Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở thái nguyên.docx

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
NGUYỄN THỊ HÀ LY
MÃ SINH VIÊN: 1101318
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
TRÀ HOA VÀNG Ở THÁI NGUYÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
NGUYỄN THỊ HÀ LY
MÃ SINH VIÊN: 1101318
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
TRÀ HOA VÀNG Ở THÁI NGUYÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. DS. Ngô Thị Thảo
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật –
Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Hoàng
Quỳnh Hoa- Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội và DS. Ngô Thị
Thảo- người thầy đã truyền cho tôi tình yêu khoa học, dìu dắt tôi từ những ngày
đầu làm nghiên cứu khoa học, cũng là người trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ
bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
- PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản lý khoa học, Trường Đại
học Dược Hà Nội, DS. Phạm Thị Linh Giang và DS. Nguyễn Thị Thùy
Linh, người đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn
mà tôi gặp phải trong quá trình thực hiện khóa luận.
- Các thầy cô giáo và các chị kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực
nghiệm.
- Ban Giám Hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên
trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong
suốt 5 năm học tại đây.
- Các bạn sinh viên khóa 66 cùng nghiên cứu và làm đề tài ở bộ môn Thực vật
đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thị Hà Ly

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANG MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN.........................................................................................2
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L....................................2
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L. ...........................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Camellia L.......................................................2
1.1.3. Phân bố .......................................................................................................2
1.1.4. Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam........................................................3
1.2. Thành phần hóa học.......................................................................................4
1.2.1. Nhóm alcaloid trong Camellia L................................................................4
1.2.2. Nhóm tanin (các polyphenol) trong Camellia L. .......................................4
1.2.3. Nhóm tinh dầu trong Camellia L. ..............................................................5
1.3. Về tác dụng sinh học .....................................................................................6
1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa.............................................................................6
1.3.2. Tác dụng chống ung thư.............................................................................6
1.4. Một số phương pháp định lượng polyphenol ................................................7
1.5. Vài nét về phương pháp bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng bằng phần
mềm VideoScan.......................................................................................................8
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................9
2.1. Nguyên liệu, thiết bị ......................................................................................9
2.1.1. Nguyên liệu.............................................................................................9
2.1.2. Thiết bị....................................................................................................9
2.1.3. Dung môi, hóa chất.................................................................................9
2.2. Nội dung, phương pháp nghiên cứu ............................................................10
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái.............................................................10

MỤC LỤC
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ...........................................................11
2.2.3. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học...................................................19
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................23
3.1. Kết quả nghiên cứu......................................................................................23
3.1.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật..................................................23
3.1.2. Kết quả nghiên cứu hóa học..................................................................27
3.1.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học in vitro .....................................35
3.2. BÀN LUẬN.................................................................................................36
3.2.1. Về thực vật............................................................................................36
3.2.2. Về thành phần hóa học..........................................................................37
3.2.3. Về tác dụng sinh học.............................................................................39
KẾT LUẬN.............................................................................................................40
ĐỀ XUẤT ...............................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
AOAC Association of Official Analytical Chemists - Hiệp hội các nhà
hoá phân tích chính thống
DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl
DĐVN Dược điển Việt Nam
EGCG Epigalo catechin gallat
ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Phương pháp hấp thụ
miễn dịch liên kết với enzyme
GC Gas Chromatography - Sắc ký khí
HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng hiệu
năng cao
HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao
IC50 Inhibit Cellular Proliferation by 50% - Nồng độ ức chế 50% sự
phát triển của tế bào
IUCN International Union for Conservation of Nature and Natural
Resources - Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài
nguyên Thiên nhiên
OD Optical Density - Mật độ quang
Rf Retention factor - Hệ số lưu giữ
RSB Sulforhodamine B
RSD Relative Standard Deviation - Độ lệch chuẩn tương đối
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TLC Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp mỏng
VQG Vườn Quốc gia

