Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Thực Vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides).doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
VŨ THỊ CẨM HƯNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON
CỦA LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU
(Anemarrhena asphodeloides)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT
THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
VŨ THỊ CẨM HƯNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON
CỦA LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU
(Anemarrhena asphodeloides)
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60.44.01.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT
Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM VĂN KHANG
THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Học viên
Vũ Thị Cẩm Hưng
XÁC NHẬN CỦA NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN
KHOA CHUYÊN MÔN HƯỚNG DẪN
i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới TS. Phạm Văn
Khang - người thầy đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn học viên Thẩm Hương Thảo và sinh viên
Dương Quang Công đã đồng hành, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực nghiệm và hoàn thành luận văn. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới các
thầy cô giáo, các học viên cao học K22 và các em sinh viên trong phòng thí
nghiệm Hóa hữu cơ đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi
hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban lãnh đạo khoa Hóa,
phòng Sau đại học - trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này.
Thái Nguyên, tháng năm 2016
Học viên
Vũ Thị Cẩm Hưng
ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................ii
MỤC LỤC............................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ......................................................................v
DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH .........................................................................vi
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................1
1. Lí do chọn đề tài................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu.........................................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................2
5. Dự kiến kết quả đề tài .......................................................................................3
6. Dự kiến cấu trúc luận văn .................................................................................3
Chương 1. TỔNG QUAN ...................................................................................4
1.1. Khái quát về thực vật họ Thùa (Agavaceae)..................................................4
1.2. Tổng quan về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)................4
1.2.1. Tên khoa học...........................................................................................4
1.2.2. Đặc điểm thực vật ...................................................................................4
1.2.3. Phân bố trong tự nhiên ............................................................................6
1.2.4. Công dụng của loài Tri mẫu....................................................................6
1.3. Tinh̀ hình nghiên cứu thành phần hóa hoc ̣loài Tri mâũ................................7
1.3.1. Các hơp̣chất glycoside ...........................................................................7
1.3.2. Các hợp chất aglycon ............................................................................21
1.3.3. Các hợp chất phenolic...........................................................................23
1.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu ................................25
1.4.1. Hoạt tính sinh học của các saponin.......................................................25
1.4.2. Hoạt tính sinh học của các aglycon.......................................................28
iii

Chương 2. THỰC NGHIỆM............................................................................32
2.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................32
2.2. Hóa chất và thiết bị.......................................................................................32
2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập được...............................................................................................33
2.3.1. Xử lý mẫu thực vật................................................................................33
2.3.2. Chiết tách các chất.................................................................................33
2.3.3. Xác định cấu trúc các chất ....................................................................33
2.4. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme alpha-glucosidase...........33
2.5. Thực nghiệm.................................................................................................34
2.5.1. Quá trình phân lập các chất từ phần rễ của loài Tri mẫu ......................34
2.5.2. Dữ kiện phổ của các chất phân lập được ..............................................37
2.5.3. Xác định khả năng ức chế α-glucosidase..............................................40
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................41
3.1. Kết quả phân lập các hợp chất .....................................................................41
3.2. Xác định cấu trúc chất tách được.................................................................41
3.2.1. Chất AA1...............................................................................................41
3.2.2. Chất AA2...............................................................................................47
3.2.3. Chất AA3...............................................................................................51
3.3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase của các hợp chất
phân lập được ......................................................................................................55
KẾT LUẬN ........................................................................................................57
KIẾN NGHỊ.......................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................58
PHỤ LỤC
iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Aβ Amyloid β-peptide
BuOH Butanol
EA Etyl axetat
ESI-MS Phổ khối lượng
EtOH Etanol
GC Hệ thống sắc kí khí
HeLa Tế bào ung thư cổ tử cung
HepG2 Tế bào ung thư gan
HMBC Phổ tương quan hai chiềuH-C
HPLC Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
MCF-7 Tế bào ung thư vú
MDA Malonaldehyde
MeOH Metanol
MKN45 và Kato III Tế bào ung thư dạ dày
MPO Myeloperoxidase
13
C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 13
C
1
H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 1
H
SOD Superoxide dismutase
SUNE-1 Tế bào ung thư biểu bì
iv

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ
Bảng 2.1. Số liệu phổ NMR của AA1.............................................................37
Bảng 2.2: Số liệu phổ NMR của AA2.............................................................38
Bảng 2.3: Số liệu phổ NMR của AA3.............................................................39
Bảng 3.1: Mốt số tín hiệu cộng hưởng trên 1
H-NMR của chất AA1 và
Sarsasapogenin 43
Bảng 3.2: Số liệu phổ 13
C- NMR của chất AA1 và sarsasapogenin...............44
Bảng 3.3: Một số tín hiệu cộng hưởng trên 1
H-NMR của chất AA2 và
Sarsasapogenone 48
C- NMR của chất AA2 và sarsasapogenone............49
H và 13
C NMR của chất AA3..52
Bảng 3.6: Kết quả chế enzyme α-glucoside ....................................................55
v

DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết xuất và thủy phân mẫu phần rễ...................................34
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các chất từ cao tổng số ...........................................36
Hình 1.1: Các bộ phận cây Tri mẫu ..................................................................5
Hình 1.2: Rễ cây Tri mẫu.................................................................................5
Hình 1.3: Vườn cây Tri mẫu .............................................................................6
Hình 3.1: Phổ khối lượng EIS-MS của AA1 ..................................................42
Hình 3.2: Phổ 1
H-NMR của chất AA1 ...........................................................42
Hình 3.3: Phổ 13
C NMR của chất AA1..........................................................44
Hình 3.4: Phổ HMBC của chất AA1..............................................................46
Hình 3.5: Một số tín hiệu quan trọng trên phổ HMBC của chất AA1............46
Hình 3.6: Công thức cấu tạo của chất AA1 (Sarsasapogenin)........................47
Hình 3.7: Phổ 1
H-NMR của chất AA2 ...........................................................47
Hình 3.8: Phổ 13
C NMR của chất AA2..........................................................49
Hình 3.9: Công thức cấu tạo của AA2 (sarsasapogenone)..............................51
Hình 3.10: Phổ 1
H-NMR của chất AA3 ...........................................................51
Hình 3.12: Phổ HMBC của chất AA3...............................................................54
Hình 3.13: Một số tín hiệu quan trọng trên phổ HMBC của chất AA3............54
Hình 3.14: Công thức cấu tạo của AA3 (marcogenin)......................................55
vi

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và các hợp chất có hoạt tính
sinh học nói riêng là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được
nhiều nhà khoa học quan tâm. Từ xa xưa con người đã khám phá sức mạnh của
thiên nhiên và biết sử dụng nhiều loại thực vật nhằm mục đích chữa bệnh, đồng
thời tránh được một số tác nhân có hại cho sức khỏe con người.
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có
nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt
Nam hiện có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài
Nấm và hơn 2000 loài Tảo, trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc. Theo kết
quả điều tra của Viện Dược Liệu Việt Nam cho thấy nguồn dược liệu
ở nước ta rất phong phú với 3948 loài thực vật và nấm lớn có công dụng làm
thuốc, trong đó 90 % là cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần
xã rừng. Nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới trên 20.000 tấn mỗi
năm. Với nguồn thực vật phong phú như vậy thì hóa học hợp chất thiên nhiên đã
và đang phát triển rất mạnh ở nước ta.
Thực vật họ Thùa (Agavaceae) thường mọc hoang và được trồng phổ
biến ở Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc. Ở Việt Nam thường được trồng ở
vùng núi phía Bắc (Thái Nguyên, Bắc Kạn, Tuyên Quang,...) .
Họ thực vật này đã được sử dụng từ lâu để chữa một số bệnh như: trị
viêm nhiễm, thấp khớp,... Nhiều bài thuốc dân gian có sử dụng các loài thực vật
họ Thùa để chữa bệnh. Trong đó, thực vật Tri mẫu được sử dụng phổ biến nhất.
Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết và các hợp chất được
phân lập ra từ loài Tri mẫu có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, bảo
vệ tế bào và làm giảm đường máu.
1

Tuy nhiên, đến nay trong nước có ít các công trình nghiên cứu về loài Tri
mẫu. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực
vật này cũng chưa được quan tâm đúng mức, chưa có báo cáo cụ thể nào về
thành phần saponin và aglycon.
Dó đó chúng tôi đề xuất đề tài: "Nghiên cứu thành phần aglycon của loài
thực vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides)” để giải quyết vấn đề đó.
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và xác định cấu trúc aglycon từ loài Tri mẫu (Anemarrhena
asphodeloides Bunge).
Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được.
3. Nội dung nghiên cứu
Tổng quan các nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã công bố về loài
Tri mẫu.
Tiến hành chiết xuất các hợp chất từ loài thực vật này.
Tiến hành thủy phân để thu được các aglycon. Phân lập và xác định cấu
trúc của nó bằng các phương pháp phổ.
Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được.
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp lý thuyết
Thu thập, tổng hợp, phân tích tài liệu trong và ngoài nước về loài tri mẫu
để có cái nhìn tổng quan về nó.
Phân tích tài liệu để có cơ sở khoa học về mối quan hệ giữa hoạt tính và
cấu trúc của mẫu nghiên cứu.
4.2. Phương pháp thực nghiệm
- Thu thập mẫu nguyên liệu thực vật
Mẫu thực vật là phần rễ loài Tri mẫu được thu mua ở Viện y học bản địa
Việt Nam.
- Xây dựng phương pháp chiết xuất các chất có trong thực vật.
+ Xác định phương pháp phân tích chính xác, thuận tiện nhất cho quá
trình thực hiện.
2

+ Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu và chiết xuất các hợp chất từ
loài thực vật trên.
+ Xử lý mẫu thực vật và chiết mẫu bằng dung môi khảo sát để lựa chọn
dung môi an toàn, phù hợp.
- Xây dựng và dự kiến phương pháp để thu được các aglycon từ nguyên
liệu đã chọn.
+ Trên cơ sở quy trình chiết đã xây dựng được, tiến hành thủy phân mẫu
chiết cao tổng số, xử lý dung dịch sau thủy phân và chiết các aglycon bằng các
dung môi hữu cơ.
+ Sử dụng phương pháp sắc ký cột bằng các dung môi thích hợp để phân
lập các aglycon từ dịch chiết thủy phân.
+ Xác định cấu trúc hóa học của các aglycon bằng phương pháp phổ.
- Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học.
Dự đoán hoạt tính sinh học điển hình của các chất đã phân lập được dựa
vào cấu trúc của chúng và tiến hành thử hoạt tính sinh học.
5. Dự kiến kết quả đề tài
- Kết quả chiết xuất và phân lập aglycon từ loài Tri mẫu.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất.
6. Dự kiến cấu trúc luận văn
Mục lục
Danh mục: hình, sơ đồ, bảng, kí hiệu
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Thực nghiệm
Chương 3: Kết quả thảo luận
Kết luận
Kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về thực vật họ Thùa (Agavaceae)
Họ Thùa bao gồm khoảng 550-640 loài với khoảng 18-23 chi, phân bố
rộng khắp trong khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới.
Các loài trong họ Thùa có thể là cây mọng nước hoặc không mọng nước.
Lá của chúng có các gân lá song song, lá thường dài và nhọn mũi, thường có
gai cứng ở đỉnh, đôi khi có các gai phụ mọc dọc theo mép lá.[3]
Các loài thực vật họ Thùa thường được sử dụng để sản xuất các dạng đồ
uống chứa cồn ở khu vực Trung Mỹ như bia pulque và rượu mezcal trong khi
các loài khác có giá trị để lấy sợi. Chúng rất phổ biến trong khu vực khô cằn,
nhiều loài có hoa sặc sỡ.[3]
Loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) mà chúng tôi đang
nghiên cứu là loài duy nhất thuộc chi Anemarrhena của họ Thùa (Agavaceae).
1.2. Tổng quan về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)
1.2.1. Tên khoa học
- Tên Khoa học: Anemarrhena asphodeloides Bunge.
- Tên tiếng Việt: Tri mẫu.
- Tên khác: Rhizoma Anemarrhena, zhimu.
1.2.2. Đặc điểm thực vật
Tri mẫu là cây thảo, sống lâu năm. Thân rễ dày, dẹt, mọc ngang bao bọc
bởi những phần còn sót lại của gốc lá, màu đỏ hay vàng đỏ, mặt trong màu
vàng. Lá mọc tụ tập ở gốc thành cụm dày, hình dài, dài 20 - 70 cm, rộng 3 -
6mm, gốc có bẹ to mọc ốp vào nhau, đầu thuôn nhọn, hai mặt nhẵn. [1]
Cụm hoa mọc từ giữa túm lá hình bông, hơi cong, cán thẳng và dài 0,5 -
1m; hoa nhỏ, thơm nở vào buổi chiều, bao hoa màu trắng hay tía nhạt, chia 6
thùy dính nhau ở gốc; nhị 3, chỉ nhị rất ngắn; bầu 3 ô, vòi nhụy hình chỉ [1].
Quả nang, hình trứng, nhọn đầu, có cạnh; hạt 1 - 2, hình tam giác, màu
đen [1]. Mùa hoa: tháng 7 - 8. [1]
4

