Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
DNA DİZİANALİZLERİ VEKLONLAMA
DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrolmekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizisağlamıştır.   Herhangi bir ...
Bir genomun tamamlanan nükleotit dizisi, nihaiharitası demektir.Genomların çok uzun DNAmoleküllerinin dizi analizini olası...
DNA Dizi Analiz Yöntemleri
DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNAnınnükleotid    dizilerinin saptanması   anlamınagelmektedir. İlk dizi analiz çalış...
DNA dizi analizleri yada sekanslama DNA birincilyapılarının tayininde ve nükleotid baz dizilimininbelirlenmesinde kullanıl...
Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebekembriyolarından alınan DNA’lar bu yöntemle analizedilerek taşıyıcı embriyolar...
Nükleotit dizilerinin belirlenmesinde   iki temelteknik kullanılmaktadır.• Sanger dideoksi yöntemi• Maxam-Gillbert kimyasa...
Her iki teknik de üç temel basamaktanoluşmaktadır.• DNA’nın hazırlanması• Reaksiyonlar• Yüksek voltajlı jel elektroforezi
 Her iki analiz sırasında da tek iplikli DNA parçalarıhazırlanır.DNA dizi analiz yöntemi sırasındaki temelfark DNA fragme...
Sanger Dizi Analiz Yöntemi  Dideoksi yada zincir sonlanması reaksiyonları olarakda bilinir. Tehlikeli kimyasallardan uzak ...
Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır vegünümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizitekniğidir.  Bu yöntemde dizisi...
Bu yöntem için: Tek iplikli kalıp DNA’ya dNTP’lere ddNTP DNA polimeraz Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç vardır
İŞLEYİŞProsedür PCR nın işleyişine benzer•DNA tek zincir haline getirilir.Reaksiyona girecek olan karışımda bol miktarda d...
ddNTP ’ ler dideoksinükleosittrifosfatlardır. OHgrubu taşımayan modifiye nükleotit substratlardır.  Bunlar riboz şekerinin...
İlk olarak reaksiyon sonunda oluşacak ürünlerinrahat görüntülenebilmesi için DNA molekülüişaretlenir. İşaretleme işlemi iç...
 DNA polimeraz, primer kalıp DNA ve dNTP’lerortama konulup işaretli nükleotitin yapıya katılmasısağlanır.   Kullanılan d...
Karışım dört kısma ayrılarak dört tüpe konulur. Hertüpe gerekli enzim faktörleriyle birlikte düşükderişimli farklı ddNTP’l...
Her tüpte aynı anda birbirinden bağımsız birçokreaksiyon olmuştur.     Sonuçta primer sonundan başlayıp pramatüresonlanmal...
Oluşan ürünlerin ayrıştırılabilmesi için yüksekrezülasyonlu denatüre edici poliakrilamid jelelektroforezi kullanılır.    E...
Makromoleküllerinjel elektroforezi
Elektroforezde mobilitesi en hızlı olan bantprimere en yakındır yani radyoaktif elemente enyakın bant en küçük DNA fragmen...
Her baz için ayrı fluoresans boya ile işaretlenmiş olanddNTP’ler kullanılır.  DNA parçacıkları jelde ilerlerken bir lazeri...
İNCELENEN BİR DNA BÖLGESİNİN DİZİ ANALİZİ SONUCU
İlk bantta en yakın ikinci bazı verir. Böyleceaşağıdan yukarı doğru çıktıkça hareketi azalanbantların hangi ddNTP ile oluş...
FRAGMENTLERİN OTOMATİK ELEKTROKİNETİK ENJEKSİYONLA BOYLARINA GÖRE SIRALANMASI
DNA sentezini sağlamak için Klenov, Taq DNApolimeraz, terstranskriptaz ya da sekuenazenzimlerinden birisi kullanılabilir.
DNA Dizi Analizinde KullanılanEnzimler
DNA      dizi   analizinde   çeşitli   polimerazlarkullanılabilmektedir:• Klenow Fragment/E.Coli DNA polimeraz• Reverse Tr...
Kalıp DNA  Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hemçift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir.Yöntemin birinci aşam...
PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarındanarındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken biraşamadır. Eğer kalı...
Enzimler  Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde birçok      tipde      DNA        polimeraz    enzimikullanılabilmekte...
E.coli Klenow Fragmenti DNAPolimeraz I İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin ikibüyük dezavantajı vardır.  Birin...