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam.....................................3
Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chi Camellia sp.......................10
Bảng 2.2. Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic.............................................16
Bảng 3.1. Kết quả định tính ....................................................................................27
Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ...........................................28
Bảng 3.3. Độ hấp thụ của dãy chuẩn.......................................................................29
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu nghiên cứu.......30
Bảng 3.5. Kết quả xây dựng đường chuẩn EGCG..................................................32
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên ......33
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp...........................................34
Bảng 3.8. Kết quả bán định lượng EGCG ..............................................................34
Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử .................................35
Bảng 3.10. Kết quả ức chế tế bào ung thư in vitro của lá Trà hoa vàng Thái
Nguyên....................................................................................................................36
Bảng 3.11. Một số đặc điểm tương đồng về hình thái của Camellia euphlebia và
Trà hoa vàng Thái Nguyên......................................................................................37

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số loại catechin ...................................................5
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần..................17
Hình 3.1. Hình thái mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên..............................................23
Hình 3.2. Vi phẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên....................................................25
Hình 3.3. Vi phẫu thân Trà hoa vàng Thái Nguyên...............................................26
Hình 3.4. Sắc ký đồ của chuẩn EGCG và mẫu thử hiện màu bằng thuốc thử vanilin
- H2SO4 ở ánh sáng thường.....................................................................................28
Hình 3.5. Hình ảnh quét phổ của dung dịch chuẩn acid gallic nồng độ 50 µg/ml .29
Hình 3.6. Đường chuẩn acid gallic .........................................................................30
Hình 3.7. Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng .....................31
Hình 3.8. Sắc ký đồ dãy chuẩn EGCG....................................................................32
Hình 3.9. Đường chuẩn EGCG...............................................................................32
Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên .33
Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của phương pháp ......................................33
Hình 3.12. Đồ thị sự phụ thuộc Tỷ lệ gốc tự do bị trung hòa theo nồng độ mẫu thử35

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chi Trà (Camellia L.) là một chi lớn trong họ Chè (Theaceae), rất nổi tiếng
với cây Trà xanh (C. Sinensis (L.) O. Ktze) đã được sử dụng trong cuộc sống từ rất
lâu đời vai trò làm thức uống và thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc với các tác
dụng sinh học tốt [37]. Bên cạnh đó, trong chi Camellia L. còn có rất nhiều loài
khác cũng có hoạt tính sinh học rất đáng quan tâm như tác dụng chống oxy hóa, tác
dụng chống ung thư, tác dụng kháng nấm, kháng virus, v.v. [47]. Trà hoa vàng là
một nhóm trong số các loài thuộc chi Camellia L. với màu vàng đặc trưng của hoa.
Đây là nguồn gen vô cùng quý hiếm của chi Camellia L. chỉ gặp ở miền Bắc Việt
Nam và Nam Trung Quốc [11].
Ở Việt Nam, Trà hoa vàng lần đầu tiên được người Pháp phát hiện ở miền
Bắc vào năm 1910 [11]. Tuy nhiên, cho đến những năm gần đây, Trà hoa vàng mới
được quan tâm nghiên cứu và khai thác để sử dụng. Mặc dù vậy, các nghiên cứu về
thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài Trà hoa vàng còn rất hạn chế.
Cho đến nay, các nghiên cứu về Trà hoa vàng mới chỉ tập trung chủ yếu vào phần
thực vật với việc tìm ra các loài Trà hoa vàng mới ở Việt Nam. Ước tính có khoảng
30 loài Trà hoa vàng đã được công bố có ở Việt Nam, tập trung chủ yếu ở miền Bắc
(VQG. Tam Đảo) hoặc một số khu vực miền Nam (VQG. Cát Tiên, VQG. Bù Gia
Mập) [31], [32], [34]. Tuy nhiên, vẫn còn một số khu vực cũng phát hiện có Trà hoa
vàng nhưng chưa được nghiên cứu như ở Ba Chẽ (Quảng Ninh) hoặc Yên Ninh
(Thái Nguyên), v.v.
Từ thực tế đó, đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học
và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở Thái Nguyên” được thực hiện nhằm đạt
được các mục tiêu sau:
- Mô tả đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của cây Trà hoa vàng Thái
Nguyên.
- Xác định thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu, định lượng thành phần
hóa học chính trong lá của mẫu nghiên cứu.
- Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và tác dụng độc tế bào ung thư in vitro
của lá mẫu nghiên cứu.