A: rễ. C: hoa. E: nhụy hoa.
B: cụm hoa D: tràng hoa với bao phấn gắn F: quả nang nẻ ra.
liền với bên ngoài lọn cánh đài. G: hạt hình thoi
Hình 1.1: Các bộ phận cây Tri mẫu
Hình 1.2: Rễ cây Tri mẫu
5

Hình 1.3. Vườn cây Tri
mẫu 1.2.3. Phân bố trong tự nhiên
Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) là loại thảo dược lâu năm
được trồng hoặc mọc hoang trên sườn núi ở Mãn Châu, Mông Cổ, và miền Bắc
của Trung Quốc. [8] Ở Việt Nam, loài thực vật này chủ yếu phân bố ở các tỉnh
phía bắc như Thái Nguyên, Bắc Kạn, Tuyên Quang,...
1.2.4. Công dụng của loài Tri mẫu
Tri mẫu được dùng trị sốt, đái tháo đường, ho đờm thở dốc, ngực nóng
khó chịu, ho lao,….
Một số bài thuốc có Tri mẫu:[1]
- Điều trị các triệu chứng sốt cao, co giật, hôn mê trong viêm não Nhật
Bản B: Tri mẫu 16g, thạch cao 40g; kim ngân, huyền sâm, sinh địa, mỗi vị 16g;
hoàng liên, liên kiều, mỗi vị 12g; cam thảo 4g. Sắc uống.
- Chữa viêm phổi trẻ em thể phong nhiệt, sốt cao: Tri mẫu 6g, thạch cao
20g, kim ngân hoa 16g, tang bạch bì 8g; hoàng liên, liên kiều, hoàng cầm, mỗi
vị 6g; cam thảo 4g. Sắc uống ngày một thang.
- Chữa sốt cao, li bì, mê sảng trong bệnh sởi trẻ em: Tri mẫu 8g; huyền
sâm, gạo tẻ, mỗi vị 12g; sừng trâu 8g, cam thảo 4g. Sắc uống ngày một thang.
- Chữa huyết áp cao, nhức đầu, hoa mắt, khó ngủ: Dùng bài Tri bá bát vị
hoàn gia giảm nêu trên, thêm thảo quyết minh sao 20g, chi tử 12g.
- Chữa nóng âm, háo khát, mồ hôi trộm, ho khan, đái tháo đường: Dùng
bài Tri bá bát vị hoàn gia giảm nêu trên, thêm huyền sâm, thiên môn, thiên hoa
phấn, mỗi vị 16g.
6

1.3. Tinh̀ hinh̀ nghiên cứu thành phần hóa hoc ̣loài Tri mẫu
1.3.1. Các hơp̣chất glycoside
Năm 1963, Kawasaki và cộng sự [42] đã phân lập được Timosaponin A-
III (1) từ loài Tri mẫu. Khi thủy phân saponin này với axit HCl 2N trong etanol
50% thu được sarsasapogenin, D-galactose và D-glucose. Cấu trúc hóa học của
(1) là:
OH
H
3
C
OH O
OH
O
HO
O
O
OH
OH
OH
(1)
H3C
O
CH
3
H3C
O
Năm 1992, từ dịch chiết etanol của loài Tri mẫu, Dong và các cộng sự
[9] đã tìm ra một saponin mới là Anemarsaponin B (2) cùng với hai saponin đã
biết là Anemarsaponin A1 (3) và Anemarsaponin A2 (4).
HO
H3
C
OH O
OH
O
HO
H
O
O
OH
HO
OH
HO
HO
OH O
H3C H C
3
OH O
H3C
O
(2)

7

HO
OH O
OH
O
HO
O
O
O
O
OH
OH
OH
HO
OH O
OH
HO
(3)
HO
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
(4)
Năm 1993, Nakashima và cộng sự [28] đã phân lập được một glycoside
mới là pseudoprototimosaponin AIII (5) từ loài Tri mẫu và được so sánh với
chất đã biết là prototimosaponin AIII (6).
CH3
Gal O
H
Glc
O Glc
CH3
H3C
CH3
O
(5)
8

CH3
Gal O
H
Glc
OGlc CH3
H
3
C
HO
CH3
O
(6)
Đến năm 1994, Setsuo và cộng sự [38] đã phân lập được từ rễ của loài
Tri mẫu bốn saponin steroid mới có tên anemarrhena saponin I-IV (7-10) cùng
với các saponin đã biết là timosaponin A-III (1), marcogenin diglycoside (11),
timosaponin B-II (12) và mangiferin (13). Các saponin thuộc loại glycoside
steroid. Cấu trúc của chúng đã được xác định bằng các phương pháp phổ.
HO
OH O
OH
O
HO
O O
OH
OH
OH
CH3
H3C
OH
CH3
CH3
O
R1
R2
(7): R1=H, R2=OH
(8): R1=OH, R2=H
HO
R
3
OH O
OH
O
HO
O O
OH
OH
OH
CH3
H3C O
CH3
CH3
O
R
1
R2
(9) R1=R3=H, R2=OH
(11) R1=R2=H, R3=OH
9

HO
CH3
OH O
OH
HO
O
OH
OH O CH3
H3C OH
CH3
O
HO
O
O
O
OH
OH
OH
(10)
H3C
CH3
HO
CH3
OH O
OH
HO
O H
O
O
OH
OH
OH
(12)
HO
HO O
O
OH
OH OHO
OH
(13)
HO
O
OH
OH O CH3
OH OH
O
OH
OH
10

Năm 1997, Ma B và các cộng sự [22] đã phân lập được hai saponin
spirostanol mới có tên là anemarsaponin F (14) và G (15). Trên cơ sở phân tích
quang phổ, cấu trúc của (14) và (15) được xác định tương ứng là neogitogenin
3-O-β-glucopyranosyl-(1→2)[β-xylopyranosyl-(1→3)]-β-glucopyranosyl
(1→4)-β-galactopyranoside) (14) và lilagenin 3-O-β-glucopyranosyl-(1→2)-[β-
xylopyranosyl-(1→3)]-β-glucopyranosyl-(1→4)-β-galactopyranoside (15).
HO
O
O
HO
HO CH3
OH O O O
OH OH OH
OH
HO
O
O
O HO
OH
OH
OH
(14)
HO
O
O
HO
HO CH3
OH O O O
OH OH OH
OH
HO
O
O
O HO
OH
OH
OH
(15)
H3C O
CH3
CH
3
O
H3C O
CH3
CH
3
O
Năm 1998, Meng Z và các cộng sự [26] đã phân lập được hai hợp chất từ
loài Tri mẫu bằng phương pháp sắc ký silicagel và phương pháp sắc kí HPLC.
Chúng được đặt tên là timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17).
11

O Glc
OH
O
H
OH
Gal O
Glc
(16)
CH3
O Glc
OCH
3 CH3
O
H
OH
Gal O
Glc
(17)
Năm 1998, nhóm nghiên cứu này tìm ra ba hợp chất saponin mới là
timosaponin B-IV (18), timosaponin B-V(19), timosaponin B-VI(20). Cả ba
chất này đều ở dạng bột, màu trắng [24].
CH3
glc
glc gal O
CH3
H3C O
H3C Glc
O
glc
H
(18)
12

CH3
glc 3
4
glc gal O
glc
2
H
H3C
RO CH3
O
H3C Glc
O
(19) R=H
(20) R=CH3
Cũng trong năm 1998, nhóm nghiên cứu này tiếp tục phân lập thêm một
saponin mới được đặt tên là timosaponin D (21). Hợp chất này cũng ở dạng bột,
màu trắng , nhiệt độ sôi 186 - 190 o
C và có thêm nhóm OH ở vị trí số 2 [25].
HO
gal O
glc
CH3
H
H3C
CH3 O
Glc
O
(21)
Năm 1999, nhóm nghiên cứu này tiếp tục phân lập được bốn saponin mới
từ phần rễ của loài Tri mẫu bằng sắc ký cột và phương pháp sắc ký HPLC là:
timosaponin H1 (22), timosaponin H2 (23), timosaponin I1 (24), timosaponin I2
(25). Bằng các phương pháp phổ, cấu trúc của chúng được xác định như sau [23].
Xyl 3
CH3
4
glc gal O
Glc O
R
CH3
CH
3
O
Glc
2
(22) R=OH, (23) R=OCH3
13

Xyl 3
CH3
4
glc gal O
Glc O
R
CH3
CH3
O
Glc
2
(24) R=OH, (25) R=OCH3
Cũng trong năm 1999, Hong và các cộng sự [11] đã phân lập được hợp
chất saponin steroit từ phần rễ của loài này là xilingsaponin B (26).
Hợp chất (26) là một chất rắn dạng màu trắng, rất dễ tan trong nước,
nhiệt độ sôi 178 - 180 o
C. Công thức được xác định như sau.
H3C
CH2OH
HO O
OH
O
CH2OH CH OH
2
O
O O
OH O
HO
HO
OH
HO
(26)
H3C O
CH3
CH3
O
Năm 2006, Kang và các cộng sự [17] đã phân lập được sáu saponin
steroid từ thân rễ của Tri mẫu là timosaponin N (27), timosaponin E1 (16),
timosaponin O (28), timosaponin E2 (17), purpureagitosid (29) và marcogenin-
3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (30). Trong đó hợp
chất (28) và (29) là hợp chất mới và hợp chất (30) được phân lập lần đầu tiên từ
loài Tri mẫu.
Sáu hợp chất thu được đều ở dạng bột màu trắng, phản ứng Molisch và
phản ứng Liebermann-Burchard cho kết quả dương tính. Phản ứng thuốc thử
14

Ehrlich hiển thị màu đỏ chỉ ra các hợp chất này là saponin furostanol. Qua phân
tích phổ FAB -MS, 1
H NMR và 13
C NMR, cấu trúc hóa học của các chất được
xác định như dưới đây [17].
OH CH3
HO O
R1
OH
O
HO H
HO
HO
OH
OH O
OH
H3C OR3
CH CH3
3
O
R2
O
OH
OH
O
OH
(27) R1=OH, R2=H, R3=H
OH OH
HO
O O O
OH O OH
O
HO
O
OH
O
OH
HO
O OH
O
HO
OH
OH
(28) R1=OH, R2=H, R3=CH3
HO
O
OH
HO
O
OH
H
3
C
OH
CH3 CH3
O
CH3
R2
H
(29)
15

