lƣợng EM nhỏ hơn nhiều. Một số mẫu có thành phần RV, một số mẫu không
có. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thu
hái tại Hà Giang (là mẫu chứa cả 3 thành phần) để tiến hành các khảo sát nhằm xây
dựng phƣơng pháp phân tích. Từ đó, tiếp tục định lƣợng THSG và EM trong các
mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thu hái tại nhiều vùng khác nhau, mỗi vùng đƣợc lấy 3
mẫu để phân tích. Ngoài ra, chúng tôi phân tích mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ đƣợc
mua trên thị trƣờng và mẫu sản phẩm thuốc từ hà thủ ô của Công ty cổ phần dƣợc
phẩm Traphaco.
Dƣợc liệu hà thủ ô đỏ Radix Fallopia multiflora dùng làm mẫu nghiên cứu
đƣợc thu hái tự nhiên ở các vùng khác nhau ở Việt Nam. Mẫu đƣợc lấy là bộ phận
rễ củ của cây hà thủ ô đỏ. Mẫu thu hái đƣợc rửa sạch, thái lát mỏng (độ dày khoảng
2 – 3 mm), phơi, sấy ở 60o
C đến khô và bảo quản trong túi nilon kín. Các mẫu
nghiên cứu đều đạt theo tiêu chuẩn của DĐVN IV. Mẫu hiện đƣợc lƣu tại khoa Hoá
phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu. Mỗi mẫu đƣợc lấy đồng đều một lƣợng ra
nghiền thành bột mịn kích thƣớc khoảng 1 mm, đủ dùng cho việc nghiên cứu.
Mẫu sản phẩm hà thủ ô của Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm TRAPHACO, kí
hiệu là T-TPC (Xem hình 2.1 và bảng 2.1).
A

26. 26
B
Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu hà thủ ô đỏ (A) và sản phẩm từ hà thủ ô đỏ (B)
Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu phân tích
STT Tên mẫu Nơi thu
Ngày lấy
mẫu
Độ ẩm
(%)
1 HTO Sơn La Long Hẹ, Thuận Châu, Sơn La 15/7/2013 12,17
2
HTO Quảng
Ninh
Yên Than, Tiên Yên, Quảng
Ninh
20/7/2013 8,48
3 HTO Cao Bằng
Quang Trung, Hoà An, Cao
Bằng
25/8/2013 11,72
4 HTO Hà Giang Quyết Tiến, Quản Bạ, Hà Giang 18/10/2013 11,56
5 HTO Lai Châu Phăng Sô Lin, Sìn Hồ, Lai Châu 15/9/2013 12,43
6 HTO Hƣng Yên
Bình Kiều, Khoái Châu, Hƣng
Yên
14/8/2013 12,00
7 HTO thị trƣờng Lãn Ông, Hoàn Kiếm, Hà Nội 12/9/2013 10,09
8 T-TPC
Công ty cổ phần dƣợc phẩm
Traphaco
17/8/2013 6,05
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị
2.2.1 Chất chuẩn
- Chất chuẩn 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid (viết tắt là THSG) của
hãng Tianjin – Trung Quốc, độ tinh khiết 98,0%; CTPT: C20H22O9; KLPT: 406,38
ĐvC.

27. 27
- Chất chuẩn emodin (viết tắt là EM) của hãng Sigma - Aldrich, độ tinh khiết
97,0%; CTPT: C15H10O5; KLPT: 270,24 ĐvC.
- Chất đối chiếu resveratrol (viết tắt là RV) là sản phẩm phân lập đƣợc từ dƣợc liệu
hà thủ ô đỏ, do khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu cung cấp, độ tinh
khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính theo phần trăm diện tích pic) [7]; CTPT:
C14H12O3; KLPT: 228,24 ĐvC.
2.2.2 Hoá chất
- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN) của hãng
Merck.
- Axit photphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3
) của hãng Merck.
- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu (EtOH, MeOH) mua của Trung Quốc
và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.)
- Nƣớc cất sử dụng là nƣớc cất hai lần đã đƣợc deion hoá.
2.2.3 Thiết bị, dụng cụ
 Thiết bị
- HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: bơm LC-20AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL-
20AHT, detector UV-VIS, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu
trên máy HPLC.
- Cột pha đảo Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ
Supelguard Ascentis C18 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g.
- Máy đo pH MP220K của hãng Toledo với điện cực thủy tinh và điện cực calomen
bão hòa và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH
(Merck).
- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng Power sonic 405.
- Máy quang phổ hấp thụ phân tử (UV – VIS) UV1800 của hãng Shimadzu, Nhật
Bản.
 Dụng cụ
- Bình cầu đáy bằng có nút nhám, dung tích 100 ml, của hãng Isolab – Đức.