2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L.
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L.
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [22], chi Trà hoa
vàng (Camellia L.) có vị trí phân loại như sau:
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta).
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida).
Phân lớp: Sổ (Dilleniidae).
Bộ: Trà (Theales).
Họ: Trà (Theaceae).
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Camellia L.
Theo các tài liệu Từ điển thực vật thông dụng của Võ Văn Chi [7], sách Trà hoa
vàng của Trần Ninh [11] chi Camellia L. có đặc điểm:
Cây bụi hoặc cây nhỏ, thường xanh, cành nhẵn hay có lông. Lá thường có
cuống, đơn, mọc so le, không có lá kèm; chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài
thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép có răng cưa
nhọn hoặc tù. Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc ở nách lá
hoặc đầu cành. Hoa màu đỏ, trắng hoặc vàng. Cuống hoa ngắn hoặc gần như không.
Lá bắc 2 - 10, mọc xoắn trên cuống hoa. Cánh hoa 4 - 19, hợp một phần ở gốc cùng
với vòng nhị ngoài. Nhị nhiều, dính với nhau ở phía gốc, vòng nhị phía trong rời
nhau, chỉ nhị dài. Bầu trên, 1 - 5 ô, vòi nhụy 1 - 5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau; bầu
và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn. Quả nang, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi
khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; có trụ hay không; vỏ quả dày hay
mỏng, hóa gỗ. Hạt 1 đến nhiều hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm, vỏ
hạt màu nâu, nâu hạt dẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn.
1.1.3. Phân bố
Trên thế giới, chi Camellia L. có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở nhiệt đới
và á nhiệt đới, có nguồn gốc ở khu vực miền đông và miền nam châu Á, từ dãy
Himalaya về phía đông tới Nhật Bản và Indonesia. Cho tới nay, có rất nơi trên thế
giới có các loài thuộc chi này. Đó là các nước ở châu Á (Ấn độ, Bangladesh, Đài

3
Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-lanka,
Trung Quốc, Việt Nam); châu Âu (Thổ Nhĩ Kỳ, Liên Xô cũ); châu Phi (Burundi,
Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda); khu vực Nam Mỹ (Argentina, Brazil,
Ecuador, Peru) và châu Đại Dương (Australia, New-Ghine) [11], [39].
Ở Việt Nam, chi Camellia L. có khoảng 77 loài, phân bố từ Bắc vào Nam (Yên
Bái, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Bình Phước, v.v) [32], [33],
[34].
1.1.4. Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam
Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam [13], [14], [16], [17], [29],
[31], [32], [33], [34], [41], [43], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57] được
trình bày trong Bảng 1.1. Đặc điểm hình thái của các loài này được trình bày trong
Bảng 1và Bảng 2, Phụ lục 2.
Bảng 1.1. Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam
STT Tên loài Tên thường gọi
1 Camellia bugiamapensis Orel, Curry, Luu & Q.D Trà bù gia mập
2 Camellia capitata Orel Trà đầu
3 Camellia cattienensis Orel Trà cát tiên
4 Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda Trà vàng lá dày
5
Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann
Trà mi Cúc
Phương
6 Camellia Chrysantha (Hu) Tuyama Trà hoa vàng
7 Camellia chrysanthoides Hung T. Chang
8 Camellia dalatensis V.D.Luong, Ninh & Hakoda Trà mi đà lạt
9 Camellia dilinhensis Tran & Luong Trà mi di linh
10
Camellia dongnaiensis Orel
Trà hoa vàng
đồng nai
11 Camellia dormoyana (Pierre) Sealy Trà vàng đo môi
12 Camellia euphlebia Merr. ex Sealy Trà gân
13 Camellia flava (Pitard) Sealy
14 Camellia fleuryi (A. Chev.) Sealy Chè sốp
15 Camellia gilberti (A.Chev.) Sealy Trà vàng Ginbéc
16 Camellia hakodae Ninh, Tr Trà vàng Hakoda
17
Camellia hirsuta Hakoda et Ninh
Trà vàng nhiều
lông

