Kromozom Anomalilerinin Tanısında Gelişmeler

1. Kromozom Anomalilerinin Tanısında
Gelişmeler; Kromozomal Karyotipten
Moleküler Karyotipe
Prof. Dr. Seher Başaran
İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi,
Tıbbi Genetik ABD, 2012

2. Kromozom Anomalilerinin Tanısındaki
Aşamalar

3. 400 450 500 600 700 bant/haploid set
~ 500 bant çözünürlükte
~ 1 bant 6 milyon nükleotid
(~6 Mb ve 10’larca gen)
Metafaz prometafaz

4. ~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”
•Tek test tüm genom/kromozomlar
•Tüm sayısal anomaliler
•> 6 Mb lık yapısal anomaliler (dengeli ve dengesiz)
• Klinik yönlendirme varsa bilinen mikrodelesyon sendromları
(~ 3-5Mb)
•Mozaisizm tanınabilir
Dezavantajları;
• Hücre kültürü gerektirir
• Otomatizasyonu zordur
• Tanı subjektiftir ve bu nedenle deneyim önemlidir
• Prenatal tanıda klinik yönlendirme olmadığından ilave test
olanağı sınırlıdır.
ı
Yenidoğanda KROMOZOM ANOMALİ oranı 1:156
Dengeli yapısal anomali oranı %0.4

5. Fluorescence
in situ hybridization
(FISH)
Need to suspect a
specific diagnosis!
Fluoresan In Situ Hibridizasyon
(FISH)
13. Kromozom
21. Kromozom
18. Kromozom
X Kromozomu
Y Kromozomu

6. Williams s. del(7)(q11.23)
Spektral karyotipleme
Spektral karyotipleme
M-FISH

7. Karşılaştırmalı Genomik
Hibridizasyon (CGH)

9. Moleküler Karyotipleme
Olgu Kontrol
Cy5 Cy3

10. • İnsan genomundaki farklılıkların karşılaştırılması
esasına dayanır
Moleküler Karyotipleme
DNA Dizisindeki Değişimler
• Mutasyon
DNA
dizisindeki
patolojik
(hastalığa
neden olan)
değişiklikler
• Polimorfizm
(1) Yaygın olanlar (Bir
toplumda > % 1 görülen
DNA dizi değişiklikleri)
(2) Nadir olanlar/minör
alleler (Bir toplumda < %
1 görülen DNA dizi
değişiklikleri)

11. 1%
4%
45%
6%
44%
İnsan genomunun organizasyonu
protein kodlayan genler
RNA genleri, regülator bölgeler
tranposon kaynaklı tekrarlar
heterokromatin
diğer bölgeler
İnsan haploid genomu ~ 3100 Mb büyüklüğünde,
1200 Mb Gen ve Genlerle ilişkili sekanslar
Genler (exonlar) 48 Mb
İlişkili sekanslar 1152 Mb
İnsan genomunda ~ 25.000 gen

12. İnsan Genetik Varyasyonlarının Sınıflandırılması
Tüm varyasyonların
% 90’ı
Tüm varyasyonların %
10’u
(yapısal varyantlar)
Nükleotid Substitüsyonları (SNPs)
Tekrar dizileri
İnsersiyon/delesyon varyantları
Blok substitüsyonlar
İnversiyon varyantları
Kopya sayısı varyantları (CNVs)
Genomda  300 bp de bir nükleotid polimorfiktir. Halen 12 milyon SNP
tanımlanmıştır.
Genelde iki formda olur (A ya da G; C yada T gibi).
Single nucleotide
polimorfizm (SNPs) ;
Kopya sayısı varyantları
(CNVs);
Referans genomla kıyaslandığında, farklı sayıda bulunan, boyutu 1 kb veya daha fazla olan
DNA segmentlerine Kopya Sayısı Varyasyonu (CNV) denir.