28. 28
- Bình định mức: 5,10, 25, 50 mL, cùng hãng.
- Pipetman các loại từ 0 – 1000 µL.
- Bình nón 100ml, cốc 100, 50, 25 mL, cốc cân...
Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải đƣợc rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất,
sau đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 1050
C trong
vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trƣớc khi sử dụng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn và mẫu đối chiếu
2.3.1.1 Dung dịch chuẩn gốc THSG 1 mg/ml: cân chính xác 5,0 mg chất chuẩn
THSG, hòa tan trong 5,00 ml EtOH. Các dung dịch chuẩn THSG có nồng độ nhỏ
hơn đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc trong EtOH.
2.3.1.2 Dung dịch đối chiếu RV 1 mg/ml: chuẩn bị tƣơng tự dung dịch chuẩn gốc
THSG nhƣng thay dung môi EtOH bằng MeOH.
2.3.1.3 Dung dịch chuẩn gốc EM 1 mg/ml: chuẩn bị tƣơng tự dung dịch chuẩn gốc
THSG nhƣng thay dung môi EtOH bằng MeOH.
2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu
Theo nhƣ tính chất đã biết của các stilben và anthraquinon, tan tốt trong các
dung môi hữu cơ nhƣ EtOH, MeOH… Công thức cấu tạo của THSG có chứa 1 gốc
đƣờng glucose, vì vậy việc sử dụng hỗn hợp dung môi hữu cơ/nƣớc sẽ chiết THSG
ra khỏi mẫu thực vật kiệt hơn. Tham khảo các tài liệu [24],[28] và so sánh về độ
phân cực của các dung môi, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết là
EtOH/H2O bởi EtOH ít gây độc hại, thân thiện với môi trƣờng hơn MeOH.
Đối với các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, chúng tôi đã khảo sát và đƣa ra
phƣơng pháp xử lý mẫu nhƣ sau:
Phƣơng pháp 1: Cân chính xác khoảng 0,5 g mẫu thử bằng cân phân tích (độ
chính xác 0,0001 gam), chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100,0 ml, có nút nhám,
thêm 50,0 ml dung môi EtOH 50% (v/v), thấm ẩm dƣợc liệu trong 10 phút, cân và
ghi lại khối lƣợng (m1). Lắp bình cầu vào hệ thống chiết hồi lƣu đã đặt ở nhiệt độ
70o
C. Tiến hành chiết hồi lƣu trong 1h. Sau đó để nguội bình cầu về nhiệt độ phòng,