4
18 Camellia inusitata Orel, Curry & Luu Trà mi cành dẹt
19
Camellia luteocerata Orel
Trà hoa vàng
trắng
20 Camellia luteopallida Luong, T.Q.T. Nguyen & Luu
21 Camellia ninhii Luong & Le
22 Camellia oconoriana Orel, Curry & Luu Trà âu-con- nơ
23 Camellia petelotii (Merr.) Sealy Trà vàng Pêtêlô
24 Camellia phanii Hakoda et Ninh Trà vàng phan
25 Camellia sonthaiensis Luu, Luong, Q.D. Nguyen &
T.Q.T. Nguyen
Trà sơn thái
26 Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh Trà vàng tam đảo
27 Camellia tienii Ninh, Tr Hải đường vàng
28 Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen-Stuart
1.2. Thành phần hóa học
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi
Camellia L. Các thành phần hoá học chính có hoạt tính sinh học cao thường gặp
trong Camellia L. là nhóm alcaloid (cafein, theobromin, theophylin, adenin,
guanin); các polyphenol và tinh dầu (metyl salicylat, citronellol, v.v). Ngoài ra,
trong lá của các loài Camellia L. còn có các nhóm flavonoid (kaempferol,
quercetin), saponin triterpenoid (camelliasid A, B), acid hữu cơ (acid oxalic, acid
nicotinamic, acid ascorbic,v.v), protein, acid amin, pectin và đường khử. Bên cạnh
lá, trong hạt của Camelilia L. còn có các acid béo palmitic, stearic, oleic, linoleic,
myristic và arachidic [17]. Trong các nhóm chất này, ba nhóm chất đầu luôn được
coi là các thành phần quan trọng nhất quyết định tính chất của trà.
1.2.1. Nhóm alcaloid trong Camellia L.
Đối với Trà xanh (C. sinensis (L.) O. Ktze), thành phần quan trọng nhất
trong lá Trà xanh là alcaloid nhân purin, chẳng hạn như cafein, nó quyết định chất
lượng của trà và không biến đổi trong quá trình chế biến. Ngoài ra, trong Trà xanh
còn có theophylin, theobromin, xanthin [17], [39].
1.2.2. Nhóm tanin (các polyphenol) trong Camellia L.
Nhóm tanin (các polyphenol) được coi là quan trọng thứ hai trong trà. Tanin
có ở chi Camellia L. thuộc loại tanin ngưng tụ (pyrocathechic), được tạo thành do
sự ngưng tụ từ các đơn vị flavan - 3 - ol như catechin. Lượng chất polyphenol toàn
phần có thể được định lượng bằng phương pháp HPLC [23].