OH H3C
HO
OH O
OH
HO O
OO
OH
HO
OH
H3C O
CH3
CH3
O
(30)
Năm 2007, hai saponin mới được Peng và các cộng sự [35] đã tìm ra từ
phần rễ khô của loài Tri mẫu. Mẫu khô (5,0 kg) được đun hồi lưu với EtOH
70%. Phần cặn thu được tiếp tục được chiết trong ete dầu, EAvà BuOH. Phần
hòa tan BuOH được phân tích bằng phương pháp sắc ký cột, thu được hai hợp
chất là timosaponin IV (31) và timosaponin B IV (32).
OH
O
OH
HO
HO
O
O O
OH
HO
OH
H3C O
CH3
H3C
CH3 O
H
OH
OH O
OH
(31)
CH3
HO
O
OH
HO O
H3C OH
H3C
CH
3
O
HO HO O
H
O OO
OH
OH
O
HO OH
HO
(32)
16

Đến năm 2008, Zhang và các cộng sự [52] đã nghiên cứu thành phần
dịch chiết của phần rễ loài Tri Mẫu và tìm ra một hợp chất mới được đặt tên là
timosaponin B V (33).
OH
CH
3
OH O
HO
O
HO O
OH
O
HO
OH
HO
OH O
OH
H3C
OH O
OCH 3
CH3
CH3
O
(33)
Năm 2013, Liu và các cộng sự [20] đã phân lập từ loài Tri Mẫu hai
saponin steroid mới có tên anemarnoside A (34) và anemarnoside B (35), cùng
với ba hợp chất đã biết là timosaponin J (36), timosaponin B II (12), và
timosaponin B (37).
H
Gal O
H
Glc
(34)
H
H
O Glc
O
O
Gal O
Glc
OH
H
glc
O
CH3
OH
O
OH
OH
(35)
17

Gal O
Glc
glc
O O
O
H
O
H H
H
(36)
Oglc
H
3
C
HO
CH3
CH
3
gal
O
glc
Gal O
Glc
CH3 H
H H
H
(12)
O
O
H
H H
H
(37)
Glc
18

Năm 2014, Yuan và cộng sự [50] đã phân lập được các saponin steroid là
timosaponin X (38), timosaponin Y (39), một pregnane glycoside là
timopregnane B (40), 25S-timosaponin BII (41), protodesgalactotigonin (42) và
timosaponin BII-a (43) từ rễ của loài Tri mẫu.
R2O
H3C OCH 3
H3C
O
CH3
CH3
CH3
H3C
H3C O
CH3
H3C
O
OH
R1O
H
(38)
R1=S1, R2=S3
O CH3
CH3
R1O
OH
R1=S1
(39)
OR2
OH
O
HO
R1O
CH3
H
R1=S2
R1O
H
R1=S2, R2=S3
(40)
R1O
H
(42)
OR2
OH
O
R1=S5, R2=S3
R1O
H
(41)
OR2
OH
O
R1=S4, R2=S3
(43)
19

OH
HO O HO O
OH OH
H
H
HO
H
H
S1= HO S2=
H H
O O
H HO H H
O
OH
HO
OH
HO H H
H OH H OH
OH OH
H H
O
S4=
HO HO
S3= OH OH
HO H H H
H
OH H OH
OH OH
H
O
HO H
O
H
O
HO
OH O OH
S5=
O H
H
OH OH
H H
OH
O
H H
O
OH
HO
H
OH
Nhận xét:
Các hợp chất glycoside trong loài Tri mẫu hầu như thuộc loại spirostanol
glycoside có chứa dị vòng 5 hoặc 6 cạnh với dị tố oxi. Ở vị trí C số 3 thường có
liên kết với phân tử đường. Một số hợp chất ở vị trí C số 2 có liên kết với nhóm
OH, cũng có hợp chất mở dị vòng 6 cạnh ở vị trí C số 22.
20

1.3.2. Các hợp chất aglycon
Năm 1999, Liu và các cộng sự đã đưa ra một nghiên cứu về việc xác
định thành phần sarsasapogenin (44) từ loài Tri mẫu bằng phương pháp hệ
thống sắc ký khí (GC) [21]. Ngoài ra, cũng có một số tài liệu đề cập đến việc
phân lập aglycon này từ loài Tri mẫu và thử nghiệm hoạt tính sinh học như hoạt
tính bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ, ức chế tế bào ung thư và hạ đường huyết…
[45], [46], [47], [51].
H3C
H3C O
CH3
CH3
O
HO
(44)
Gần đây, một số nghiên cứu đã đề cập đến việc tối ưu hóa cấu trúc của
sarsasapogenin nhằm nâng cao hoạt tính của aglycon này.
Trong báo cáo gần đây nhất vào năm 2016, Che và các cộng sự [18] đã
phân lập được sarsasapogenin từ loài Tri mẫu và tiến hành bán tổng hợp được 9
dẫn xuất trong đó dẫn xuất (48), (49), (53), (54) và (55) có khả năng ức chế
Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe tốt hơn so với sarsasapogenin.
21

22
22

Năm 2012, Peng và cộng sự [34] đã tổng hợp 8 hợp chất dạng este ở vị
trí cacbon số 3 từ sarsasapogenin bằng các phản ứng este hóa. Đồng thời nhóm
nghiên cứu này cũng thử khả năng chống lão hóa thông qua sự ức chế của nó
với enzym β-gal. Nhận thấy chất (56), (57), (61), (63) có khả năng chống lão
hóa tốt.
CH3
H3C O
CH3
CH3
O
CH3
H3C O
CH3
CH
3
O
HO R
(56)R=HSO4
-
(60)R=C6H5COO -
(57)R=HCOO -
(61)R=C15H31COO -
(58)R=CH3COO -
(62)R= Cl -
(59)R=C2H5COO -
(63)R=Br -
Nhận xét:
Như vậy từ thành phần aglycon trong loài Tri mẫu có thể bán tổng hợp ra
nhiều dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học tốt hơn và có giá trị thức tiễn.
Đến nay chỉ có một số công trình phân lập aglycon sarsasapogenin để
nghiên cứu hoạt tính sinh học và bán tổng hợp khung cacbon này. Còn các khung
aglycon khác hiện nay chưa có báo cáo nào về việc phân lập chúng dưới dạng tinh
khiết và xác định cấu trúc hóa học, bán tổng hợp và thử hoạt tính sinh học.
1.3.3. Các hợp chất phenolic
Trong loài Tri mẫu, ngoài thành phần chính là các saponin và sapogenin
thì còn có các hợp chất phenolic, cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu về
hợp chất này.
Năm 2005, Tsukamoto và các cộng sự [43] đã phân tách từ loài Tri mẫu
ở Nhật Bản bốn hợp chất phenolic: 2,6,4-trihydroxy-4-methoxybenzophenone
23

(64), 7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman (65), broussonin B (66) và
nyasol (cis-hinokiresinol) (67).
O
HO
OH
OH
OH
O
OCH 3 OH
(64) (65)
H3CO OH
OH
CH2
OH OH
(66) (67)
Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Qin [36] đã phân lập được magiferin
(68) và neomagiferin (69) từ lá loài Tri mẫu. Magiferin và neomagiferin ở
dạng bột màu vàng.
HO O OH
R1O R2
O OH
(68): R1=H, R2=Glu
(69): R1=Glu, R2=Glu
Năm 2009, Youn và các cộng sự [49] đã phân lập được 6 hợp chất
phenolic từ rễ Tri mẫu là 7,4'-dihydroxy homoisoflavonoid (70); (2S)-7,4'-
24

dihydroxy-5-methoxyflavaone (71) cùng với 4,4'-dihydroxychalcon (72), 2'-O-
methylphlorethin (73); 1,3-bis-di-phydroxyphenyl-4-penten-1-one (74) và 2,4'-
dihydroxy-4-metoxybenzophenon (75). Trong đó hợp chất (70)-(73) được phân
lập lần đầu tiên từ loài thực vật này.
OH
HO O OH HO
O O O
(70)
O
HO
(72)
CH2
HO
O
(74)
(71)
O OCH 3
OH HO OH
(73)
OH
HO HO O
O
(75)
Nhận xét: Các hợp chất phenolic chủ yếu có bộ khung cacbon: C6-C3-
C6, C6-C4-C6, C6-C5-C6. Các dẫn xuất nyasol và isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn.
1.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu
1.4.1. Hoạt tính sinh học của các saponin
Như đã trình bày ở trên, trong loài thực vật Tri mẫu, thành phần hóa học
chủ yếu là các saponin, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài này cũng
định hướng theo tác dụng sinh học của loại hợp chất đó. Trong đó, đáng chú ý
25

hơn cả là tác dụng bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệm, tác
dụng ức chế tế bào ung thư và tác dụng hạ đường huyết.
1.4.1.1. Tác dụng bảo vệ tế bào và cải thiện trí nhớ
Năm 2005, Liu và các cộng sự [33] nghiên cứu ảnh hưởng của
timosaponin đến khả năng cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệm với tác nhân
gây tổn thương là Aβ. Aβ có thể gây suy giảm trí nhớ ở chuột một cách trầm
trọng, nó làm hạ thấp hoạt động SOD và khả năng chống oxy hóa cũng như
tăng mức độ MDA. So sánh giữa những con chuột bình thường với những con
chuột được tác động bởi timosaponin thì thấy những con chuột sau khi được xử
lí với hợp chất (12), (16), (36) thì hoạt động SOD và khả năng oxy hóa được
nâng cao đồng thời mức độ MDA giảm. Từ đó cho thấy các timosaponin có thể
nâng cao đáng kể năng lực trí nhớ ở chuột thí nghiệm.
Trong nghiên cứu gần đây nhất năm 2016, Che và các cộng sự [18] cũng
đã chỉ ra khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp chất
saponin. Các giá trị IC50 (μM) được ghi nhận như sau: hợp chất TA III (1):
IC50 = 2.3±0.2, TA1: IC50 = 6.1±2.8, TA IV: IC50 = 4.2±1.2, timosaponin B1:
IC50 > 100, hợp chất (12) > 100. Kết quả trên cho thấy khả năng ức chế Aβ42
trên tế bào N2A-APPswe của các saponin tương đối tốt, nhất là hợp chất (1).
Một nghiên cứu khác của Dong và các cộng sự (2009) đã chỉ ra hợp chất
(1) có khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase (một tác nhân gây bệnh
Alzheimer) để cải thiện trí nhớ. Cơ chế của quá trình bảo vệ tế bào não của chất
này có thể được giải thích bằng sự chống viêm của nó. Nó cũng thể hiện khả
năng ức chế sự truyền dẫn tín hiệu NF-kB trong tế bào BV-2 và trong tế bào
não SK-N-SH trên mô hình chuột thực nghiệm, đây là một trong những thành
tố có ảnh hưởng lớn đến sự mất trí nhớ [7].
Ngoài ra, dịch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu được Jung và các cộng
sự đưa ra kết quả nghiên cứu về khả năng bảo vệ tế bào não vào năm 2007 [32].
26