13. Molecular cytogenetics in the postgenomic era:
Array-based comparative genomic hybridization
Total genome High resolution

15. Chromosome 15
Chromosome 15Anne
Baba Chromosome 1
Chromosome 1
Chromosome 1Olgu Chromosome 15

16. Buchanan ve Scherer, Nat Rev Gen, 2008
CNVs ler;
1) Patojenik olarak tanımlanmış değişimler
2) Zararsız (benign) olarak tanımlanmış değişimler
3) Klinik anlamı henüz kesin olarak bilinmeyen (Variants of
uncertain significance (VOUS)) değişimler

17. Wapner R, ISCA (International Standarts for
Cytogenomic Arrays) 2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları;
Normal karyotip saptanan prenatal olgu n:3822
1) Klinik anlamı kesin bilinmeyen CNVs n: 94 (%2.5)
Rapor edilmeyen CNVs n: 33 (%0.9)
Rapor edilen CNVs n: 61 (%1.6)
2) Patolojik CNVs n: 35 (%0.9)
Endikasyon gruplarına göre klinik ile ilişkili CNVs
İleri anne yaşı n: 1966 CNV n:34 %1.7
Positiv Tarama Testi n:729 n:12 %1.6
Patolojik USG n:755 n:45 %6
Klinik ile ilişkili CNVs
%2.5

18. Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays)
2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları;
• 4391 olgudan 51 olguda array sonuçsuz, başarı %98,8
• 4282 nonmozaik karyotip ve 58 mozaik karyotip
Anomaliler Kromozom n Array
tanıyabilir
Array
tanıyamaz
Anöploidiler (tri
21,18,13,X,Y ve
45,X)
374 374 0
Diğer anomaliler
82 24 58 (%1.4)
Dengeli yapısal
40 0 40
Dengesiz yapısal
22 22 0
Marker kromozom
3 2
1
heterokromatin
Triploidi
17 0
17
(7 si SNP array ile
tanınabilirdi
1989-2011 PRETAM+PREMED
2453 CVS 386 kromozom anomalisi 71 anomali %2.9
(20 poliploidi+51 dengeli yapısal)
22813 AS 889 kromozom anomalisi 234 anomali %0.1
(17 poliploidi+217 dengeli yapısal)

19. Endikasyon Array-
normal
Array-
şüpheli
Array-
patolojik
Toplam olgu
Pat-USG 2462
(%88.5)
135 (%4.9) 184 (%6.6) 2781
Pat-USG (soft
markers)
72 (93.5) 3 (%3.9) 2 (%2.6) 77
MS-ST
68 (%88.3) 5 (%6.5) 4 (%5.2) 77
Aile öyküsü
461 (%94.7) 11 (%2.3) 15 (%3.1) 487
İleri Anne
Yaşı
337 (%97.4) 8 (%2.3) 1 (%0.3) 346
Psikolojik 94 (%98.9) 1 (%1.1) 0 95
Diğer/? 12 (%92.3) 0 1 (%7.7) 13
Toplam (canlı
fetuslar
3506
(%90.5)
163 (%4.2) 207 (%5.3) 3876
Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 979-985
Karyotipi “Normal” prenatal olgularda array sonuçları;

20. USG bulgusu Array-normal Array-şüpheli Array-patolojik toplam
Çoklu sistem
anomalileri 492 (%85) 29 (%5) 58 (%10) 579
Çoklu sistem +
yapısal olmayan
anomaliler
196 (85.6) 14 (%6.1) 19 (%8.3) 229
Tek sistem
anomalileri 1370 (%90.2) 68 (%4.5) 81 (%5.3) 1519
Tek sistem + yapısal
olmayan anomaliler 220 (%86.6) 16 (%6.3) 18(%7.1) 254
İzole
poli/oligohidramnios 6 (%66.7) 2 (%22.2) 1 (%11.1) 9
İzole IUGG
74 (%97.4) 0 2(%2.6) 76
Tek soft marker
55 (%93.2) 2(%3.4) 2(%3.4) 59
Çoklu soft marker
17 (%94.4)
1(%5.6)
0 18
Toplam
2534 (%88.7) 138 (%4.8) 186 (%6.5) 2858
Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 1-10