5
Đối với lá Trà xanh (C. sinensis (L.) O. Ktze), tanin chiếm 15-30%, sau khi
chế biến thì nó trở thành vị chát. Đây là nhóm bị biến đổi khi chế biến trà. Các
polyphenol trong lá là loại polyphenol trung bình, gồm một lượng nhỏ acid gallic,
chiếm 48% [38]. Từ Trà xanh Nhật bản, đã phân lập được các chất polyphenol là
epicatechin (EC), galocatechin (GC), epicatechin gallat(ECG), epigallocatechin
gallat (EGCG) (Hình 1.1.). Đây là những chất được quan tâm nhiều nhất do có
nhiều tác dụng sinh – dược học đáng chú ý như: giúp ổn định huyết áp, giảm nguy
cơ đột quỵ và bệnh tim mạch, bảo vệ da khỏi tác dụng của tia UV. Trong các thành
phần này, EGCG là thành phần polyphenol chủ yếu, làm giảm các nguy cơ bệnh tim
mạch và ung thư, chiếm khoảng 48 - 55% polyphenol toàn phần trong lá Trà xanh
[11], [17], [38].
Đây cũng là định hướng chính của đề tài này khi nghiên cứu thành phần hóa
học với việc định tính, định lượng polyphenol và EGCG có trong mẫu nghiên cứu.
1.2.3. Nhóm tinh dầu trong Camellia L.
Tinh dầu cất được từ lá tươi của Trà xanh vào mùa xuân là 0,014% và mùa
hè là 0,007%. Thành phần chủ yếu trong tinh dầu Trà xanh là hexenal, hexenol và
các aldehyd. Ngoài ra, còn có một lượng nhỏ các chất butyraldehyd,
isobutyraldehyd và isovaleraldehyd, cùng với n-hexyl, benzyl, phenylethylalcon,
geraniol, linalool, acetophenon và citral [17].
Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số loại catechin

6
1.3. Về tác dụng sinh học
1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa
Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng chống oxy hóa của trà là do hoạt tính
của các hợp chất polyphenol [23], [36], [37], [38], [45], [49]. Lá của loài Camellia
chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện qua khả năng
trung hòa gốc tự do [38]. Các chất được xác định trong lá của loài Camellia
chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng trung hòa gốc tự do là: epicatechin, vitexin,
isovitexin, quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside và kaempferol [36]. Tác dụng chống
oxy hóa của polyphenol thu được từ lá Trà xanh đã được đánh giá theo khả năng
bảo quản dầu hạt cải và khi so sánh với các chất có tính chống oxy hóa đã biết như
acid ascorbic và tocopherol [34]. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng, polyphenol chiết
xuất từ lá Trà xanh thứ phẩm có tác dụng chống oxy hóa rất rõ rệt và mạnh hơn
nhiều so với acid ascorbic và tocopherol [38].
Nghiên cứu của Lixia Song và cộng sự đánh giá khả năng chống oxy hóa của
polyphenol trong 6 mẫu Trà hoa vàng thu hái ở Trung Quốc: C. impressinervis, C.
euphlebia, C. microcarpa, C. nitidissima, C. tunghinensis và C. chrysantha theo mô
hình DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl), được
phân tích bằng phương pháp HPLC cho thấy có phản ứng rõ rệt giữa các thành phần
catechin trong trà với DPPH thể hiện rõ khi mà các đỉnh tương ứng tồn tại trong sắc
ký đồ ban đầu của các chiết xuất ban đầu biến mất sau khi thêm DPPH [49].
1.3.2. Tác dụng chống ung thư
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Trà xanh với thành phần chủ yếu là các
polyphenol và đặc biệt là EGCG có khả năng ức chế sự phát triển của một số dòng
tế bào ung thư ở người. Một số công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kìm
hãm của polyphenol trong trà lên sự hình thành, phát triển và di căn của khối u. Tác
dụng này chủ yếu là do hiệu quả chống oxy hóa cao và chống tăng sinh khối u của
các hợp chất polyphenol trong trà [9], [20], [40], [41], [43]. Các cơ chế chính giải
thích tác dụng ức chế sự phát triển tế bào u của EGCG được đề cập là: (1) tác dụng
ngăn cản chu kỳ phân chia tế bào, dừng chu kỳ phân chia tế bào ở các pha G1, G2;
(2) thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình [26]. Viện Lý Hóa – Viện Hàn
lâm khoa học Liên Xô (cũ) đã đã sử dụng những hợp chất flavonoid hoặc