Sự thiếu máu cục bộ xảy ra khi bị tắc ở động mạch não phải. Dịch chiết
tổng số của loài thực vật Tri mẫu ức chế đáng kể sự xâm nhập bạch cầu của các
mô não thiếu máu cục bộ, điều này được xác định dựa trên hoạt động của
enzym MPO. MPO đã giảm đáng kể khi dùng dịch chiết từ loài Tri mẫu trong
vùng thể vân và vỏ não. Những phát hiện này đóng một vai trò rất quan trọng
trong việc điều trị chấn thương não do thiếu máu cục bộ gây ra, và dự đoán loài
Tri mẫu có thể là một loại thảo dược chính được sử dụng để bảo vệ tế bào não
sau khi bị tổn thương do thiếu máu cục bộ [32].
1.4.1.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư
Năm 2001, Takeda và các cộng sự [41] đã đưa ra một nghiên cứu quan
trọng và đáng chú ý về khả năng ức chế sự tăng trưởng và kích thích sự chết
của tế bào tự hủy từ loại thảo dược Tri mẫu ở các dòng tế bào ung thư dạ dày.
Sau khi kết thúc quá trình nghiên cứu, họ kết luận rằng loài Tri Mẫu có khả
năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 và Kato-III và có thể gây
ra quá trình tự chết của tế bào này.
Đến năm 2008, Che và các cộng sự [40] đã chỉ ra hợp chất (1) có tiềm
năng là một tác nhân chống ung thư HeLa. Bên cạnh đó chất này cũng thể hiện
khả năng ức chế nhiều tế bào ung thư như: ung thư biểu bì (SUNE-1), ung thư
gan (HepG2), ung thư vú (MCF-7) với các giá trị IC50 dao động từ 8.5 - 10.1
(μmol/l). 1.4.1.3. Tác dụng hạ đường huyết
Một chế phẩm cổ truyền được bào chế từ thân rễ Tri mẫu được thử
nghiệm trên chuột nhắt KK-Ay (chuột mắc một típ đái tháo đường không phụ
thuộc insulin). Chế phẩm này (1700 mg/kg), làm giảm đường máu ở chuột nhắt
KK-Ay từ 557 ± 17 xuống 383 ± 36 (mg/1000 ml) trong vòng 7h sau khi cho
uống một liều thuốc (P < 0,001). Thuốc cũng làm giảm đường máu và làm tăng
sự dung nạp glucose trong vòng 5 tuần sau khi cho uống những lều lặp lại trên
chuột nhắt KK - Ay [1].
27

Năm 2004, Hoa và các cộng sự đã chứng minh dịch chiết ethanol của Tri
mẫu có tác dụng kích thích sự tiết insulin của đảo tụy ở chuột bình thường và
chuột đái tháo đường ở nồng độ 2,4 và 8 (mg/ml) [10].
1.4.1.4. Một số hoạt tính sinh học khác
Các hợp chất saponin được phân lập từ các dịch chiết ethanol và dịch
chiết nước từ phần rễ Tri mẫu có khả năng chống enteroviruts 71(EV71) gây
bệnh tay chân miệng, điều này được đưa ra trong nghiên cứu của Liu và cộng
sự năm 2014. Trong số các saponin, hợp chất timosaponin B-II (12) có chỉ số
IC50 (4,3 ± 2,1 mM, SI = 92,9), chất đối chứng là ribavirin (IC50 = 361,7 ±
104,6 mM, SI = 2,4). So sánh 2 hợp chất này thì thấy hợp chất (12) có SI cao
hơn gấp 40 lần so với chất đối chứng [19].
Trong báo cáo của Meng và các cộng sự [16] được công bố năm 2000
cho thấy timosaponin E1 (16) và E2 (17) được phân lập từ loài Tri Mẫu có tác
dụng chống oxi hóa, gây ảnh hưởng đến gốc superoxide trong bạch cầu của con
người. Hợp chất (16) và (17) ức chế đáng kể N-formyl-methionyl-leucyl-
phenylalanine (FMLP) - tác nhân gây ra gốc superoxide. Ngoài ra, protein
tyrosine kinase tham gia vào gốc superoxide cũng giảm đáng kể trong bạch cầu
của con người khi dùng hợp chất (16), (17).
Anemarsaponin B (ASB) (2) thể hiện khả năng chống viêm tiềm tàng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy tác dụng chống viêm của ASB trong LPS ở đại
thực bào RAW 264,7 có sự liên kết với sự ức chế hoạt động của enzym NF- kB
thông qua con đường kích hoạt p38 MAP.[15]
Ngoài ra, các saponin của loài Tri mẫu điều trị hiệu quả sự loãng xương
ở chuột thông qua sự hình thành xương nhưng không ức chế sự tái hấp thu
xương [31] và còn có tác dụng chống oxi hóa.[48]
1.4.2. Hoạt tính sinh học của các aglycon
Trong loài Tri mẫu có nhiều khung aglycon, nhưng aglycon sarsasapogenin
(44) là khung cơ bản nhất của loài thực vật này. Đến nay chỉ có một số công trình
28

phân lập aglycon này để nghiên cứu hoạt tính sinh học. Hoạt tính sinh học điển
hình nhất của khung aglycon này là khả năng bảo vệ tế bào não để nâng cao
khả năng trí nhớ và ức chế tế bào ung thư.
1.4.2.1. Tác dụng bảo vệ tế bào
Năm 2005, Hu và các cộng sự [13] đã thử khả năng nâng cao trí nhớ của
khung aglycon này trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương là
amyloid β-peptide, kết quả cho thấy nhóm thực nghiệm với chất này có thể cải
thiện khả năng nhớ và học tập, với nhóm đối chứng là tacrin.
Năm 2010, cũng nhóm nghiên cứu này đã chứng minh sự ảnh hưởng của
aglycon này đến vai trò của phần kết nối vòng AMP (CREB) đối với độ dầy
đặc của thụ thể M1 trên tế bào CHOm1 trong quá trình trình già đi, nó có khả
năng nâng cao độ dầy đặc của thụ thể M1 tốt cho các CREB và phosphor-
CREB để chống lại quá trình lão hóa [12].
Năm 2011, Wang và các cộng sự [45] đã chứng minh sự ảnh hưởng của
sarsasapogenin đến sự phát triển theo hình cây của tế bào thần kinh vỏ não, kết
quả cho thấy chất này có khả năng làm tăng sự phát triển của các tế bào thần
kinh hình cây trên vỏ não với các nồng độ khác nhau thông qua con đường kích
thích PI3K/Akt/mTOR. Điều này rất tốt cho việc bảo vệ tế bào và kích thích sự
ghi nhớ.
Đến năm 2012, Yue [51] và cộng sự đã nghiên cứu thực nghiệm và chứng
minh rằng sarsasapogenin có thể bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não bởi sự tác động
gây tổn thương của axit glutamic, kết quả cũng cho thấy chất này có khả năng bảo
vệ tế bào này thông qua con đường kích hoạt sự truyền dẫn thông tin của
PI3K/Akt/mTOR và làm tăng hoạt tính của protein caspase-3 và μ-calpain.
Trong nghiên cứu gần đây nhất năm 2016, Che và các cộng sự [18] cũng
đã chỉ ra khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp chất
aglycon. Các giá trị IC50 (μM) được ghi nhận như sau: hợp chất sarsasapogenin
(44): IC50 = 53.0±9.0; các hợp chất được bán tổng hợp từ (44) là (48), (49),
(53), (54), (55) có giá trị IC50 lần lượt là: 6.5±2.1, 27.0±8.0, 7.2±2.2, 9.3±3.5,
7.3±4.0. Còn các hợp chất aglycon khác như: tigogenin, smilagenin… có giá trị
29

IC50 > 100. Kết quả trên cho thấy khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-
APPswe của các aglycon tương đối tốt, nhất là các dẫn xuất được bán tổng hợp
từ chất sarsasapogenin.
1.4.2.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư
Năm 2005, Trouillas và cộng sự đã chứng minh khả năng ức chế tế bào ung
thư xương người 1547 của aglycon sarsasapogenin thông qua việc gây ra sự chết
của tế bào này dựa vào chu trình khép kín của tế bào trong pha G2/M. [44]
Năm 2008, Ni và cộng sự [30] chứng minh vai trò cần cho sự sống trong
việc gây chết tế bào ung thư HepG2 và HeLa. Kết quả cho thấy rằng,
sarsasapogenin thúc đẩy phản ứng oxy hóa (ROS) ti thể xảy ra sớm giúp kích
hoạt quá trình tự chết của tế bào và cytochrome C được giải phóng nhiều hơn,
từ đó bước đầu kết luận sarsasapogenin có khả năng gây ra quá trình tự chết tế
bào HepG2. Bao và cộng sự [5] cũng đã chỉ ra sự phụ thuộc của nồng độ và
thời gian vào khả năng sống được của tế bào HepG2.
Năm 2013, Shen và cộng sự [39] đã cho rằng sarsasapogenin có thể ức
chế khối u trong các thực nghiệm in vitro, và cũng có thể ức chế tế bào ung thư
HeLa gây ra bởi các quá trình oxi hóa stress.
1.4.2.3. Một số hoạt tính sinh học khác
Mục đích nghiên cứu của Wu và các cộng sự [37] đưa ra vào năm 2006
là để tìm ra những ảnh hưởng của sarsasapogenin được phân lập từ loài Tri mẫu
đến hoạt động chống trầm cảm ở chuột trong bài kiểm tra có tên là mô hình bơi
cưỡng bức (the forced swimming). Bộ dụng cụ là một bình hình trụ được làm
bằng polycarbonate (cao 25cm, đường kính 10 cm), nước (24o
C) được cho vào
bình đến mức 15cm. Chuột thí nghiệm được cho uống sarsasapogenin 60 phút
trước khi làm thí nghiệm. Chuột được đặt vào bình và thử nghiệm trong 6 phút.
Cho chuột bơi tự do trong 2 phút đầu và từ phút thứ 3, thời gian bất động của
chuột được ghi nhận.
Kết quả cho thấy khi dùng sarsasapogenin với liều 12.5, 25 và 50 mg/ kg
thì giảm thời gian bất động tương ứng với kết quả là 26,6% (P< 0,05), 32,7%
30

(p< 0,05) và 48,7% (p<0,01). Nghiên cứu này chỉ ra khả năng chống trầm cảm
tiềm năng của sarsasapogenin từ loài Tri Mẫu dựa vào các dẫn chứng về tâm lí,
dược lý, hóa học và các tài liệu về thần kinh.
Ngoài ra, sarsasapogenin còn có tác dụng hạ sốt. Phân đoạn saponin từ
thân rễ tri mẫu và sản phẩm thủy phân sarsasapogenin cũng như dẫn chất
hemisucinyl đều có tác dụng ức chế mạnh trên Na+
/K+
-ATPase và làm giảm
lượng oxy thu nhận trong gan được xử lý với thyroxin. Tác dụng ức chế của
dẫn chất hemisucinyl còn mạnh hơn cả tác dụng của ouabain. Sarsasapogenin
cũng ức chế Na+
/K+
-ATPase của hồng cầu người. Tác dụng ức chế chậm và có
thể tăng lên do ion natri từ bên ngoài và đối kháng bởi ion rubidi từ bên ngoài.
Tác dụng ức chế trên ATPase có thể có liên quan với tác dụng hạ sốt của
sarsasapogenin. [1]
Kết luận: Như vậy, các chất được phân lập từ loài tri mẫu có rất nhiều
hoạt tính quan trọng và thiết thực, trong đó timosaponin A-III và aglycon
sarsasapogenin được nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là tác dụng bảo vệ tế
bào não, chống tế bào ung thư và hạ đường huyết.
31