Bu enzim standart olarak 250-300 nükleotitlik birdizi analizi edebilir çok uzun zincirlerde etkisinigösteremez,   İkincisi...
Ters Transkriptaz        Ters transkriptaz (Reverse transcriptase)enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanıolma...
Sekuenaz Enzimleri          Sekuenaz (SequenasesTM) enzimleri T7bakteriofajın’dan elde edilirler. Enzimin 3’-5’ekzonükleaz...
(Bu enzimin tamamiyle modifiye bir formu olanSequenaz ver 2’de üç kat daha fazla aktivitesi olan birenzimdir. Plimerizasyo...
Taq DNA Polimeraz  Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasındatercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygınku...
Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ilehomopolimerik bölgelerde bile çok etkindir .      Tag polimeraz Klenow’un yapam...
Maxam –Gilbert KimyasalDegredasyon Yöntemi  Çok yönlü sekans olarak da bilinen bu yöntem debazı kimyasallarla DNA özgül ba...
Yine de çok fazla tercih edilmeyen metottur. Anamantık DNA’daki bazların tahrip edilip hasar görmüşbölgelerden piperidin i...
  İlk olarak DNA parçası bir ucundan işaretlenir.İşaretleme sonrası DNA dört parçaya ayrılır. Her bir örneğe bazlardan b...
Piperidin de fosfodiester bağlarının kırınımınıkatalizler. Dimetilsülfat, piperidine guanini bağlarken Dimetil sülfat, ...
Yukarıdaki kimyasalların uygulanmasıyla oluşançeşitli uzunluktaki fragmentler yüksek voltajlıelektroforez sonunda X-ray du...
MİKROARRAY GÖRÜNTÜSÜ
Sanger-Coulson Zincir Sonlanma YöntemindeKullanılan Kimyasallar ve Primerler   Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde i...
Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizianalizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizir...
Kulanım alanları1. Hastalığa yatkınlığın önceden belirlenmesi2. Kişiye özel ilaç tasarımlarının yapılabilmesi.3. Gen tedav...
KLONLAMA
Klonlama temelde üç ana başlığa ayrılarak incelenebilir:•Moleküler klonlama•Çoğaltımsal klonlama•Terapi Amaçlı klonlama
Gen klonlaması çalışmaları bugün çok çeşitliamaçlar için genetik ve biyolojik araştırmalardakullanılmaktadır.  Bir genin v...
Moleküler klonlama  Bu teknik, herhangi bir DNA parçasının, plazmid yada fajmid gibi kendini eşleme yeteneği olan bir başk...
Klonlamada;virus ve bakteriler, bakteriofajlar,plazmitler, nadiren de kozmid ve mayalar vektörolarak kullanılmaktadır.  Pl...
Gen klonlaması çalışmalarında plazmitlerkullanıldığında, klasik olarak genler genomikDNA veya mRNA’dan izole edilerek Poli...
Araştırıcılara bir çok avantaj sağlayan plazmit veklonlama kitleri firmalar tarafından üretilmektedirler. Bunlar yardımıyl...
Araştırıcıların biyoteknolojik gelişimi takip ederekgen klonlaması ve sonrasındaki çalışmalar içinkullanacakları en uygun ...
Günümüzde gen klonlaması çalışmalarıGen izolasyonu,Gen bankalarının oluşturulması,
Genlerin güvenlik altına alınarak onların yapı vefonksiyonları üzerinde araştırmalar yapılması,Klonlanan genlerin üzerin...
Proteinlerin açıklatılmasıgibi amaçlarla yapılmaktadır . Bir genin vektöreyerleştirilmesi ve bu vektörün bakteri hücreler...
Gen klonlamasının temel ilkeleri.Konakçıdan elde edilen DNA ve plazmit aynırestriksiyon enzimleriyle kesilerek, DNA’nınpla...
Dna dizi analizi ve klonlama
Dna dizi analizi ve klonlama
Dna dizi analizi ve klonlama
Dna dizi analizi ve klonlama
Dna dizi analizi ve klonlama
Dna dizi analizi ve klonlama
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Dna dizi analizi ve klonlama

15,166 views

Published on

  • Dating for everyone is here: ❤❤❤ http://bit.ly/2Qu6Caa ❤❤❤
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here
  • Sex in your area is here: ❶❶❶ http://bit.ly/2Qu6Caa ❶❶❶
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here

Dna dizi analizi ve klonlama

  1. 1. DNA DİZİANALİZLERİ VEKLONLAMA
  2. 2. DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrolmekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizisağlamıştır. Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNAelde edilmesini sağlayan rekombinant DNAtekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizianalizi yöntemleri de gelişme göstermiştir.