29. 29
cân bình cầu và bổ sung bằng EtOH 50% đến khối lƣợng ban đầu (m1). Lọc, thu
đƣợc dịch chiết mẫu thử (dung dịch A). Lọc dịch chiết này qua màng lọc cellulose
axetat 0,45 µm thu đƣợc dung dịch tiến hành sắc ký HPLC (dung dịch B).
Đối với mẫu sản phẩm từ dƣợc liệu hà thủ ô của công ty Traphaco, do trong
tá dƣợc có nhiều thành phần đƣờng, vì vậy sau khi chiết để thu đƣợc dung dịch A,
mẫu đƣợc loại tạp chất bằng quá trình chiết lỏng – lỏng với dung môi BuOH trƣớc
khi phân tích HPLC. Phƣơng pháp xử lý mẫu đƣợc đƣa ra nhƣ sau:
Phƣơng pháp 2: Lấy khoảng 30 viên thuốc khác nhau, cạo sạch phần bao
đƣờng của từng viên, cân khối lƣợng từng viên trên cân phân tích (độ chính xác
0,0001 gam) và xác định khối lƣợng trung bình viên. Nghiền nhỏ viên và trộn đều
thu đƣợc mẫu thử. Cân chính xác khoảng 5,0000 g mẫu thử, chuyển mẫu vào bình
cầu dung tích 100,0 ml, có nút nhám, thêm 50,0 ml dung môi EtOH 50% (v/v),
thấm ẩm dƣợc liệu trong 10 phút, cân và ghi lại khối lƣợng (m1). Lắp bình cầu vào
hệ thống chiết hồi lƣu đã đặt ở nhiệt độ 70o
C. Tiến hành chiết hồi lƣu trong 1h. Sau
đó để nguội bình cầu về nhiệt độ phòng, cân bình cầu và bổ sung bằng EtOH 50%
đến khối lƣợng ban đầu (m1). Lọc, thu đƣợc dịch chiết mẫu thử (dung dịch A). Đem
toàn bộ dung dịch A cho bay hơi đến cắn trên bếp cách thuỷ, hoà tan cắn trong 10
ml nƣớc cất, chiết với BuOH cho đến khi phân đoạn BuOH nhạt mầu. Gom tất cả
dịch BuOH lại, cô đến cắn trên bếp cách thuỷ, hoà tan cắn trong chính xác 25,0 ml
dung môi EtOH 50% (v/v), lọc qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm thu đƣợc
dung dịch tiến hành sắc ký HPLC (dung dịch B).
2.3.3 Phương pháp phân tích
Phép phân tích THSG, RV và EM đƣợc thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu
năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò
cột, bộ trộn dung môi và detector UV-VIS.
Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha
động từ cột sắc ký rửa giải ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát
hiện các hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Trên thực tế,
hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì

30. 30
vậy detector UV – VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu. Hiện
nay mảng diot – photo – array (PDA) phát triển, chúng có vai trò nhƣ một detector
UV – VIS nhƣng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng
một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV – VIS, tuy nhiên giá thành
của detector PDA đắt hơn nhiều so với detector UV-VIS, vì vậy không phải đơn vị
kiểm nghiệm, sản xuất nào cũng có thể trang bị đƣợc. Dựa vào điều kiện phòng thí
nghiệm và nhằm xây dựng một phƣơng pháp có thể ứng dụng rộng rãi ở các đơn vị
kiểm nghiệm và sản xuất, chúng tôi quyết định chọn detector UV – VIS sử dụng chế
độ theo dõi chất tại 2 bƣớc sóng để thuận lợi cho việc định lƣợng đồng thời các hợp
chất.
Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định
hiệu quả tách của quá trình. Để chọn đƣợc một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp
nhất, ta phải dựa trên những đặc điểm nhƣ: độ phân cực của chất phân tích, chất
phân tích đƣợc pha trong môi trƣờng nhƣ thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định
chọn pha tĩnh phù hợp. Chất phân tích đƣợc chọn là các hợp chất hữu cơ thuộc
nhóm stilben và anthraquinon, đƣợc pha trong MeOH và EtOH. Do các chất phân
tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống nhƣ
chất phân tích. Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ƣu nhất. Trong điều
kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng cột tách Ascentis C18 (250 mm x 4,6
mm; 5 µm) để tách các hợp chất stilben, anthraquinon và định lƣợng chúng.
Các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
- Nhiệt độ cột: t0
phòng (250
C – 300
C).
- Detector UV-VIS: bƣớc sóng 254 nm và 320 nm.
- Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 μl.
- Hệ dung môi gồm 2 kênh. Kênh A: pha nƣớc chứa H3PO4 0,01% (pH ≈ 3,3);
Kênh B là ACN.
- Chế độ gradient tỷ lệ dung môi: nhƣ ở bảng 2.2.

