Monoclonal production

1. SẢN XUẤT #
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG#
mAb#

2. Là kháng thể kháng một kháng
nguyên nào đó được tạo ra từ một
dòng tế bào lymphocyte B trong
điều kiện in vitro !
Định nghĩa#
Là kháng thể với một đặc hiệu
duy nhất cho một vị trí epitope
duy nhất của kháng nguyên
(Milstein)#

3. George Kohler và César Milstein #
Nobel Y-Sinh học 1984#
:

4. Kháng thể đa dòng# Kháng thể đơn dòng#
Tương tác KN-KT#
không chuyên biệt#
Giới hạn về số lượng#
Tương tác KN-KT
chuyên biệt #
Không giới hạn về số lượng #
Dễ sản xuất# Đòi hỏi kỹ thuật cao#

5. Kháng thể đơn dòng#
1#
2# 3#
4#
epitope#
Huyết thanh#
Kháng thể đa dòng#
Kháng thể đơn dòng#

6. 8 bước tạo mAb#
• Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag#
• Gây đáp ứng miễn dịch#
• Thu TB lách và TB myeloma#
• Dung hợp TB lách với TB myeloma#
• Sàng lọc, dòng hóa hybridoma#
• Nhân sinh khối mAb bằng phương pháp #
in vitro hay in vivo#
• Tinh chế mAb#
• Thu nhận, kiểm tra mAb#

7. (1a) Chọn động vật gây nhiễm#
• Động vật thường được sử dụng để tạo
hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley
rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ…#
• Mouse là mô hình lý tưởng nhất:#
đáp ứng miễn dịch mạnh#
tổng hợp kháng thể nhanh#
#
• 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản
xuất mAb: BALB/c và C57BL/6#

8. • Lai cùng dòng#
• Chuột cái#
• 6-8 tuần tuổi#
• “sạch tuyệt đối”#
BALB/c C57BL/6#
Lai tạo 1913 tại Mỹ#
#
Lai tạo1921 tại Mỹ#
#

9. Rat Hamster #

10. Hệ thống chuồng chuột sạch#

11. (1b) Chọn Ag#
• Quyết định sự thành công của quy trình#
• Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản
phẩm tạo thành #
• Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm
(mAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)#

12. • Được nhận diện bởi mAb mục tiêu#
#
• Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh#
#
• Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt#
Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật
protein tái tổ hợp.#
#
• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các
hapten phối hợp với protein, vaccine thương
phẩm hay là một phân tử protein nào đó#
#
#
#
Antigen#

13. Các vị trí tiêm Ag#
Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch)#
Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)#
Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da)#
Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ)#
Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)#

14. (2) Gây đáp ứng MD#
Phải gây ĐƯMD khác loài#
Nguyên tắc 1#
Sử dụng động vật gây nhiễm là
mousethì phải dùng kháng nguyên có
nguồn gốc từ rat hay hamster để gây
đáp ứng miễn dịch#

15. (2) Gây đáp ứng MD#
Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng
một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả
năng dung hợp của nó với tế bào lách#
Nguyên tắc 2#
- Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên
chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay
X63/Ag.8653#
- Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn
dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3#

16. (2) Gây đáp ứng MD#
Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm#
#
Nguyên tắc 3#
• CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương
dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum#
#
• IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương
dầu#
• ALUM (Aluminum hydroxide gel)#

17. Tiêm 10-100µg/1 chuột/1 lần#
Tá dược thường được sử dụng là CFA#
Với kháng nguyên là protein#
Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần #
Tá dược thường được sử dụng là ALUM #
Với kháng nguyên là tế bào#

18. Ngày# Thao tác# Tá dược# Vị trí tiêm #
0# Tiêm mũi cơ bản# CFA# s.c.#
14# Tiêm nhắc lại lần 1# IFA# s.c.#
28# Tiêm nhắc lại lần 2# IFA# s.c.#
36# Thu serum#
42# Nghỉ trước khi dung hợp #
(hay tiêm nhắc lần 3)#
IFA# s.c.#
52# Tiêm nhắc lại lần cuối# i.v.#
55# Thu tế bào lách sau khi đã xác
định hiệu giá của Ig trong huyết
thanh#
Quy trình gây ĐƯMD ở mouse#

19. Ngày# THAO TÁC# Chất bổ trợ# Vị trí tiêm#
0# Tiêm mũi cơ bản# CFA# i.p.#
21# Tiêm nhắc lần 1 # IFA# i.p.#
42# Tiêm nhắc lần 2 # IFA# i.p.#
52# Kiểm tra serum#
53# ELISA#
63# Tiêm nhắc lần 3# IFA# i.p.#
73# Kiểm tra serum#
74# ELISA#
84# Tiêm nhắc lần 4# IFA# i.p.#
94# Kiểm tra serum#
95# ELISA#
98# Tiêm nhắc lần cuối# i.v.#
101-110# Thu lách#
Quy trình gây ĐƯMD ở rat#