21. Merkezi Sinir Sistemi Anomalisi Saptanan Prenatal Olgularda a-CGH Sonuçları;
Roche- NimbleGene Platformu 1.4 milyon prob (SNP+CNV) ile İstanbul Deneyimlerimiz
• Fetal Kromozom analizi normal 49 olgu
– A- CGH ile CNV değişimi saptanan olgu 49
• %100 CNV (benign) olgu n:44 (%89.8)
• Şüpheli CNV olgu n: 5 (~%10) (~%20 ek maliyet)
– Parental a-CGH n:3 çift (6 test)
- İki olgudaki CNV parental kalıtıldığı saptandı (benign)
- Bir olgudaki CNV patolojik olarak değerlendirildi (~%2)
Schaffer et al., 2012;
Prenat Diagn, 32, 1-10
• Tek sistem –MSS- anomalileri n:326 MSS+yapısal olmayan anomaliler n:56
• normal a-CGH n: 286 (%87.7) normal a-CGH n: 51 (%91.1)
• şüpheli a-CGH n: 17 (%5.2) şüpheli a-CGH n: 3 (%5.4)
•patolojik CNV n: 23 (%7.1) patolojik CNV n: 2 (%3.6)

22. Olgu1: NAG.
 28 yaşındaki anne ve 35 yaşındaki baba
sağlıklı
 4. gebelik
 36 (+) GH:
 Endikasyon: PATUSG (alobar HPE (talamik
füzyon, monoventrikül), mikrosefali, arini,
bilateral yarık dudak ve bilateral hidronefroz)
 Kordosentez: 46,XY
A-CGH sonucu: arr 7q35q36.3(147,250,584-
158,816,094)x1, 9p24.3p21.3(199,254-
20,231,750)x3
Konfirmasyon:
I-FISH  ikişer sinyal
Anne-baba a-CGH normal
Sonuç;
Anomali de novo
Delesyon ve duplikasyon
intersisyel

23. 7q35q36.3 delesyon bölgesinde toplam 161 gen
Sonic hedgehog (SHH) geni bu bölgede
SHH geni (MIM*600725) embriyonun erken döneminde önbeyin, spinal kord, ekstremite,
diş ve orta hat yapılarının gelişiminde önemli bir rol oynar.
9p24.3p21.3 duplikasyon bölgesinde 117 gen
VLDLR (MIM*192977) geni; serebral ve serebellar gelişimde ve migrasyonda rol oynar.Bu
gen mutasyonlar ı serebellar hipoplazi, lizensefali, Alzheimer hastalığı, otizm ve böbrek
anomalileri ile ilişkilendirilmektedir.
GLIS3 (MIM*610192) geni; embriyonun erken döneminde akciğer, böbrek, trakea ve genital
dokularda eksprese olur. Bu gen mutasyonları diabet, konjenital hipotiroidizm, yüz
anomalileri, konjenital glokom, karaciğer fibrosizi ve polikistik böbrek hastalıkları ile
ilişkilendirilmektedir.
Olgumuzun USG bulguları arasında yer alan blt hidronefrozun bu iki genin duplikasyonlarıyla
ilişkili olup olamayacağı sorusu da akla gelmektedir.

24. Olgu 2; DA
Endikasyon; MKA/MR ( A/T; WAGR)
46,XY,t(3;15;21) (p13;q21.2;q22.3),t(4;16)(q31;p31.1)dn
a-CGH Endikasyonu; Görünürde “Dengeli de novo resiprokal translokasyon”
46,XY,t(3;15;21)
(p13;q21.2;q22.3),t(4;16)(q31;p31.1)dn
.arr 11p14.1p13
(30,031,595-33,045,209)x1
 11p14.1p13 bölgesinde 15 gen bulunmaktadır
 Bu genlerden WT1 ve PAX6 genleri WAGR sendromu ile ilişkilidir