7
polyphenol có độc tính thấp như những chất chống oxy hóa để nghiên cứu lâm sàng
điều trị một số dạng ung thư và cho rằng cơ chế chống khối u của flavonoid không
chỉ do khả năng chống oxy hóa mà còn tác dụng tổng hợp do khả năng phản ứng đa
dạng của phân tử flavonoid. Dịch chiết polyphenol trong trà xanh có tác dụng ức
chế sự phát triển tế bào của dòng tế bào ung thư phổi LU -1 và dòng tế bào ung thư
gan Hep – G2, tác dụng rõ nhất trên dòng LU – 1 với giá trị IC50 là 3, 84 µM của
EGCG Trà xanh. Bước đầu phát hiện sự tăng hoạt độ của enzym caspase – 3 trên
dòng tế bào LU -1 được bổ sung EGCG Trà xanh vào môi trường nuôi cấy [47].
Như vậy, các loài trong chi Trà Camellia L. với những nghiên cứu hiện có đã thể
hiện tác dụng nổi bật là chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.
Vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa
và tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư in vitro của mẫu Trà hoa vàng Thái
Nguyên.
1.4. Một số phương pháp định lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol toàn phần có thể xác định bằng nhiều kỹ thuật khác
nhau: quang phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng
kết hợp với khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [26].
Năm 2010, một nhóm nghiên cứu và phát triển công nghệ hóa sinh đã tiến
hành định lượng polyphenol tổng số của 16 mẫu trà (8 mẫu tươi và 8 mẫu khô) bằng
phương pháp đo quang, sử dụng thuốc thử Folin - Denis.
Năm 2013, Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam đã đưa ra tiêu chuẩn quốc gia
TCVN 9745 - 1:2013 (ISO 14502 - 1:2005) quy định phương pháp xác định hàm
lượng polyphenol toàn phần trong Trà xanh và Trà đen bằng phương pháp đo màu
sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu [4].
Với Trà hoa vàng, do chưa có phương pháp nào được công bố chính thức để
định lượng polyphenol toàn phần nên trong phạm vi nghiên cứu, chúng tôi áp dụng
phương pháp định lượng theo TCVN 9745 - 1:2013.
Nguyên tắc: Polyphenol có trong mẫu trà được chiết bằng methanol 70% ở
60o
C. Định lượng polyphenol tổng trong trà bằng phương pháp đo quang, dùng
thuốc thử Folin- Ciocalteu. Thuốc thử này chứa acid phospho-vonframic, phản ứng
xảy ra theo cơ chế oxy hóa- khử. Nhóm hydroxyl trong pholyphenol dễ bị oxy hóa,

8
sản phẩm của phản ứng có màu xanh lam của vonfram và molypden, có độ hấp thụ
cực đại ở bước sóng 765 nm. Xây dựng đường chuẩn dựa trên acid gallic [4], [30],
[45].
Cơ chế phản ứng
Na2WO4 / Na2MO4 (màu vàng) => (Phenol - MoW11O40)-4
(màu xanh)
Mo+6
+ e-1
=> Mo+5
(màu xanh)
Mo+5
+ e-1
=> Mo+4
(màu xanh)
ØOH => ØȮ + H+1
+e-1
ØO-1
=> ØȮ + e-1
Phản ứng xảy ra nhanh ở pH kiềm và xảy ra chậm hơn ở pH acid [45].
1.5. Vài nét về phương pháp bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng bằng
phần mềm VideoScan
Khái niệm bán định lượng: Bán định lượng là xác định một các gần đúng hàm
lượng của một chất, kết quả bán định lượng rơi vào khoảng giữa của một kết quả
định lượng và một kết quả định tính [21].
Khi bán định lượng các chất bằng TLC, độ chính xác của kết quả phụ thuộc
nhiều vào kỹ thuật xác định và lượng giá vết trên sắc ký đồ. Nếu sử dụng kỹ thuật
xử lý ảnh sắc ký với camera kỹ thuật số thì độ chính xác của kết quả phần lớn phụ
thuộc vào phần mềm xử lý dữ liệu hình ảnh.
Phần mềm xử lý ảnh VideoScan là một phần mềm có hạn chế về độ chính xác
khi đọc kết quả dữ liệu ảnh. Vì vậy, khi sử dụng phần mềm này để xử lý ảnh sắc ký
đồ thì chỉ có thể xác định được sơ bộ hàm lượng các chất trong mẫu phân tích (bán
định lượng).