  3. 3. Bir genomun tamamlanan nükleotit dizisi, nihaiharitası demektir.Genomların çok uzun DNAmoleküllerinin dizi analizini olası hale getiren DNAfragmentlerinin klonlanması için kullanılanteknolojidir. Kısa bir DNA fragmentinin çok sayıda kopyasınınbulundugu saf bir preparasyonla başlayarak, bir dizianalizi yapan aletle bu fragmentin nükleotit dizisibelirlenebilir.
  4. 4. DNA Dizi Analiz Yöntemleri
  5. 5. DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNAnınnükleotid dizilerinin saptanması anlamınagelmektedir. İlk dizi analiz çalışmaları 1960’lı yılların başında 75-80 nükleotitlik tRNA’larla başlanmıştır.
  6. 6. DNA dizi analizleri yada sekanslama DNA birincilyapılarının tayininde ve nükleotid baz dizilimininbelirlenmesinde kullanılan yöntemdir. Analiz birnükleik asit dizisinin diğerine hibridizasyonunadayanır. Bu hibridizasyon sırasında radyoaktif ya daradyoaktif olmayan maddelerle işaretleme yapılır.Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon, insersiyon vb.)tespiti yada rekombinant DNA oluşum yapılarınıntayininde kullanılır.
  7. 7. Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebekembriyolarından alınan DNA’lar bu yöntemle analizedilerek taşıyıcı embriyolar elenip genetik hastalıktaşımayanların doğması sağlanmaktadır. Yine aynı şekilde doku uygunluğu saptanmışembriyolardan sağlıklı doğacaklardan elde edilenkordon kanı ve kemik iliği hasta kardeşlerintedavisinde kullanılmaktadır.
  8. 8. Nükleotit dizilerinin belirlenmesinde iki temelteknik kullanılmaktadır.• Sanger dideoksi yöntemi• Maxam-Gillbert kimyasal degredasyon yöntemi
  9. 9. Her iki teknik de üç temel basamaktanoluşmaktadır.• DNA’nın hazırlanması• Reaksiyonlar• Yüksek voltajlı jel elektroforezi
  10. 10.  Her iki analiz sırasında da tek iplikli DNA parçalarıhazırlanır.DNA dizi analiz yöntemi sırasındaki temelfark DNA fragmentlerinin üretilme biçimindenkaynaklanır. Jel elektroforezi yüksek çözünürlükteki DNAmoleküllerini ayrıştırdığı için her iki metotta dakullanılır.
  11. 11. Sanger Dizi Analiz Yöntemi Dideoksi yada zincir sonlanması reaksiyonları olarakda bilinir. Tehlikeli kimyasallardan uzak ve daha hızlıbir yöntem olduğundan Maxam-Gilbert yönteminetercih edilir.
  12. 12. Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır vegünümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizitekniğidir. Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yenisentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.
  13. 13. Bu yöntem için: Tek iplikli kalıp DNA’ya dNTP’lere ddNTP DNA polimeraz Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç vardır
  14. 14. İŞLEYİŞProsedür PCR nın işleyişine benzer•DNA tek zincir haline getirilir.Reaksiyona girecek olan karışımda bol miktarda dört çeşit normal nükleotid •dATP •dGTP •dCTP •dTTP bulunur.•Karışımda aynı zamanda diziyi rastgele sonlandırmak için farklı renkte flouresan kimyasallarla işaretlenmiş dideoxynukleotidler vardır. •ddATP •ddGTP •ddCTP •ddTTP•DNA polymerase I ise sentezde zincirin uzaması aşamasında gereklidir.
  15. 15. ddNTP ’ ler dideoksinükleosittrifosfatlardır. OHgrubu taşımayan modifiye nükleotit substratlardır. Bunlar riboz şekerinin ikinci karbon atomuna ekolarak üçüncü karbon atomunda da deoksi haldeolduğundan fosfodiester bağının oluşumu engelleniryeni nükleotitler yapıya katılmaz. DNA zinciruzaması sonlanır.