25. Olgu 3; KS 112
Karyotip endikasyonu; PATUSG (ventrikulomegali, CCA, ikiz eşi)
Karyotip; 47,XX,+mar
a-CGH endikasyonu; marker kromozomun aydınlatılması
47,XX,+mar . arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6

26. Konfirmasyon;
FISH
wcp 9 arm spesifik 9 p ve q subtelomerikp
47,XX,+mar1/48,XX,+mar1,+mar2 [56/4]. ish 47,XX,+i(9)(p?)/ 48,XX,+i(9)(p?),
+idic(9)(q21) 9ptel30(43N6x6, wcp9p++/wcp9q+, D9Z3++)[56/4]
. arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6

27. Olgu 4; GD
Prenatal tanı endikasyonu; İleri anne yaşı+2’li testte artmış risk+ICSI (donuk embriodan)
CVS Karyotipi 13.GH; 46,--,t(2;4)(p23;q31.1)dn
a-CGH endikasyonu; görünürde dengeli de novo resiprokal translokasyon
a-CGH sonucu normal
22. GH, 2. düzey USG; Ense plisi kalınlığında artış
PTPN11 dizi analizi; 13. ekzonda heterozigot c.1529A>C de novo
(Leopard sendromu’nda tanımlanmış bir mutasyon)

28. ACOG (2009; Obstet and Gynecol, 114:5,1161-1163)
SIGU çalışma grubu (2012;Ultrasound Obstet Gynecol, 39:384-388)
1) konvensiyonel karyotipin yerini almaması gerektiği,
2) tüm gebeliklerde genel tarama için değil seçilmiş gebeliklerde özel tanı amacıyla
kullanılması gerektiğini,
3) prenatal tanıda özel endikasyonlarda;
i) izole veya multiple USG anomalisi saptanan gebelikler
ii) karyotip analizinde dengeli bile görünse de novo yapısal kromozom anomalilerinde
iii) marker kromozomların karakterizasyonunda tamamlayıcı ikinci bir test olarak
kullanılmasını önermektedir
4) “hedefe yönelik array” testi öncesinde ve sonrasında verilecek danışmalarla, anne
babalar a-CGH in tüm patolojileri yakalayamayabileceği ve a-CGH sonuçlarının
yorumunun zor olabileceği konusunda bilgilendirilmeli
5) Array faydalı bir test olmakla birlikte, ilave çalışmalar (parental testler,
konfirmasyonlar) gerekebilir ve maliyet artar

30. Chromosome anomalies
(inc. mosaics) CVS CBCR Others LR AMA ST P-USG
45,X n:42 0 1 0 1 4 36
polysomy X/Y n:6 0 2 0 2 0 2
tri 21 and robt n:131 6 0 2 7 28 88
tri 18 n:61 1 0 0 1 4 55
tri 13 and robt n:27 1 0 0 1 2 23
uncommon tri. n:21 0 2 1 1 9 8
poliploidies, n:20 1 0 0 0 2 17
balanced structural n:51 35 5 1 2 1 7
unbalanced structural n:27 15 0 0 0 3 9
total n:386 59 10 4 15 53 245
Chromosome anomalies
(inc. mosaics) AC CBCR Others LR AMA ST P-USG
45,X n:58 0 1 0 6 18 33
polysomy X/Y n:68 0 0 0 32 18 18
tri 21 and robt n:339 1 0 5 82 78 173
tri18 n:87 1 0 0 13 7 66
tri13 and robt n:23 0 0 1 5 2 15
uncommon tri n:20 0 0 0 5 4 11
polyploidies n:17 0 0 0 1 1 15
balanced structural n:217 64 5 6 73 47 22
unbalanced structural n:60 10 0 0 15 11 24
total n:889 76 6 12 232 186 377
Table 4a: The number of cases with chromosome abnormality according to the indication for chromosome analysis in CVS series
Table 4b: The number of cases with chromosome abnormality according to the indication for chromosome analysis in AC series