Chương 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là mẫu khô loài Tri mẫu được Viện y học bản địa
Việt Nam thu mua và kiểm định. Mẫu được bảo quản cẩn thận trước khi tiến
hành nghiên cứu.
2.2. Hóa chất và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
2.2.1.1. Hóa chất
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết.
Dung môi được sử dụng là: etanol, n-hexan, etylaxetat (EA), axeton, clorofom,
cacbon tetraclorua và ete dầu đều là các dung môi tinh khiết.
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel
60 F254, Merck, có độ dày 0,2 mm.
Bản mỏng: được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng ngắn và dài
(254; 365 nm), sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 (vanilin 1,2 g;
MeOH 200 ml; CH3COOH 25 ml; H2SO4 11 ml), hơ nóng trên bếp điện cho
đến khi các vệt trên bản mỏng hiện màu rõ nhất.
Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 197-400 mesh (0,040-0,063 mm).
Hóa chất khi thủy phân: axit H2SO4, NaOH rắn.
2.2.1.2. Hóa chất dùng để thử hoạt tính sinh học
Dimetylsulfoside (DMSO), phosphate buffer 10 mM (pH 6.8), cơ chất p-
nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), 20 µl α-glucosidase (0,5U/ml), 120
µl phosphate buffer 100mM (pH 6.8) và 80 µl Na2CO3 0,2M.
2.2.2. Thiết bị
Máy cất quay chân không, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập
chất hữu cơ.
32

Phổ khối lượng ESI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng
lượng bắn phá ở 70 e. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H, 13
C-NMR và HMBC đ-
ược đo trên máy Bruker 500MHz.
Cân phân tích, máy đo OD ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập được
2.3.1. Xử lý mẫu thực vật
Mẫu rễ loài Tri mẫu sau khi lấy về được sấy khô ở 50o
C, chặt nhỏ và tiến
hành ngâm chiết trong dung môi.
2.3.2. Chiết tách các chất
Mẫu phần rễ của loài Tri mẫu được chặt nhỏ và chiết hồi lưu với etanol
ở 70o
C. Quay cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết etanol.
Thêm nước và axit H2SO4 vào cặn, khuấy đều, đun ở 80o
C để thủy phân. Sau khi
kết thúc thủy phân, dung dịch được trung hòa bằng NaOH đến môi trường trung
tính, lọc và thu được cặn sau thủy phân. Cặn đó chiết lần lượt với các
dung môi có độ phân cực tăng dần: clorofom và etylaxetat (EA). Sau đó cất thu
hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn tổng số.
Phân lập cặn tổng số và các cặn ở các phân đoạn bằng phương pháp sắc
ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp.
2.3.3. Xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương
pháp phổ hiện đại như phổ khối lượng HR-ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt
nhân một chiều (1
H-NMR, 13
C-NMR), phổ hai chiều HMBC và so sánh với tài
liệu tham khảo.
2.4. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme alpha-glucosidase
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được
thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự.
33

2.5. Thực nghiệm
2.5.1. Quá trình phân lập các chất từ phần rễ của loài Tri mẫu
2.5.1.1. Chiết xuất cao etanol từ rễ của loài Tri mẫu
Mẫu khô (5 kg) sau khi lấy về được đem chặt nhỏ và chiết hồi lưu với
etanol 90% ở nhiệt độ 70˚C
trong thời gian 3 giờ và lặp lại 3 lần. Cất thu hồi dung
môi được cặn chiết etanol (900 gam)và phân bố đều trong lượng nước vừa đủ.
2.5.1.2. Thủy phân cặn chiết etanol từ rễ của loài Tri mẫu
Cặn etanol thu được đem thủy phân với axit H2SO4 , đun hồi lưu ở nhiệt
độ 80˚C
trong 4h, khuấy đều. Sau khi phản ứng kết thúc, dung dịch được trung
hòa bằng NaOH đến môi trường trung tính. Lọc lấy phần cặn. Phần cặn được
rửa với nước để loại bỏ các muối vô cơ.
Phần cặn thu được sau khi thủy phân được nghiền nhỏ và chiết lần lượt
với clorofom và etylaxetat (EA). Cất thu hồi dung môi thu được các cao chiết
tương ứng có khối lượng là: 50 gam và 70 gam.
Quy trình chiết, tách và thủy phân mẫu phần rễ của loài Anemarrhena
asphodeloides (Bunge) được nêu trong sơ đồ 2.1 dưới đây.
5 kg mẫu khô
loài Tri Mẫu
- Chặt nhỏ
- Chiết trong etanol (90%)
Cặn chiết etanol
- Thủy phân với H2SO4
- Trung hòa axit dư với NaOH
- Lọc lấy cặn
Cặn sau khi th ủy phân
- Nghiền nhỏ
- Chiết lần lượt với clorofom, etyl
axetat
Phần không tan Cao clorofom
(50 gam)
Cao etyl axetat
(70 gam)
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết xuất và thủy phân mẫu phần rễ
của loài Anemarrhena asphodeloides (Bunge)
34

Các cao chiết của CHCl3, EA được sắc ký bản mỏng với các hệ dung
môi EA: CHCl3, n-hexan: axeton, ete dầu : CHCl3. Chúng tôi thấy rằng hai
dịch chiết này cho các vết chất tương đương nhau nên đã tiến hành gộp lại được
cao tổng số (CHCl3+ EA).
2.5.1.3. Phân lập các chất từ cao tổng
Với phần cao chiết vừa gộp ở trên chúng tôi tiến hành phân lập các hợp
chất bằng sắc ký cột. Cao chiết được hòa tan vào lượng vừa đủ etyl axetat và
nhỏ từ từ vào 200 g silicagel để tạo hỗn hợp chạy cột, nghiền thành bột mịn để
các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử
dụng để đưa lên cột sắc ký.
Cột sắc ký được nhồi với lượng silicagel là 1500 g theo phương pháp
nhồi khô với dung môi ổn định cột ban đầu là n-hexan 100%. Hệ dung môi rửa
giải: n- hexan: axeton với tỉ lệ: 20/1; 10/1 và 5/1 (v/v) thu được 8 phân đoạn.
Phân đoạn 1 gồm các ống số 2 đến 3 được gộp lại, được tiến hành sắc ký
với hệ dung môi rửa giải là n-hexan: axeton với tỉ lệ lần lượt là 100/1, 50/1và
25/1 (v/v) thu được chất AA2 (9mg) màu trắng vô định hình, có màu vàng khi
hiện màu với H2SO4 đặc trên bản mỏng và hơ nóng. Phân đoạn 3, kết tinh lại
trong EA thu được chất AA1(1000 mg) là tinh thể không màu. Hai chất rắn này
được làm khô và bảo quản trong các lọ đựng mẫu.
Phân đoạn 6 gồm các ống số 24 đến 26 được gộp lại, được tiến hành sắc
ký với hệ dung môi rửa giải là CCl4: EA với tỉ lệ lần lượt là 5/1, 3/1(v/v) thu
được chất AA3 (25 mg) màu trắng vô định hình. Hai chất rắn này được làm khô
và bảo quản trong các lọ đựng mẫu.
Quy trình phân lập chất từ cao tổng được nêu trong sơ đồ 2.2 dưới đây
35

36
Cao EA+ CHCl3 (120 g)
- Chạy sắc kí cột silicagel
- Hệ dung môi: n-hexan: axeton = 20/1,10/1. 5/1.
- Thông cột bằng metanol
PĐ 1: PĐ 2: PĐ 3: PĐ 4: PĐ 5: PĐ 6: PĐ 7: PĐ 8:
ống 2-3 ống 4 -8 ống 9-13 ống 14-17 ống 18-23 ống 24-26 ống 27-29 ống 29-34
- Hệ dung môi: n-hexan:
axeton = 100/1, 50/1,25/1.
- Thông cột bằng EA
Kết tinh lại
trong EA
- Hệ dung môi: CCl4: EA = 5/1, 3/1.
-Thông cột bằng EA
Chất AA1 Chất AA3
Chất AA2
(9 mg) (1000 mg) (25 mg)
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các chất từ cao tổng số
36

2.5.2. Dữ kiện phổ của các chất phân lập được
2.5.2.1. Chất AA1
Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất AA1 được tiến hành đo trên
hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học, Đại học KHTN-ĐHQG
trong dung môi CDCl3, chất chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả dữ liệu phổ
NMR của chất AA1 được tổng hợp ở bảng 2.1 dưới đây:
Bảng 2.1. Số liệu phổ NMR của AA1
Ví trí Số liệu đo 13
C NMR (ppm) 1
H NMR (ppm), J (Hz)
1 29.95 1.53-1.78 (m)
2 27.81 1.16-1.78 (m)
3 67.08 4.04 (1H, s)
4 33.53 1.40-1.67 (m)
5 36.52 2.01 (m)
6 26.56 1.36 (m)
7 26.54 1.40-1.95 (m)
8 35.27 1.78 (m)
9 40.31 1.76 (m)
10 35.27
11 20.90 1.56 (m); 1.67 (m)
12 39.85 1.55 (m); 1.65 (m)
13 40.67
14 56.47 2.03 (m)
15 31.74 2.01 (m)
16 81.02 4.33 (1H, q, J= 7.8 Hz)
17 62.08 2.02 (m)
18 16.50 0.91 (3H, s)
19 23.92 0.69 (3H, s)
20 42.11 2.03 (m)
21 14.34 1.02 (3H, d, J = 7.1 Hz)
22 109.75
23 27.08 1.76-1.83 (m)
24 25.77 1.87 (m)
25 25.94 1.87 (m); 1.89 (m)
26 65.14
3.88 (1H, dd, J = 11.2, 2.7 Hz).
3.23 (1H, d, J = 11.2 Hz)
27 16.05 0.92 (3H, d, J = 6.9 Hz)
37

2.5.2.2. Chất AA2
Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất AA2 cũng được tiến hành
đo trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học, Đại học
KHTN_ĐHQG trong dung môi CDCl3, chất chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả
dữ liệu phổ của chất AA2 được tổng hợp ở bảng 2.2 dưới đây.
Bảng 2.2: Số liệu phổ NMR của AA2
Ví trí
Số liệu đo 13
C NMR Một số tín hiệu cộng hưởng quan trọng
(ppm) trên 1
H NMR của AA2 (ppm), J (Hz)
1 37.01
2 37.18 2.32 (1H, m, H-2α)
3 213.09
4 42.35 2.69 (1H, dd, J=14.6, 14.0Hz, H-4α)
5 44.24
6 26.55
7 26.04
8 35.20
9 40.85
10 35.03
11 21.02
12 40.13
13 40.68
14 56.28
15 31.71
16 80.88 4.42 (1H, q, J= 7.6 Hz)
17 62.09
18 16.48 1.04(3H, s)
19 22.68 0.79 (3H, s)
20 42.15
21 14.34 1.08 (3H, d, J = 7.1 Hz)
22 109.73
23 27.08
24 25.78
25 25.96
26 65.16 3.95 (1H, dd, J = 11.1, 2.7 Hz).
3.31 (1H, d, J = 11.1 Hz)
27 16.05 1.00 (3H, d, J = 6.9 Hz)
38