31. 31
Bảng 2.2: Chƣơng trình dung môi rửa giải
T
(phút)
0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 35 35 – 40 45
ACN
(%)
10 - 30 30 30 - 70 70 70 - 100 100 100 - 10 Stop
2.4. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích
2.4.1 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích
HPLC
Thứ nhất là khảo sát để chọn hệ dung môi pha động, với 3 hệ dung môi là:
MeOH-nƣớc, ACN-nƣớc, ACN- nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3).
Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp chúng tôi đi khảo sát thành phần
của pha động, loại axit và nồng độ axit dùng để điều chỉnh pH của pha động (axit
fomic, axit axetic và axit photphoric). Giá trị pH pha động cũng đƣợc khảo sát trong
khoảng từ 2 đến 5.
Chế độ chạy gradient đã đƣợc khảo sát ở nhiều chƣơng trình khác nhau để
chọn đƣợc một chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu quả tách tốt nhất. Với tốc độ cố định
là 1 ml/phút, tỷ lệ dung môi thay đổi từ 10% ACN đến 95% ACN trong khoảng thời
gian 40 phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột cũng đƣợc khảo sát trong khoảng từ 5 μl đến 50
μl.
Các kết quả thu đƣợc ứng với từng khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh về thời
gian lƣu của các chất định phân tích (tR), về độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic
(AS). Phƣơng pháp đánh giá này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 1,5 < RS <
2, 0,9 < AS < 1,2, tR của các chất phải không quá lớn nhƣng đảm bảo phải tách xa
nhau [27].

32. 32
2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích
2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại
Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng các đƣờng chuẩn và
thu đƣợc 02 phƣơng trình đƣờng chuẩn. Đánh giá sai số hệ thống của các hệ số
trong phƣơng trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher để đánh giá và kết
luận, sau đó mới tiến hành phân tích mẫu thực tế.
Một phƣơng pháp phân đƣợc gọi là tối ƣu trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp lại
tốt. Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi
chọn các điều kiện tối ƣu, đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và
thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Dung dịch khảo sát là một
mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn đã xây
dựng, đƣợc bơm vào hệ 6 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lƣu trung bình
của các lần và tính đƣợc giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại và tái lặp lại của quá trình xử lý mẫu
cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Để đánh giá độ lặp lại, cùng một mẫu đƣợc cân
khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm
3 lần để thu đƣợc kết quả trung bình. Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để
đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu. Giá trị % RSD cũng đƣợc dùng làm
giá trị đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu. Để đánh giá độ tái lặp lại, 3 kỹ
thuật viên (KTV) khác nhau cùng thực hiện phép phân tích trên cùng một mẫu. Các
kết quả thu đƣợc dùng làm giá trị đánh giá về độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối (%
RSDR).
2.4.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp
Ngoài độ lặp thì độ đúng là một yếu tố để đánh giá phƣơng pháp phân tích.
Phƣơng pháp thêm chuẩn đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp
xử lý mẫu. Mẫu thực đƣợc thêm một lƣợng nhất định các chất chuẩn vào ở 3 mức
nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng các chất phân tích sau khi xử lý không bị vƣợt quá
đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thống HPLC
thu đƣợc hàm lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng

33. 33
pháp xử lý mẫu. Sau đó, tiến hành đánh giá, kiểm tra sự sai khác giữa khác giữa giá
trị phân tích lại và giá trị thêm chuẩn. Nếu sự sai khác đó không có ý nghĩa thống
kê, chứng tỏ phƣơng pháp phân tích không mắc sai số hệ thống (và ngƣợc lại).
2.4.3 Phân tích mẫu thực tế
Mẫu thử sau khi đƣợc xử lý thu đƣợc dung dịch chạy sắc ký HPLC. Mỗi mẫu
đƣợc phân tích lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lƣợng (%) của EM
(THSG) tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối đƣợc tính theo công thức (CT 1):
(CT 1)
Trong đó C là nồng độ EM (THSG) trong dung dịch mẫu thử tính theo phƣơng trình
hồi quy (ppm); P là độ tinh khiết của chất chuẩn; V là hệ số pha loãng của dung
dịch mẫu thử; m là khối lƣợng mẫu thử đem phân tích (mg); B là độ ẩm mẫu thử
(%).
Tải bản FULL (79 trang): https://bit.ly/3sRMz6Y
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