20. Xác định hiệu giá kháng thể #
Pha loãng huyết thanh
theo từng bậc#
(1)#
Bổ sung một lượng nhất
định KN vào mỗi tube#
(2)#
Ủ - xác định độ pha
loãng cao nhất vẫn cho
phản ứng (trong trường
hợp này là 1/16)#
(3)#
Undiluted
serum 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative
control
Undiluted
serum 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative
control
Huyết thanh
ban đầu#
Chứng âm#
#
Huyết thanh
ban đầu# Chứng âm#
#

22. Chọn lọc hybridoma#
Tổng hợp nucleotide#
Con đường de novo (bị ức chế bởi môi trường HAT)#
Con đường dự trữ (sử dụng enzyme HGPRT)#
B cell#
de novo#
Salvage (HGPRT+)#
Hybridoma#
de novo#
Salvage (HGPRT+)#
Myeloma#
de novo#
Salvage #
(HGPRT-)#
Chết# Chết#
Sống#
Môi trường chọn lọc HAT#

24. Môi trường chọn lọc HAT #
Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con
đường:#
– Con đường De novo cần hoạt động của enzyme
dihydrofolate reductase (DHFR) #
– Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine
guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine #
– Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR à tế
bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage #
– Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine
(hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage#

25. Dung hợp tế bào lách với myeloma#
Chuột đã được gây MD#
Lympho B#
Chuột#
Dầu khoáng#
Plasmacytoma (Bào tương ung thư)#
Myeloma#
Hybridoma#
Dung hợp#
Không sản xuất Ig#
Có bộ máy tiết Ig#
“Bất tử” trong in vitro #
Sản xuất Ig#
Không tồn tại lâu dài trong in vitro#
Sản xuất Ig#
Có bộ máy tiết Ig#
“Bất tử” trong in vitro #
#

27. Immortal Tumor Of Lymphocytes# +
8 - Azaguanine#
Myeloma Cells#
#
HGPRT-#
Myeloma Cells#
#
Kiểm tra myeloma#

28. (4) Các kĩ thuật dung hợp tế bào#
• Kết dính tự nhiên#
• Hóa chất (PEG)#
• Các yếu tố vật lý (xung điện,
sóng siêu âm)#
• Virus (Sendai)#
• Vi tiêm #

29. Máy tạo xung điện
Buồng dung hợp
Tế bào trong buồng dung hợp

30. (5a) Sàng lọc hybridoma#
Dung hợp#
Lympho B#
Myeloma#
Hybridoma#
Sàng lọc #
Ag#
Dòng hóa#
Hybridoma sản xuất Ig
mục tiêu#

31. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA

33. Western Blotting

35. Immunoflorescent essay #

36. (5b) Dòng hóa Hybridoma#

37. (6) Nhân sinh khối MAb#

38. • Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển
nhân tạo (bioreactor, bình Roux…)#
• MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào
(supenatant cell culture)#
• Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp
(0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy)#
• Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ
thống bioreactor#
(6a) Sản xuất MAb in vitro#

39. Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào#

40. • Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ
(ascites)#
• MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid)#
#
• Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao (1-15mg/
mL nước báng) #
#
• Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí
nghiệm#
(6b) Sản xuất MAb in vivo#

41. Mồi chuột bằng pristane#
Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity)#
Thu thập nước báng (ascites fluid)#

42. Pristane#
• 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane#
• Tách chiết từ dầu gan cá mập#
• Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu
bệnh viêm khớp mãn tính ở người#
• Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu
bệnh tự miễn#
• Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong
khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb#

43. (7) Tinh chế protein#
• Sắc ký ái lực (affinity chromatography)#
• Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)#
• Lọc gel (gel filtration)#
• Sắc ký cao áp #
#
• Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic#

44. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC#
(High pressure liquid chromatography)#

45. Sắc ký ái lực#

46. Mab trong liệu pháp chữa trị ung thư#
Tế bào khối u#
Ag ung thư#
Mab kháng Ag
ung thư #
NK cells, Mf#
ADCC#
MAC#
Bổ thể#

47. Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano
(quantum dot) #

48. Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano
(quantum dot) ứng dụng trong in vitro #
KTĐD gắn quantum
dot phát huỳnh
quang trong nhận
diện thụ thể bề mặt
tế bào ung thư đại
tràng#

49. Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano
(quantum dot) ứng dụng trong in vivo #

51. Mouse MAb Chimeric MAb Humanized MAb #
Mouse Mab: toàn bộ phân tử kháng thể có nguồn gốc từ chuột#
Chimeric MAb: vùng Fab từ chuột, vùng Fc từ người#
Humanized MAb: 3 vùng hypervariable từ chuột, các vùng còn lại từ người #

52. Humanization of therapeutic antibodies has reduced their immunogenicity.
Ian N. Foltz et al. Circulation. 2013;127:2222-2230
Copyright © American Heart Association, Inc. All rights reserved.