31. Ana endikasyon gruplarında 2 dekatta (1989-1999 ve 2000-2011)
saptanan fetal kromozom anomali oranları; PRETAM+PREMED
CVS Series
1. Period (1989-1999) 2. Period (2000-2011)
Overall
rate %
∑ n n ano ano % ∑ n n ano ano %
CBCR 53 34 64,2 48 25 52,1 58,4
Others 308 2 0,7 533 8 1,5 1,2
LowR 42 4 9,5 13 0 0 7,3
AMA 112 4 3,6 223 12 5,4 4,8
ST 6 1 16,7 276 52 18,8 18,8
P-USG 110 19 17,3 714 226 29,7 28,7
total 631 64 10,1 1822 323 17,7 15,8
AC Series
1. Period (1989-1999) 2. Period (2000-2011) Overall
rate %
∑ n n ano ano % ∑ n n ano ano %
CBCR 43 26 60,5 93 50 53,8 55,9
Others 267 1 0,4 358 5 1,4 1
LowR 577 8 1,4 379 4 1,1 1,3
AMA 3891 93 2,4 6539 139 2,1 2,2
ST 2056 52 2,5 4693 134 2,9 2,8
P-USG 536 55 10,3 3906 321 8,2 8,5
total 7370 235 3,2 15443 654 4,2 3,9

32. Kromozom Anomalierinin Tanısında
Kullanılan Teknikler
Tüm genomu inceler
Dengeli kromozom anomalilerini
tanır
Düşük oranlı mozaikler saptanır
3n/4n tanısı mümkün
Rezolüsyon daha düşüktür (5-
10 Mb)
Hücre kültürü gerektirir
Tanı subjektiftir
Otomatizasyon zordur
Lokusa /kromozoma özeldir
Rezolüsyonu yüksektir <3Mb)
Otomatizasyona uygundur
3n/4n tanısı mümkün
Endikasyona göre hücre
kültürü gerekir
Endikasyona göre kullanılır
Tüm genomu inceler
Rezolüsyonu en yüksek (>100 Kb)
Hücre kültürü gerekmez
Otomatizasyona uygundur
Dengeli kromozomal değişimleri
tanıyamaz
Düşük oranlı (<%10) mozaikleri
tanıyamaz
Bioinformatik çalışma gerektirir
Henüz pahalı

33. Genetik Hastalıkların Tanısı
Moleküler testler
 Tek bir genin ekzon ve introndaki
değişimleri (patojenik veya polimorfik-
zararsız) inceler; tek bir genin, ilişkili
genlerin ya da genomdaki tüm ekzomların
dizilenmesi olasıdır,
 Genin ürünü olan m-RNA daki değişimleri
inceler; hücrenin tüm m-RNA ları da
incelebilir (transkriptomiks)
Tek Gen Hastalıkları ve
Multigenik Hastalıklar
Sitogenetik testler
 Klasik karyotipleme metafaz
kromozomlarını inceler
 HRBT karyotipleme prometafaz
kromozomlarını inceler
 FISH bilinen kromozom ve özgün
kromozom bölgelerini seçici olarak inceler
Tüm kromozom anomalileri ve
mikrodelesyon sendromları
MolekülerSitogenetik
Mikroarray

34. Postnatal Uygulamalar
The International Standard Cytogenomic Array (ISCA)
Consortium
Miller DT, 2010, American J Hum Genet.
Açıklanamayan gelişme geriliği, MKA/MR ve otizm spektrumu
endikasyonunda;
Sitogenetik  %3-36 (%17,4 Karaman et al., 1999)
Moleküler karyotipleme, anomali saptama oranı en yüksek olan (%15-
20) tanı testidir.
Bilinen sayısal ve gros yapısal anomalilerin yanısıra submikroskobik
delesyon ve duplikasyonları saptayabildiğinden “Moleküler
karyotipleme birinci tanı testi olarak uygulanmalıdır!”
Dengeli yeniden düzenlenmeler ve düşük oranlı mozaisizmler
saptanamaz ancak bu popülasyonda bu anomalilerin saptanma oranı
%1’den az olduğundan göz ardı edilebilir.