  16. 16. İlk olarak reaksiyon sonunda oluşacak ürünlerinrahat görüntülenebilmesi için DNA molekülüişaretlenir. İşaretleme işlemi için genelde• S35• P33• P32 kullanılır. İşaretleme ya gama pozisyonunda yapısındabulunduran nükleotitleri kullanarak yada alfapozisyonunda işaretli dNTP’leri kullanarak yapılır.
  17. 17.  DNA polimeraz, primer kalıp DNA ve dNTP’lerortama konulup işaretli nükleotitin yapıya katılmasısağlanır. Kullanılan ddNTP’lerin konsantrasyonu diğermaddelerden daha düşük olmalıdır. İşaretleme primere de yapılabilir. İşaretlemedensonra zincir sonlanması reaksiyonlarına geçilir.
  18. 18. Karışım dört kısma ayrılarak dört tüpe konulur. Hertüpe gerekli enzim faktörleriyle birlikte düşükderişimli farklı ddNTP’ler konulur ve inkübe edilir. ddNTP’ler ve dNTP’ler aynı karışıma konduğundaaralarında bir yarışma olur.substrat olarak dNTP’lerkullanıldığı sürece uzama devam eder. Sentezinherhangi bir noktasında yapıya dideoksi girdiğindereaksiyon durur.
  19. 19. Her tüpte aynı anda birbirinden bağımsız birçokreaksiyon olmuştur. Sonuçta primer sonundan başlayıp pramatüresonlanmaların olduğu bölgelere kadar çeşitliuzunlukta DNA parçaları oluşur.
  20. 20. Oluşan ürünlerin ayrıştırılabilmesi için yüksekrezülasyonlu denatüre edici poliakrilamid jelelektroforezi kullanılır. Elektroforez sonunda jel kurutularak otoradyografiile fotoğrafı çekilir. Otoradyogramdan elde edilen basamak şeklindekibantlar radyoaktif izotop taşıyan tek zincirli DNAmoleküllerine aittir. Birbirine en yakın iki bantarasında tek bir nükleotitlik fark vardır.
  21. 21. Makromoleküllerinjel elektroforezi
  22. 22. Elektroforezde mobilitesi en hızlı olan bantprimere en yakındır yani radyoaktif elemente enyakın bant en küçük DNA fragmentidir. Bu fragmenthangi ddNTP ile oluşturulmuş ise işaretten sonragelen ilk bazdır.
  23. 23. Her baz için ayrı fluoresans boya ile işaretlenmiş olanddNTP’ler kullanılır. DNA parçacıkları jelde ilerlerken bir lazerin yanındangeçerler. Lazerle karşılaşan floresans boyanın yaptığı ışımadedektör aracılığı ile okunur.
  24. 24. İNCELENEN BİR DNA BÖLGESİNİN DİZİ ANALİZİ SONUCU
  25. 25. İlk bantta en yakın ikinci bazı verir. Böyleceaşağıdan yukarı doğru çıktıkça hareketi azalanbantların hangi ddNTP ile oluşturulduğu belirlenir. Sonuçta otoradyogramda ki bu bant verilerdenyararlanılarak 53 yönüne doğru olan baz dizilimisaptanmış olur.
  26. 26. FRAGMENTLERİN OTOMATİK ELEKTROKİNETİK ENJEKSİYONLA BOYLARINA GÖRE SIRALANMASI
  27. 27. DNA sentezini sağlamak için Klenov, Taq DNApolimeraz, terstranskriptaz ya da sekuenazenzimlerinden birisi kullanılabilir.
  28. 28. DNA Dizi Analizinde KullanılanEnzimler
  29. 29. DNA dizi analizinde çeşitli polimerazlarkullanılabilmektedir:• Klenow Fragment/E.Coli DNA polimeraz• Reverse Transkriptaz• Bakteriofaj T7 DNA polimeraz• Taq DNA polimeraz• Sequenazlar
  30. 30. Kalıp DNA Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hemçift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir.Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincirreaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR)tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçasıkalıp DNA olarak adlandırılır.
  31. 31. PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarındanarındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken biraşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezsebir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olankimyasallar ile primer artıkları reaksiyonunhassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al., 1989).
  32. 32. Enzimler Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde birçok tipde DNA polimeraz enzimikullanılabilmektedir. Bu enzimlerin ortaközellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.
