Monoclonal antibody production

1. KĨ THUẬT SẢN XUẤT KHÁNG
THỂ ĐƠN DÒNG
Ths. Lê Thị Hạnh
Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG.TP.HCM
Viện Tế Bào Gốc
11/2018
hanhle@sci.edu.vn

2. Nội dung
u Giới thiệu
u Các bước tạo kháng thể đơn dòng
u Ứng dụng
hanhle@sci.edu.vn

3. Kháng nguyên-kháng thể
u Kháng nguyên (antigen – Ag): một chất phản ứng với các sản
phẩm của một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
Bản chất là protein (glycoprotein/lipoprotein),
polysaccharid/lipopolysaccharid, acid nucleic hoặc lipid
Kháng nguyên không phụ thuộc T (polysaccharid) và Kháng nguyên
phụ thuộc T (protein)
u Kháng thể (antibody - Ab): là một protein được hệ miễn dịch sử
dụng để nhận diện và trung hoà những tác nhân xâm nhiễm ngoại
lại
Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu
của nó
Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody – mab): là kháng thể
được xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng
tế bào duy nhất
Kháng thể đa dòng bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác nhau
hanhle@sci.edu.vn

4. Đáp ứng miễn dịch dịch thể
hanhle@sci.edu.vn

5. Kháng thể đơn dòng
(monoclonal antibody)
u Là kháng thể kháng
môt kháng nguyên
nào đó được tạo ra
từ một dòng tế bào
B trong điều kiện
in vitro
u Là kháng thể chỉ
nhận diện 1 vị trí
epitope duy nhất
trên kháng nguyên
Fab
Dom
ain
Fc Domain
hanhle@sci.edu.vn

6. Kháng thể đơn dòng – đa dòng
Kháng thể đa dòng -
Polyclonal antibodies
Kháng thể đơn dòng -
Monoclonal antibodies
ØDễ sản xuất
ØTương tác kháng nguyên –
kháng thể không chuyên
biệt
ØGiới hạn số lượng (động
vất)
ØTiết kiệm thời gian
ØĐòi hỏi kĩ thuật cao
ØTương tác kháng
nguyên – kháng thể
chuyên biệt
ØKhông giới hạn số lượng
(sx trên tế bào)
ØCần nhiều thời gian
hanhle@sci.edu.vn

7. Nobel y học 1984
Niels K. Jerne, George Kohler, César Milstein Hybridoma technology
for production of monoclonal antibodies
Georges J.F. Köhler, César Milstein (1975)
Niels K. Jerne and his theories
Theory 1: Specificity is predetermined
Theory 2: Reactivity against self-antigens
creates diversity
Theory 3. Antibodies, anti-anti-bodies
hanhle@sci.edu.vn

8. Kháng thể đa dòng và kháng thể
đơn dòng
hanhle@sci.edu.vn

9. Các bước tạo kháng thể đơn dòng
1. Chọn động vật gây nghiễm, chọn kháng
nguyên
2. Gây đáp ứng miễn dịch
3. Thu nhận tế bào miễn dịch và dung hợp với
tế bào myelom, tạo tế bào lai hybridoma
4. Sàng lọc, dòng hóa hybridoma
5. Thu nhận, tinh chế và kiểm tra kháng thể đơn
dòng
hanhle@sci.edu.vn

10. Kháng nguyên (antigen)
u Được nhận diện bởi một kháng thể mục tiêu
u Có tính gây đáp ứng miễn dịch mạnh
u Có cấu trúc càng giống với kháng nguyên tự
nhiên càng tốt (Hiện nay kháng nguyên
thường được tạo ra bằng kĩ thuật protein tái
tổ hợp)
u Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh,
các hapten phối hợp với protein, vaccine
thương phẩm hay một phân tử protein nào
đó
hanhle@sci.edu.vn

11. Chọn kháng nguyên
u Quyết định sự thành công của quy trình
u Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản
phẩm tạo thành
u Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm
(Mab gắn đặc hiệu với KN tiêm vào)
hanhle@sci.edu.vn

12. Chọn động vật gây nhiễm
u Chuột nhắt là mô hình lý tưởng do:
• Đáp ứng miễn dịch mạnh
• Thời gian ngắn tạo ra kháng thể
u 2 dòng chuột trong công nghệ sản xuất
kháng thể đơn dòng (Mab) là BALB/c và
C57BL/6
• Lai cùng dòng
• 6-8 tuần tuổi
• Chuột cái
• “sạch tuyệt đối” BALB/c C57BL/6
u Động vật thường được sử dụng để gây đáp
ứng miễn dịch là chuột nhắt (Mouse), chuột
lớn (Rat, Hamster), thỏ…
hanhle@sci.edu.vn

13. Các vị
trí
tiêm
Ag
Intramuscular (i.m.) tiêm vào cơ
Intraperineal (i.p.) tiêm khoang bụng
Subcutaneous (s.c.) tiêm dưới da
Intradermal (i.d.) tiêm vào da
Intravenous (i.v.) tiêm tĩnh mạch
hanhle@sci.edu.vn

14. hanhle@sci.edu.vn

15. Gây đáp ứng miễn dịch
u Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài (VD: động vật
gây nhiễm là mouse thì kháng nguyên có nguồn gốc
từ rat/hamster)
u Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một
loài với đối tượng gây đáp ứng miễn dịch (VD: tế bào
lách từ mouse thì dòng myeloma là SP2/0 hoặc
X63/Ag.8654, nếu là rat thì chọn dòng Y3.Ag1.2.3
u Có chất bổ trợ (tá dược - adjuvant)
• CFA (Complete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ
tương dầu, xác vi khuẩn Mycobacteium
• IFA (incomplete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ
tương dầu
• ALUM (aluminum hydroxide gel)
hanhle@sci.edu.vn