2.5.2.3. Chất AA3
Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất AA3 được tiến hành đo trên
hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học, Đại học KHTN_ĐHQG
trong dung môi CDCl3, chất chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả dữ liệu phổ của
chất AA3 được tổng hợp ở bảng 2.3 dưới đây.
Bảng 2.3: Số liệu phổ NMR của AA3
Ví trí Số liệu đo 13
C NMR (ppm) 1
H NMR (ppm), J (Hz)
1 36.89 1.73-1.78 (m)
2 67.69 3.62 (d, J = 10.5 Hz)
3 69.88 3.94 (1H, s)
4 32.34 1.40-1.67 (m)
5 41.31 2.01 (m)
6 26.56 1.36 (m)
7 25.78 1.40-1.95 (m)
8 35.36 1.78 (m)
9 40.20 1.76 (m)
10 35.46
11 21.07 1.56 (m); 1.67 (m)
12 38.41 1.55 (m); 1.65 (m)
13 40.65
14 56.34 1.78 (m)
15 31.71 2.01 (m)
16 80.96 4.33 (1H, q, J = 7.8 Hz)
17 62.08 2.00 (m)
18 16.49 0.92 (3H, s)
19 23.76 0.77 (3H, s)
20 42.14 2.03 (m)
21 14.34 1.08 (3H, d, J = 7.1 Hz)
22 109.75
23 27.09 1.76-1.83 (m)
24 25.78 1.87 (m)
25 25.96 1.87 (m); 1.89 (m)
26 65.16 3.88 (1H, dd, J = 11.1, 2.7 Hz).
3.23 (1H, d, J = 11.1 Hz)
27 16.05 0.97 (3H, d, J = 6.9 Hz)
39

2.5.3. Xác định khả năng ức chế α-glucosidase
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được
thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cs.
Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong phosphate buffer
10 mM (pH6.8) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 1000
g/ml, 200g/ml; 40g/ml; 8g/ml; 0.16g/ml.
20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) và 120 µlphosphate buffer 100mM (pH
6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37o
C trong 15 phút.
Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào
từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37o
C trong 60 phút.
Chuẩn bị mẫu đối chứng
Acarbose là thuốc đặc trị để điều trị bệnh tiểu đường, là một tetrasacharid,
có khả năng ức chế men -glucosidase ruột đặc biệt là sucrase, làm chậm tiêu hóa
và hấp thu carbohydrat. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác và
đo OD ở bước sóng 405 nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
Công thức tính phần trăm ức chế enzyme α-glucosidase
Khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu thử được xác định theo
công thức sau:
% ức chế = (1 - Amẫu thử/ A đối chứng )*100
Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank
Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu
Cách tính giá trị IC50
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm
máy tính TableCurve 2D.
40

Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập các hợp chất
Mẫu phần rễ của loài Anemarrhena asphodeloides Bunge (5 kg) được
chặt nhỏ được chiết hồi lưu sau đó thủy phân trong môi trường axit (xem mục
2.5.1.1, 2.5.1.2) thu được 50 g cặn clorofom và 70 g cặn etylaxetat (sơ đồ 2.1).
Quá trình phân lập các chất từ cặn tổng sau khi thủy phân được trình bày
chi tiết ở phần thực nghiệm (xem mục 2.5.1.3).
Từ 120 g cao tổng (CHCl3 + EA) được phân tách bằng sắc ký cột
silicagel với các hệ dung môi khác nhau thu được 3 chất sạch: ký hiệu là AA1,
AA2, AA3.
+ Chất AA1: 1000 mg, hiệu suất 0,02 % so với trong lượng mẫu khô.
3.2. Xác định cấu trúc chất tách được
Cấu trúc hóa học của 3 chất sạch: AA1, AA2, AA3 được xác định dựa
vào dữ liệu phổ 1
H-NMR, 13
C-NMR và so sánh với tài liệu tham khảo.
3.2.1. Chất AA1
3.2.1.1. Phân tích phổ khối MS
Phổ khối EIS-MS của chất AA1 có pic ion phân tử ở m/z 417,43 [M+H]+
(100%), 399,42 [M+H- H2O]+
, kết hợp với số nguyên tử cacbon trên phổ 13
C-
NMR từ đó xác định được công thức phân tử là C27H44O3.
41

Hình 3.1: Phổ khối lượng EIS-MS của AA1
3.2.1.2. Phân tích phổ 1H - NMR (CDCl3, ppm)
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất AA1
42

Bảng 3.1: Mốt số tín hiệu cộng hưởng trên 1
H-NMR
của chất AA1 và Sarsasapogenin
Vị trí của H
AA1 Sarsasapogenin
δH (ppm), J (Hz) δH (ppm), J (Hz)[14]
18-CH3 0.91 (3H, s) 0.98 (3H, s)
19-CH3 0.69 (3H, s) 0.76 (3H, s)
21-CH3 1.02 (3H, d, J = 7.1) 1.08 (3H, d, J = 7.1)
27-CH3 0.92 (3H, d, J = 6.9) 0.97 (3H, d, J = 6.9)
26 3.88 (1H, dd, J = 11.2, 2.7, Hβ-26) 3.95 (1H, dd, J = 11.0, 2.7)
3.23 (1H, d, J = 11.2, Hα-26) 3.29 (1H, d, J = 11.0)
H-3 4.04 (1H, s) 4.10 (1H, m)
H-16 4.33 (1H, q, J= 7.8) 4.41 (1H, q, J = 7.7)
Phổ 1
H - NMR của chất AA1 cho thấy 2 tín hiệu singlet ở δ = 0.91 ppm
và 0.69 (3H) và 2 tín hiệu doublet ở δ = 1.02 ppm (J = 7.1 Hz) và 0.92 (J = 6.9
Hz) lần lượt tương ứng với 4 nhóm metyl ở C-18, C-19, C-21, C-27.
Ở H-26 có tín hiệu doublet ở δ = 3.23 (J = 11.2 Hz) của Hα và δ = 3.88 (J
= 11.2; 2.7 Hz) của Hβ là hai tín hiệu cộng hưởng của hai proton trong metylen
(-CH2-) trong vòng no; ở H-16 có tín hiệu quarter ở δ = 4.33 (J = 7.8 Hz) cho
thấy có nguyên tử H của cacbon có liên kết C-O.
Ngoài ra, phổ 1
H - NMR còn cho thấy tín hiệu ở δ = 4.04 (1H, s) của H-
3 tương ứng với sự xuất hiện của nhóm OH ở vị trí C-3. Khi đối
chiếu các tín hiệu cộng hưởng proton của AA1 với sarsasapogenin ta thấy
tương thích.
43

3.2.1.3. Phân tích phổ 13
C-NMR
Hình 3.3: Phổ 13
C NMR của chất AA1
C- NMR của chất AA1 và sarsasapogenin
Ví trí
Số liệu đo 13
C NMR Số liệu đo 13
C NMR của
của AA1 (ppm) sarsasapogenin (ppm)[14]
1 29.95 30.00
2 27.81 27.88
3 67.08 67.14
4 33.53 33.63
5 36.52 36.59
6 26.56 26.61
7 26.54 26.59
8 35.27 35.34
9 40.31 40.37
10 35.27 35.34
44

Ví trí
Số liệu đo 13
C NMR của
của AA1 (ppm) sarsasapogenin (ppm)[14]
11 20.90 20.95
12 39.85 39.94
13 40.67 40.73
14 56.47 56.54
15 31.74 31.80
16 81.02 81.05
17 62.08 62.21
18 16.50 16.51
19 23.92 23.94
20 42.11 42.18
21 14.34 14.34
22 109.75 109.74
23 27.08 27.14
24 25.77 25.83
25 25.94 26.02
26 65.14 65.18
27 16.05 16.08
Phổ 13
C-NMR của AA1 cho thấy có 27 tín hiệu cộng hưởng tương ứng
với 27 nguyên tử cacbon. Bốn nhóm metyl có các tín hiệu cộng hưởng tương
ứng là 16.50 (CH3-18), 23.92 (CH3-19), 14.34 (CH3-21), 16.05 (CH3-27).
Ngoài ra còn có tín hiệu δ = 67.08 (C-3), 81.02 (C-16), 62.08 (C-17),
65.14 (C-26) cho thấy sự xuât hiện của nguyên tử cacbon có liên kết C-O. Ở C-
22 có tín hiệu δ =109.75 lớn hơn nhiều so với δ của C-3, C-26, C-17, C-16 và
tương ứng với nguyên tử C-1 trong phân tử đường có liên kết glycoside ở vị trí
C-1 nên có thể suy luận rằng C-22 liên kết với 2 nguyên tử O.
Các tín hiệu cộng hưởng của các nguyên tử C của AA1 so với
sarsasaponin là tương đồng nhau.
45

3.2.1.4. Phân tích phổ HMBC
Hình 3.4: Phổ HMBC của chất AA1
Hình 3.5: Một số tín hiệu quan trọng trên phổ HMBC của chất AA1
Phổ HMBC chỉ ra một số sự tương quan quan trọng giữa tín hiệu của
metyl H-21 và tín hiệu C-20 và C-17; proton H-19 với H-21 và C-17. Ngoài ra,
cấu hình 25S của hợp chất đang cần xác định cấu trúc được suy luận dựa trên
sự khác nhau trong sự thay đổi độ chuyển dịch hóa học của proton dạng
geminal của H-26 (δ = 3.23) (Hα-26) và (δ = 3.88) (Hβ-26) (Δαβ:0.65) trong khi
sự khác nhau thông thường của hợp chất 25S là >=0.57 còn 25R là <=0.48.
46

Kết luận: Căn cứ các giá trị phổ MS, 1
H và 13
C NMR và phổ tương quan
hai chiều HMBC của chất AA1 đồng thời so sánh với các giá trị phổ cộng
hưởng từ hạt nhân của Sarsasapogenin khi cùng được đo trong dung môi CDCl3
trong các tài liệu tham khảo ta có thể kết luận AA1 là Sarsasapogenin.[14]
21 26
27
CH3
H3C O
19 25
12 CH3 20 22 24
18 11 13 17 O 23
1 CH3 16
2 10 9 8 14 15
HO 3
4
5
6
7
Hình 3.6: Công thức cấu tạo của chất AA1 (Sarsasapogenin)
3.2.2. Chất AA2
H - NMR (CDCl3, ppm)
Hình 3.7: Phổ 1
H-NMR của chất AA2
47

H-NMR
của chất AA2 và Sarsasapogenone
Số liệu đo 1
H NMR của AA2
Số liệu đo 1
H NMR của
Ví trí sarsasapogenone (ppm), J
(ppm), J (Hz)
(Hz)[14]
2 2.32 (1H, m, H-2α) 2.31 (1H, m, H-2α),
4 2.69 (1H, dd, J= 14.5, 14.1, H-4α) 2.68 (1H, dd, J = 14.6, 14.0, H-4α)
16 4.42 (1H, q, J= 7.6) 4.42 (1H, q, J = 7.4)
18 1.04(3H, s) 1.04 (3H, s)
19 0.79(3H, s) 0.79 (3H, s)
21 1.08 (3H, d, J = 7.1 ) 1.08 (3H, d, J = 7.1, H-21)
26
3.95 (1H, dd, J = 11.1, 2.7 ). 3.95 (1H, dd, J = 11.0, 2.7, Hβ -26)
3.31 (1H, d, J = 11.1) 3.29 (1H, d, J =11.0, Hα -26)
27 1.00 (3H, d, J = 6.9) 1.00 (3H, d, J = 6.7)
Phổ 1
và 0.79 (3H) và 2 tín hiệu doublet ở δ = 1.08 ppm (J = 7.1 Hz) và 1,00 (J = 6.9
Ở H-26 có tín hiệu doublet ở δ = 3.31 (J = 11,1 Hz) của Hα và δ = 3,95 (J
= 11.2; 2.7 Hz) của Hβ là hai tín hiệu cộng hưởng của hai proton trong metylen
(-CH2-) trong vòng no; ở H-16 có tín hiệu quarter ở δ = 4.42 (J = 7.6 Hz) cho
thấy có nguyên tử H của cacbon có liên kết C-O.
Trên phổ 1
H - NMR không thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của H-3
(có δ khoảng 3,94 ppm , vân đơn (sarsasaponin)), đồng thời độ chuyển dịch hóa
học của H-2 và H-4 tăng so với trong sarsasaponin, nên có thể nhóm OH và H
không có ở vị trí C-3.
48