  33. 33. E.coli Klenow Fragmenti DNAPolimeraz I İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin ikibüyük dezavantajı vardır. Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltmareaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzunokumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir.
  34. 34. Bu enzim standart olarak 250-300 nükleotitlik birdizi analizi edebilir çok uzun zincirlerde etkisinigösteremez, İkincisi Homopolimerik bölgeleri etkin olarakçoğaltamaz (Homopolimer DNA segmentlerininuçlarına ilave edilen poli A, poli T’lerden) İkincilyapının olması durumunda da etkili değillerdir(Dyad simetri)
  35. 35. Ters Transkriptaz Ters transkriptaz (Reverse transcriptase)enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanıolmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkinçözüm verir. Homopolimerik bölgeler (A/T veyaG/T ) bakımından zenginse tercih edilmektedir. Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenowfragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır .
  36. 36. Sekuenaz Enzimleri Sekuenaz (SequenasesTM) enzimleri T7bakteriofajın’dan elde edilirler. Enzimin 3’-5’ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. Bu özelliğiddNTP’lerin bağlanmasını kolaylaştırdığındançoklukla tercih edilmektedir. İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tekyönlü ve hızlı çalışır.
  37. 37. (Bu enzimin tamamiyle modifiye bir formu olanSequenaz ver 2’de üç kat daha fazla aktivitesi olan birenzimdir. Plimerizasyon oranı 300 dür. Birreaksiyonda yaklaşık 3000 nükleotit senteziyapılabilmektedir. Burada sınırlayıcılar poliakrilamidjellerdir. Bu avantajlardan yararlanabilmek için ikikademeli dizilenme reaksiyonu yapılır.) Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yükseközgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir .
  38. 38. Taq DNA Polimeraz Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasındatercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygınkullanılan enzim türüdür.
  39. 39. Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ilehomopolimerik bölgelerde bile çok etkindir . Tag polimeraz Klenow’un yapamadığı tümişlevleri yapabilmektedir ve özellikle G/Cbakımından zengin bölgelerde daha etkindir.
  40. 40. Maxam –Gilbert KimyasalDegredasyon Yöntemi Çok yönlü sekans olarak da bilinen bu yöntem debazı kimyasallarla DNA özgül baz dizilerindenkesilerek değişik uzunlukta fragmentler elde edilir.Bu metotta bir sekans jelinden kırk klon analiziyapılabilmektedir.
  41. 41. Yine de çok fazla tercih edilmeyen metottur. Anamantık DNA’daki bazların tahrip edilip hasar görmüşbölgelerden piperidin ile fosfodiester bağlarınınkırılmasıdır.
  42. 42.  İlk olarak DNA parçası bir ucundan işaretlenir.İşaretleme sonrası DNA dört parçaya ayrılır. Her bir örneğe bazlardan birini tahrip edilebilecekkimyasallar eklenir. Genelde ilk pürin vepürimidinlerin ayrımı ardından bazların ayrımışeklinde olur. Dimetilsülfat ile müdahale pürünlerin hydrozin ilemüdahale de pürimidinlerin arasındaki glikozitbağlarının kırılması sağlanır.
  43. 43. Piperidin de fosfodiester bağlarının kırınımınıkatalizler. Dimetilsülfat, piperidine guanini bağlarken Dimetil sülfat, piperidine formikasit guainin veadenini bağlıyor Hidrozin ve piperidin birlikte timin ve sitozinibağlarken Hidrozin piperidin ve 1.5 M‘lık NaCl yalnızcasitozini bağlar.
  44. 44. Yukarıdaki kimyasalların uygulanmasıyla oluşançeşitli uzunluktaki fragmentler yüksek voltajlıelektroforez sonunda X-ray duyarlı film ile kkaplanarak otoradyograma alınır. otoradyografikbantlar 5>3 yönünde en alttan en üste doğruokunduğunda bize 5>3 yönündeki baz diziliminiverir.
  45. 45. MİKROARRAY GÖRÜNTÜSÜ
  46. 46. Sanger-Coulson Zincir Sonlanma YöntemindeKullanılan Kimyasallar ve Primerler Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilenDNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesiiçin özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır. Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’nın genomikDNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıcaprimerler yöntemin son aşaması olan sonlanmareaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3’ ucu sağlar.Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklıprimerler de kullanılabilir.