34. 34
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu tối ƣu hoá các điều kiện đo của hệ thống sắc ký
3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu
Mục đích của nghiên cứu này nhằm định tính 03 hợp chất (THSG, RV, EM)
và định lƣợng 02 hợp chất (THSG và EM). Phổ UV - VIS của từng hợp chất đƣợc
quét trên hệ thống máy đo quang phổ hấp thụ phân tử (UV – VIS). Hình 3.1 biểu
diễn phổ UV – VIS của từng chất.
Hình 3.1: Phổ UV của các chất
A. Phổ UV-VIS của THSG
No. Wavelength Abs
1 320,00 0,799
2 309,50 0,799
3 215,0 0,685
B. Phổ UV-VIS của RV
No. Wavelength Abs
1 309,0 0,525
2 216,0 0,425
3 320,00 0,515
C. Phổ UV – VIS của EM
No. Wavelength Abs
1 629,50 0,003
2 438,00 0,192
3 289,50 0,368
4 254,00 0,362
5 220,00 0,599
Hình 3.1 cho thấy, phổ UV – VIS của THSG và RV giống nhau, cùng có
đỉnh hấp thụ cực đại tại 320 nm. Điều này đƣợc giải thích bởi cấu trúc hóa học của
chúng rất giống nhau, chỉ khác nhau một gốc đƣờng glucose. Đối với EM, phổ UV
– VIS cho đỉnh hấp thụ cực đại tại 254 nm. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này
chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng 320 nm để theo dõi, phát hiện THSG và RV, lựa chọn
bƣớc sóng 254 nm để theo dõi EM.
Tải bản FULL (79 trang): https://bit.ly/3sRMz6Y
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

35. 35
3.1.2 Khảo sát thành phần pha động
Thành phần pha động ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có
thể ảnh hƣởng tới những vấn đề sau trong phép tách sắc ký:
+ Độ chọn lọc của hệ pha
+ Thời gian lƣu trữ của chất tan
+ Hiệu lực cột tách (đại lƣợng Nef)
+ Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh
+ Độ rộng của pic sắc ký
Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thƣờng là nƣớc có trộn với một số
dung môi hữu cơ để thu đƣợc dung dịch có độ phân cực từ cao tới thấp, phù hợp với
quá trình tách. Căn cứ theo tài liệu số [10] ta có chỉ số độ phân cực của nƣớc là 10,2
đơn vị, của MeOH là 5,1 đơn vị, từ đó ta tính đƣợc độ phân cực của các hệ dung
môi đã chọn ứng với từng thời điểm trong quá trình chạy. Công thức tính độ phân
cực là:
PI = %Vi x PIi/ 100 (CT 2)
Các chất phân tích là các chất kém phân cực, pha tĩnh đƣợc chọn cũng là cột pha
đảo kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì quá
trình tách mới tối ƣu.
Chúng tôi đã nghiên cứu và thử nghiệm các hệ dung môi sau:
+ Hệ dung môi 1: MeOH – nƣớc
+ Hệ dung môi 2: ACN – nƣớc
+ Hệ dung môi 3: ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈
3,3).
Đối với quá trình rửa giải các chất ra khỏi cột, có hai chế độ rửa giải là:
+ Rửa giải đẳng dòng (isocratic).
+ Rửa giải gradient dòng.
Chế độ rửa giải đẳng dòng thƣờng đƣợc sử dụng khi phân tích một chất hoặc
trong các mẫu có thành phần nền đơn giản. Đối với hỗn hợp có nhiều chất, khi phân
tích bằng HPLC sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng, quá trình rửa giải sẽ mất thời
6732138