C-NMR
Hình 3.8: Phổ 13
C NMR của chất AA2
C- NMR của chất AA2 và sarsasapogenone
Ví trí
Số liệu đo 13
C NMR của AA2 Số liệu đo 13
C NMR của
(ppm) sarsasapogenone (ppm)[14]
1 37.01 37.03
2 37.18 37.19
3 213.09 213.11
4 42.35 42.37
5 44.24 44.26
6 26.55 26.58
7 26.04 26.07
8 35.20 35.24
9 40.85 40.91
10 35.03 35.06
49

Ví trí
Số liệu đo 13
C NMR của AA2 Số liệu đo 13
C NMR của
(ppm) sarsasapogenone (ppm)[14]
11 21.02 21.05
12 40.13 39.17
13 40.68 40.71
14 56.28 56.31
15 31.71 31.74
16 80.88 80.92
17 62.09 62.14
18 16.48 16.50
19 22.68 22.70
20 42.15 42.19
21 14.34 14.34
22 109.73 109.75
23 27.08 26.00
24 25.78 25.81
25 25.96 27.11
26 65.16 65.19
27 16.05 16.07
Phổ 13
C-NMR cho thấy δ ppm ở bảng 3.4 tương ứng với 4 nhóm metyl
là 16.48 (CH3-18), 22.68 (CH3-19), 14.34 (CH3-21), 16.05 (CH3-27).
Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng có δ = 80.88 (C-16), 62.09 (C-17),
65.16 (C-26), cho thấy sự xuất hiện của liên kết C-O. Ở C-22 có tín hiệu δ =
109.73, δ lớn hơn so với δ của C-26, C-17, C-16 nên chứng tỏ C-22 liên kết với
2 nguyên tử O.
Đặc biệt, trên phổ 13
C NMR có xuất hiện píc có δ = 213.09 tương ứng
với độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử C trong xeton, và không có tín hiệu
cộng hưởng của C-3 dạng liên kết đơn với oxi, do đó có thể nhóm C3-OH đã
chuyển thành C=O.
50

Kết luận: Căn cứ các giá trị phổ
1
H và 13
C NMR của chất AA2 và so
sánh với các giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sarsasapogenone khi cùng
được đo trong dung môi CDCl3 trong các tài liệu tham khảo ta có thể kết luận
AA2 là sarsasapogenone [14]
21 26
27
CH3
H3C O
19 25
12 CH3 20 22 24
18 11 13 17 O 23
1
CH
3 16
2 10 9 8 14 15
.O 3
5
6
7
4
Hình 3.9: Công thức cấu tạo của AA2 (sarsasapogenone)
3.2.3. Chất AA3
H và 13C- NMR (CDCl3, ppm)
Hình 3.10: Phổ 1
51

Hình 3.11: Phổ 13
C NMR của chất AA3
H và 13
C NMR của chất AA3
Ví trí
Số liệu đo 13
H NMR của AA3 (ppm),
của AA3 (ppm) J (Hz)
2 67.69 3.62 (d, J = 10.5)
3 69.88 3.94 (1H, s)
16 80.96 4.33 (1H, q, J = 7.8)
18 16.49 0.92 (3H, s)
19 23.76 0.77 (3H, s)
21 14.34 1.08 (3H, d, J = 7.1)
26 65.16 3.88 (1H, dd, J = 11.1, 2.7).
3.23 (1H, d, J = 11.1)
27 16.05 0.97 (3H, d, J = 6.9)
52

Phổ 1
và 0.77 (3H) và 2 tín hiệu doublet ở δ = 1.08 ppm (J = 7.1 Hz) và 0.97 (J = 6.9
Ở H-26 có tín hiệu doublet ở δ = 3.23 (J = 11.1 Hz) của Hα và δ = 3.88 (J
= 11.1; 2.7 Hz) của H β là hai tín hiệu cộng hưởng của hai proton trong metylen (-
CH2-) trong vòng no; ở C-16 có tín hiệu quarter ở δ = 4.33 (J = 7.8 Hz) cho thấy
có nguyên tử H của cacbon có liên kết C-O. Ở vị trí C-2 có tín hiệu cộng
hưởng của δH 3.62 (d, J = 10,5 Hz) tương ứng với proton liên kết với C liên kết
trực tiếp với oxi.
Phổ 13
C-NMR cho thấy δ ppm ở bảng 4 tương ứng với 4 nhóm metyl là
16.49 (CH3-18), 23.76 (CH3-19), 14.34 (CH3-21), 16.05 (CH3-27).
Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng có δC = 67.69 (C-2); 69.88 (C-3);
80.96 (C-16); 62.08 (C-17); 65.16 (C-26) cho thấy sự xuất hiện của liên kết C-
O. Ở C-22 có tín hiệu δ = 109.75, δ lớn hơn so với δ của C-26, C-17, C-16 nên
chứng tỏ C-22 liên kết với 2 nguyên tử O.
3.2.3.2. Phân tích phổ HMBC
Phổ HMBC chỉ ra một số sự tương quan quan trọng giữa tín hiệu của
metyl H-21 và tín hiệu C-20 và C-17; proton H-19 với H-21 và C-17.
53

Hình 3.12: Phổ HMBC của chất AA3
Hình 3.13: Một số tín hiệu quan trọng trên phổ HMBC của chất AA3
Kết luận: Đến nay mặc dù chưa có công trình bày nào trình bày các giá
trị độ chuyển dịch hóa học của chất tinh khiết AA3 nhưng căn cứ các giá trị
phổ 1
H và 13
C NMR và phổ tương quan hai chiều HMBC của chất AA3 và so
sánh với các giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất như
sarsasapogenin[14] và marcogenin[17] trong các hợp chất có liên kết glycoside
trong các tài liệu tham khảo ta có thể kết luận AA3 là marcogenin.
54

21 26
27
CH3
H3C O
19 25
12 CH3 20 22 24
18 11 13 17 O 23
HO 1
CH
3 16
9 14
2 10 8 15
.HO 3
5
6
7
4
Hình 3.14: Công thức cấu tạo của AA3 (marcogenin)
3.3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất phân
lập được
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm
và của dữ liệu. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6: Kết quả chế enzyme α-glucosidase
STT Tên mẫu Giá trị IC50 (g/ml)
1 AA1 >256
2 AA2 > 256
3 AA3 36,32
Chất tham khảo Acarbose 185,2
Kết quả trên cho thấy mẫu AA3 có hoạt tính rất tốt với giá trị IC50 là
36.32g/ml, mạnh hơn gấp 5 lần so với Acarbose. Hai mẫu còn lại không thể
hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu. Chất đối chứng là Acarbose hoạt động
ổn định trong thí nghiệm. Các số liệu có độ tương đồng cao với r2
>0.99.
Năm 2014, M.A. NAveed [29] và các cộng sự đã chỉ ra hợp chất (25S)-
5α-furastan-3β,22,26-triol (45) và gitogenin (46) được phân lập từ loài thực
55

vật Tribulus longipetalus có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase tốt với giá
trị IC50 tương ứng là 33.5 ± 0.22 và 37.2 ± 0.18 μmol/L, được so sánh với chất
đối chứng Acarbose (giá trị IC50 = 38.3 ± 0.12 μmol/L).
HO
CH3
H
H3C OH
CH3
CH3
H O OH
H
(45)
H3C
H
3
C
O
CH3
HO
CH
3
H
O
H
HO
H
H
H
(46)
Kết luận
Kết quả mẫu chất AA3 có hoạt tính ức chế α-glucosidase với giá trị IC50
là 36.32g/ml. So với các công trình nghiên cứu đã được công bố, kết quả của
mẫu AA3 tốt hơn nhiều. Với AA3 so với gitogenin ta nhận thấy cấu hình ở C-
25 không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính này. Từ đó bước đầu định hướng cho
việc sử dụng loài Anemarrhena asphodeloides Bunge trong y dược về khả năng
điều trị bệnh tiểu đường.
56

KẾT LUẬN
1- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về thành phần khung aglycon
của loài thực vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) ở Việt Nam.
2- Từ dịch thủy phân axit đã phân lập được 3 hợp chất tinh khiết bằng
các phương pháp sắc ký, kí hiệu là AA1, AA2 và AA3.
Cấu trúc hóa học của 03 hợp chất trên được xác định bằng các phương
pháp phổ như 1
H, 13
C NMR, HMBC và MS. Qua phân tích các phổ và so sánh
với tài liệu tham khảo, tên của ba chất được xác định là:
- Chất AA1: Sarsasapogenin
- Chất AA2: Sarsasapogenone
- Chất AA3: Marcogenin
Trong đó chất AA3 là chất lần đầu tiên được tách dưới dạng tinh khiết và
cung cấp đủ các số liệu phổ 1
H, 13
C-NMRvà phổ tương quan hai chiều HMBC.
3- Các chất phân lập được đánh giá hoạt tính ức chế α-glucosidase.
Kết quả trên cho thấy mẫu AA3 có hoạt tính rất tốt với giá trị IC50 là
36.32g/ml, mạnh hơn gấp 5 lần so với Acarbose (IC50 = 185.2 μg/ml) trong
cùng điều kiện thực nghiệm.
Kết quả nghiên cứu trên đã định hướng cho việc sử dụng loài Anemarrhena
asphodeloides Bunge trong y dược về khả năng điều trị bệnh tiểu đường.
KIẾN NGHỊ
Trên các kết quả nghiên cứu trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi nhận
thấy loài Anemarrhena asphodeloides Bunge rất có tiềm năng về hoạt tính sinh
học, nhất là trong việc điều trị bệnh tiểu đường rất tốt. Bởi vậy cần có các
nghiên cứu tiếp theo trong Y- dược về khả năng dùng Anemarrhena
asphodeloides Bunge làm vị thuốc thiên nhiên, hữu ích trong việc điều trị bệnh.
57

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, tập 2, NXB Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Thượng Dong (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nxb Khoa
học Kỹ thuật Hà Nội
3. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản
Y học.
Tài liệu tiếng Anh
4. Appian Subramoriam, (2016), “Plant with anti-diabetes mellitus
properties”, Taylor & Francis Group, U.S.A, 58-60.
5. Bao W. N., Pan H. P., Lu M., Ni Y., Zhang R., Gon X. G., (2007), “The
apoptotic effect of sarsasapogenin from Anemarrhena asphodeloides on
HepG2 human hepatoma cells.”, Cell Biology International, 31, 887-
892.[5]
6. Boll PM, & v. Philipsborn W (1965). “Studies and the absolute
configuration of Solanum alkaloids”. Acta. Chem. Scand. 19, 1365-1370.
7. Bomi L., Kangsik J., Dong H. K. (2009), “Timosaponin AIII, a saponin
isolated from Anemarrhena asphodeloides, ameliorates learning and
memory deficits in mice”, J Pharmacology Biochemistry and Behavior,
93,121-127.
8. Christophe wiart, PharmD, PhD (2012), “Edicinal plants of china, kore a,
andjapan”, Taylor & Francis Group, U.S, 133-135.
9. Dong JX, Han GY (1992), “Studies on the active constituents of
Anemarrhena asphodeloides Bunge”, Yao Xue Xue Bao, 27(1), 26-32.
10. Hoa, N.K., Phan, D.V., Thuan, N.D., Oestenson, C.G. (2004), “Insulin
secretion is stimulated by enthanol extrect of Anemarhena asphodeloides
in isolated islet of healthy wistar and diabetic goto-kakizaki rats”, Exp.
Clin. Endocrinol. Diabetes, 112, 520-525.
58