  47. 47. Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizianalizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizireaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasındave dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır. Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır veböylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur .
  48. 48. Kulanım alanları1. Hastalığa yatkınlığın önceden belirlenmesi2. Kişiye özel ilaç tasarımlarının yapılabilmesi.3. Gen tedavisi ve gene özgü ilaç üretimi4. Yeni enerji kaynaklarının bulunması5. Adli tıp çalışmalarında kullanılması6. Genetik testlerde kullanılması7. Tarımda sağlıklı ve çok daha verimli çiftlikhayvanlarının geliştirilmesi8. Besin değeri yüksek ürünler geliştirilmesi9. Islah çalışmalarında zaman kazanılması vb. birçokuygulama alanı vardır.
  49. 49. KLONLAMA
  50. 50. Klonlama temelde üç ana başlığa ayrılarak incelenebilir:•Moleküler klonlama•Çoğaltımsal klonlama•Terapi Amaçlı klonlama
  51. 51. Gen klonlaması çalışmaları bugün çok çeşitliamaçlar için genetik ve biyolojik araştırmalardakullanılmaktadır. Bir genin vektöre yerleştirilmesi ve bu vektörünbakteri hücrelerine transformasyonu sonucundahücrelerin bölünmesi sırasında vektörün deiçerdiği genin birçok kopyasını oluşturması işleminegen klonlaması adı verilmektedir.
  52. 52. Moleküler klonlama Bu teknik, herhangi bir DNA parçasının, plazmid yada fajmid gibi kendini eşleme yeteneği olan bir başkaDNA parçası içine vektör yerleştirilmesi ve bubileşimin vektörün çoğaltılması işlemlerini içerir. Buteknik, biyoloji biliminin neredeyse her alanında çokönemli kullanım alanına sahiptir.
  53. 53. Klonlamada;virus ve bakteriler, bakteriofajlar,plazmitler, nadiren de kozmid ve mayalar vektörolarak kullanılmaktadır. Plazmitler, bakteri ve diğer organizmalarda bulunan,konak hücre kromozomundan bağımsız olarakçoğalan küçük, yuvarlak yapılı kromozom dışıDNA’lardır.
  54. 54. Gen klonlaması çalışmalarında plazmitlerkullanıldığında, klasik olarak genler genomikDNA veya mRNA’dan izole edilerek PolimerazZincir Reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmakta, genve genin yerleştirileceği plazmit bir veya dahafazla enzimle kesilerek in vitro şartlarda geninplazmite yerleştirilmesi sağlanmaktadır.
  55. 55. Araştırıcılara bir çok avantaj sağlayan plazmit veklonlama kitleri firmalar tarafından üretilmektedirler. Bunlar yardımıyla çok kısa sürede ve çok etkin birşekilde gen klonlaması yapılabilmektedir.
  56. 56. Araştırıcıların biyoteknolojik gelişimi takip ederekgen klonlaması ve sonrasındaki çalışmalar içinkullanacakları en uygun plazmiti; plazmitin kullanımözellikleri, maliyet ve zamangibi faktörlerin yanısıra kendi laboratuvar olanaklarını da göz önündebulundurarak seçmeleri gerekmektedir.
  57. 57. Günümüzde gen klonlaması çalışmalarıGen izolasyonu,Gen bankalarının oluşturulması,
  58. 58. Genlerin güvenlik altına alınarak onların yapı vefonksiyonları üzerinde araştırmalar yapılması,Klonlanan genlerin üzerinde mutasyonlaryapılarak fonksiyonel bölgelerin belirlenmesi,DNA dizi analizlerinin kolaylaştırılması,DNA aşılarının oluşturulması ve rekombinant
  59. 59. Proteinlerin açıklatılmasıgibi amaçlarla yapılmaktadır . Bir genin vektöreyerleştirilmesi ve bu vektörün bakteri hücrelerinetransformasyonu sonucunda hücrelerin bölünmesisırasında vektörün de içerdiği genin birçok kopyasınıoluşturması işlemine “gen klonlaması” adıverilmektedir
  60. 60. Gen klonlamasının temel ilkeleri.Konakçıdan elde edilen DNA ve plazmit aynırestriksiyon enzimleriyle kesilerek, DNA’nınplazmite yerleştirilmesi sağlandıktan sonraoluşan rekombinant DNA,E.coli hücrelerinetransforme edilmektedir.

×