16. Liều lượng sử dụng
Kháng nguyên là protein Kháng nguyên là tế bào
Ø Tiêm 10-100 µg/chuột/lần
Ø Tá dược thường được dùng là
CFA
Tiêm 5x10^6 - 5x10^7 tế bào
/chuột/lần
Tá dược thường được dùng là
ALUM
hanhle@sci.edu.vn

17. Quy trình gây đáp ứng miễn
dịch ở chuột nhắt
Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm
0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c
14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c
28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c
36 Thu serum
42 Nghỉ hoặc Tiêm nhắc lại lần 3 IFA s.c
52 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v
55 Thu tế bào lách sau khi xác định
hiệu giá Ig trong huyết thanh
hanhle@sci.edu.vn

18. Quy trình gây đáp ứng miễn dịch ở
rat
Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm
0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p
21 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA i.p
42 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA i.p
52 Thu serum kiểm tra
63 Tiêm nhắc lại lần 3 IFA i.p
73 Thu serum kiểm tra
84 Tiêm nhắc lại lần 4 IFA i.p
94 Thu serum kiểm tra
98 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v
101-
110
Thu tế bào lách
hanhle@sci.edu.vn

19. Xác định hiệu giá kháng thể
hanhle@sci.edu.vn

20. Dung hợp tạo tế bào lai
hanhle@sci.edu.vn

21. Tế bào lai - hybridoma
u Được Kohler và Milsten (1975) khám phá khi nuôi
cấy liên tục những tế bào tiết kháng thể
u Hybrid là lai tạo giữa tế bào lympho B và tế bào
ung thư dòng tủy của cùng 1 loài – oma là khối u
u Môi trường chọn lọc HAT – hypoxanthine,
aminopterin, thymidine
u HGPRT – hypoxanthine guanine phosphoribosyl
transferase
hanhle@sci.edu.vn

22. hanhle@sci.edu.vn

23. hanhle@sci.edu.vn

24. Quá trình sinh tổng hợp nucleotid
Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường:
u Con đường De novo cần hoạt động của enzyme
dihydrofolate reductase (DHFR)
u Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase
(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để
tổng hợp purine
u Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR à
tế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage
u Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine
(hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage
hanhle@sci.edu.vn

25. Chuẩn bị tế bào myeloma
hanhle@sci.edu.vn

26. hanhle@sci.edu.vn

27. Chọn lọc hybridoma
hanhle@sci.edu.vn

28. Các dòng myeloma thường
được sử dụng
hanhle@sci.edu.vn

29. Các phương pháp tạo tế bào lai
u Kết dính tự nhiên
u Hóa chất (PEG)
u Các yếu tố vật lý (xung điện, sóng siêu âm)
u Virus (Sendai)
u Vi tiêm
hanhle@sci.edu.vn

30. Dung hợp tế bào bằng xung điện
Máy tạo xung điện Buồng dung hợp
hanhle@sci.edu.vn

31. Tiến trình dung hợp tế bào bằng
xung điện
hanhle@sci.edu.vn

32. hanhle@sci.edu.vn

33. Sàng lọc hybridoma
hanhle@sci.edu.vn

34. Dòng hóa hybridoma
hanhle@sci.edu.vn

35. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA
hanhle@sci.edu.vn

36. Western Blotting
hanhle@sci.edu.vn

37. Immunoflorescent assay
hanhle@sci.edu.vn

38. Nhân sinh khối Mab
hanhle@sci.edu.vn

39. Sản xuất Mab in vitro
u Hybridoma được nuôi trong môi trường phát
triển nhân tạo (bioreactor, bình Roux…)
u MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi
cấy tế bào (supenatant cell culture)
u Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương
đối thấp (0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy)
u Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn
bằng hệ thống bioreactor
hanhle@sci.edu.vn

40. Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào
hanhle@sci.edu.vn

41. Sản xuất Mab in vivo
u Hybridoma được tiêm vào khoang bụng
của vật chủ (ascites)
u MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites
fluid)
u Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao
(1-15mg/mL nước báng)
u Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật
thí nghiệm
hanhle@sci.edu.vn

42. Mồi chuột bằng pristane
Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity)
Thu thập nước báng (ascites fluid)
hanhle@sci.edu.vn

43. Pristane
u 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane
u Tách chiết từ dầu gan cá mập
u Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình
nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ở
người
u Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình
nghiên cứu bệnh tự miễn
u Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước
báng trong khoang bụng của chuột, kích
thích sự tạo MAb
hanhle@sci.edu.vn

44. Tinh chế protein
u Sắc ký ái lực (affinity chromatography)
u Sắc ký trao đổi ion (ion exchange
chromatography)
u Lọc gel (gel filtration)
u Sắc ký cao áp
u Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid
caprylic
hanhle@sci.edu.vn

45. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC
(High pressure liquid chromatography)
hanhle@sci.edu.vn

46. Tinh sạch kháng thể
hanhle@sci.edu.vn

47. Ứng dụng kháng thể đơn dòng
hanhle@sci.edu.vn

48. hanhle@sci.edu.vn

49. Human-mouse chimeric monoclonal antibodies
Phage display cycle
hanhle@sci.edu.vn

50. hanhle@sci.edu.vn

51. hanhle@sci.edu.vn