11. Hong Yongfu, Zang GM, Sun LN Han GY, JiGZ, (1999), “Isolation and
identifaction of steroidal saponins from Anemarrhena asphideloides Bge”,
Acta Phar , 518-521.
12. Hu H., Zhang R., Zhang Y., Xia Z., Hu Y., (2010), “Role of CREB in the
regulatory action of sarsasapogenin on muscarinic M1 receptor density
during cell aging”, FEBS Lett, 584, 1549-1552.
13. Hu Y., Xia Z. Q., Sun Q. X., Orsi A., Rees D., (2005), “A new approach
to the pharmacological regulation of memory: Sarsasapogenin improves
memory by elevating the low muscarinic acetylcholine receptor density in
brains of memory-deficit rat models”. Brain Research , 1060, 26-39.
14. Huang XF, Lin YY, Kong LY, (2008), “Steroids from the roots of
Asparagus officinalis and their cytotoxic activity.” J Integr Plant Biol,
50(6):717-22.
15. Ji-Yeon Kim , J.S , Jong Hoon Ryu , Sun Yeou Kim , Young-Wuk Cho
Jung-Hye Choi, Kyung-Tae Lee, (2009), “Anti-inflammatory effect of
anemarsaponin B isolated from the rhizomes of Anemarrhena
asphodeloides in LPS-induced RAW 264.7 macrophages is mediated by
negative regulation of the nuclear factor- j B and p38 pathways”, Food
and Chemical Toxicology 47, 1610-1617.
16. Kaname N, Zhang J, Meng Z, Xu S, Sugahara K, Doi Y, Kodama H
(2000). “Effect of timosaponin E1 and E2 on superoxide generation
induced by various stimuli in human neutrophils and on platelet
aggregation in human blood”. Clinica Chimica Acta, 295, 129-140.
17. Kang LP, Ma BP, Shi TJ, Zhang J, Xiong CQ(2006), "Two new
furostanol saponins from the rhizomes of Anemarrhena asphodeloides",
Yao Xue Xue Bao, 41(6), 527-532.
18. Lai-King Sy, Chun-Nam Lok, Juan-Yu Wang, Yungen Liu, Lu Cheng,
Pui-Ki Wan, Chi-Ting Leung, Bei Cao, Wai-Lun Kwong, Raymond
Chuen-Chung Chang và Chi-Ming Che, (2016), “Identification of
“sarsasapogenin-aglyconed” timosaponins as novel Ab-lowering
modulators of amyloid precursor protein processing”, Chemical Science. :
DOI: 10.1039/c5sc02377g.
59

19. Liu M, Tao L, Chau SL, Wu R, Zhang H, Yang Y, Yang D, Bian Z, Lu
A, Han Q, Xu H, (2014), "Folding fan mode counter-current
chromatography offers fast blind screening for drug discovery. Case
study: finding anti-enterovirus 71 agents from Anemarrhena
asphodeloides", Chromatography A, 14(1368), 116-24.
20. Liu QB, Peng Y, Li LZ, Gao PY, Sun Y, Yu LH & Son SJ, (2013),
“Steroidal saponins from Anemarrhena asphodeloides", Journal of Asian
Natural Products Research, 15(8), 891-898.
21. Liu Y, Chen W, Qiao C, Zhao N, (1999), “Determination of
sarsasapogenin in Anemarrhena asphodeloides Bunge by GC”, Zhongguo
Zhong Yao Za Zhi, 24(9):554-5, 575.
22. Ma B, Wang B, Dong J, Yan X, Zhang H, Tu A, (1997), "New spirostanol
glycosides from Anemarrhena asphodeloides", Planta med, 63(4), 376-379.
23. Meng Y, Xu X, Li W, (1999) “New saponin from Anemarrhena
asphideloides Bge”, Yao Xue Xue Bao, 9(4), 294-298.
24. Meng Z, Xu X, (1998), “Three New furistanol Saponin from
Anemarrhena asphodeliodes Bge”, J of Shenyang phar Uni,48, 130-131.
25. Meng Z, Zhou X, Xu X, (1998), “A new steroidal Saponin from
Anemasshenc asphode loides Bge”, J of shen Uni, p 254 - 256.
26. Meng Z, Xu S, Meng L, (1998), "Timosaponins E1 and E2", Yao Xue
Xue Bao, 33(9), 693-696.
27. Meng ZY, Zhang JY, Xu SX, Sugahara K (1999), " Steroidal saponins
from Anemarrhena asphodeloides and their effects on superoxide
generation", Planta Med, 65(7), 661-663.
28. Nakashima N., Kimura I., Kimura M., et al, (1993) “Isolation of
pseudoprototimosaponin A III from rhizomes of Anemarrhena
asphodeloides and its hypoglycemic activity in streptozotocin induced
diabetic mice”. J N at Prod, 56, 345-350.
29. Naveed MA, Riaz N, Saleem M, Jabeen B, Ashraf M, Ismail T, Jabbar A
(2014), “Longipetalosides A-C: New steroidal saponins from Tribulus
longipetalus”, Steroids , 83, pp. 45-51.
60

30. Ni Y., Gong X. Q., Lu M.; Chen H. M., Wang Y.,( 2008), “Mitochondrial
ROS burst as an early sign in sarsasapogenin-induced apoptosis in
HepG2 cells.”, Cell Biology International, 32, 337-343.
31. Nian H, Qin LP, Chen WS, Zhang QY, Zheng HC, Wang Y.. (2006),
“Protective effect of steroidal saponins from rhizome of Anemarrhena
asphodeloides on ovariectomy-induced bone loss in rats.” Acta
Pharmacologica Sinica, 27 (6): 728-734.
32. Oh J. K., Hyun S. Y., Oh H. R., Jung J. W., Park C., Lee S. Y., et al,
(2007), “Effects of Anemarrhena asphodeloideson focal ischemic brain
injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats”, Biol Pharm
Bull, 30, 38-43.
33. Ouyang, S., Sun, L. S., Guo, S. L., Liu, X., Xu, J. P., (2005), “Effects of
timosaponins on learning and memory abilities of ratswithdementia
inducedby lateral cerebral ventricular injection of amyloid beta-peptide”,
Acad J First Med Coll PLA, 25, 121-126.
34. Peng Y., Li L. Z., Li C. L., Li X., Liu Q. B., Song S. J., (2012),
“Isolation, derivatives synthesis and activities of sarsasapogenin from
rhizomes of Anemarrhena asphodeloides.” Shenyang Yaoke Daxue
Xuebao 29, 927-932.
35. Peng Y., Zhang Y. J., Ma Z. Q. et al,( 2007) “Two new saponins from A
nemarrhena as phodeloides Bge”, J Chin Chem Lett, 18, 171-174.
36. Qin L, Han T, Zhang Q, Cao D, Nian H, Rahman K, Zheng H(2008),
“Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a
traditional Chinese herbal formula”, Journal of Ethnopharmacology,
118(2), 271-279.
37. Ren LX, Luo YF, Li X, Zuo DY, Wu YL. (2006), “Antidepressant-Like
Effects of Sarsasapogenin from Anemarrhena asphodeloides Bunge
(Liliaceae)”, Biol. Pharm. Bull, 29(11), 2304-2306.
38. Setsuo S., Satoshi N., Koki I., (1994), “New steroidal saponins from the
rhizomes of Anemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)”. J Chem
Pharm Bull, 42, 2342-2345.
39. Shen S. Y., Zhang Y., Zhang R., Gong X. G., ( 2013), “Sarsasapogenin
induces apoptosis via the reactive oxygen species-mediated mitochondrial
61

pathway and ER stress pathway in HeLa cells.”, Biochemical and
Biophysical Research Communications, 441, 519-524.
40. Sy L. K., Yan S. C., Lok C. N., Man R. Y., Che C. M.,( 2008),
“Timosaponin A-III induces autophagy preceding mitochondria-mediated
apoptosis in HeLa cancer cells”, Cancer Res, 68, 10229-10237.
41. Takeda Y., Togashi H., Matsuo T., Shinzawa H., Takeda Y., Takahashi T.,
(2001), “Growth inhibition and apoptosis of gastric cancer cell lines by
Anemarrhena asphodeloides Bunge”, J Gastroenterol, 36, 79-90.
42. Toshio Kawasaki and Tatsuo Yamauchi, (1963), “Saponin of
Timosaponin Anemarrhenae Rhizoma structure of Timosaponin. A-III”.
43. Tsukamoto S, Wakana T, Koimaru K, Yoshida T, Sato M, Ohta T (2005),
“7-Hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl) chromanand Broussonin B:
Neurotrophic Compounds, Isolated from Anemarrhena asphodeloides
Bunge, Functionas Proteasome Inhibitors”, Biol. Pharm. Bull, 28(9),
1798-1800.
44. Trouillas P., Corbière C., Liagre B., Duroux J. L., Beneytout J. L., (2005),
“Structure-function relationship for saponin effects on cell cycle arrest
and apoptosis in the human 1547 osteosarcoma cells: a molecular
modelling approach of natural molecules structurally close to diosgenin”,
Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13, 1141-1149.
45. Wang J. N., Dong Y., Sui H. J., Zhang Y. X, (2011), “Effects of
sarsasapogenin on dendritic development in cultured cortical neurons and
the mechanisms of signal transduction”, Zhongguo Yaolixue Tongbao ,
27, 1565-1569.
46. Wang Q., Sui H. J., Qu W. H., Yu S. X., Jin Y. X., Liu Z., Jin Y., (2013),
“Protective effects of sarsasapogenin on cultured cortical neurons from
glutamate-induced neurotoxicity in rats”, Zhongguo Yaolixue Tongbao,
29, 281-285.
47. Yang M., Ji H., Dai S. J., Fu F. H., (2007), “Influences of sarsasapogenin
on endocrine and ntioxidative function of ovariectomized rats”, Zhong
cao yao, 38, 245-247.
48. Yingming P., Ying L., Hengshan W., Min L., (2004), “Antioxidant
activities of several Chinese medicine herbs”, Food Chem, 88, 347-350.
62

49. Youn U. J, Lee Y. S,Jeung H, Nam J. W, Lee Y. J, Son Y. M, Hwang E.
S, Seo E. K (2009), "Minor phenolic constituents of the Anemarrhena
asphodeloides", Natural Product Sciences, 15(4), 2003-2007.
50. Yuan JC, Zhang J, Wang FX, Pang X, Zhao Y, Xiong CQ, Ma BP,
(2014), "New steroidal glycosides from the rhizome of Anemarrhena
asphodeloides", Journal of Asian Natural Products Research,16(9),
901-909. (11)37.
51. Yue L. H., Sui H. J., Qu W. H., Yu S. X., Liu Z., Jin Y.,( 2012),
“Protective effects of sarsasapogenin on glutamic acid-induced
neurotoxicity in the cultured cortical neurons in rats and the
mechanisms”, Zhongyao Yaoli Yu Linchuang , 28, 31-36.
52. Zang Yu-jung, Song hao-Jang, Ma Zhi-giang, (2008), “A new furostan
Saponin from Anemarrhena asphodeloides Bge”, J of Shen Phar Uni
2008, p279-281.
63

PHỤ LỤC
Hình S1: Phổ giãn 1H-NMR của chất AA1

Hình S2: Phổ giãn 13
C-NMR của chất AA1

Hình S5: Phổ giãn HMBC của chất AA1

C-NMR chất AA2

Hình S14: Phổ giãn 1H-NMR của chất AA3

Hình S22: Thực nghiệm hoạt tính sinh học của chất phân lập được

Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Thực Vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides).doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Thực Vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides).doc

Similar to Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Thực Vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides).doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Thực Vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides).doc