9
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu Trà hoa vàng thu hái tại Yên Ninh (Thái Nguyên) ngày 31/12/2015
được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật – Trường Đại học
Dược Hà Nội.
Mã số tiêu bản: HNIP/18162/16.
- Mẫu để nghiên cứu đặc điểm hình thái và làm tiêu bản mẫu khô: mẫu tươi mang
cành, lá, hoa
- Mẫu để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học: mẫu lá tươi, làm sạch,
sấy khô, nghiền nhỏ
2.1.2. Thiết bị
Thiết bị nghiên cứu đặc điểm thực vật:
- Kính lúp soi nổi Leica EZ4
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D + Canon 100mm f2.8 Macro
Thiết bị nghiên cứu thành phần hóa học:
 Máy cô quay Buchi.
 Máy đo quang Hitachu U-1900
 Bản mỏng silicagel GF 254 Merck
 Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc ký
Linomat 5, buồng triển khai ADC2, mấy nhúng thuốc thử CAMAG, buồng phát
hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan.
 Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác
các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn.
Thiết bị nghiên cứu tác dụng sinh học:
- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
2.1.3. Dung môi, hóa chất
- Chất chuẩn Epigallo catechin gallat (EGCG) 96,54%, Viện Kiểm Nghiệm thuốc
Trung ương.
- Chất chuẩn acid gallic 97%, Trung tâm kiểm nghiệm Thành phố Hà Nội
- Dung môi: methanol, aceton, chloroform, acid formic, nước cất.

10
- Thuốc thử: vanilin - dung dịch acid sulfuric.
- FBS của GIBCO, Invitrogen,; TCA(Sigma, Mỹ), SRB (Sigma, Mỹ), DPPH
(Sigma, Mỹ)
- Acid ascorbic (Sigma, Mỹ), Ellipticine (Sigma, Mỹ),
- Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v.
Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược
Điển Việt Nam IV.
Các dòng tế bào ung thư: do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và
GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp: ung thư phổi, ung thư
vú, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư da.
2.2. Nội dung, phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
2.2.1.1. Phân tích hình thái
Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương
pháp mô tả phân tích [2], [6]. Trong nghiên cứu các đặc điểm được mô tả thuộc các
nhóm: Dạng sống, thân, lá, hoa (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chi Camellia sp.
Stt Cơ quan Các đặc điểm mô tả
1. Dạng sống Dạng sống, chiều cao
2. Thân Hình dạng thân già, bề mặt cành non
3. Lá
Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng mép, số
cặp gân chính, kích thước, bề mặt trên, bề mặt dưới
4. Hoa
Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, lá bắc, đài (hình dạng, bề mặt),
tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (số lượng, hình dạng, kích
thước, liền/rời), bộ nhụy (hình dạng kích thước lá noãn, vòi
nhụy).

11
2.2.1.2. Giám định tên khoa học
Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các
tài liệu về thực vật trong nước và các tài liệu ngoài nước. Các mẫu sau khi tra khóa
được so sánh đối chiếu với các tiêu bản tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
2.2.2.1. Định tính các nhóm chất trong ống nghiệm
a. Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hỏa
Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet. Chiết bằng 50 ml
ether dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu. Dịch chiết đem cất thu
hồi bớt dung môi. Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính
chất béo, tinh dầu và sterol.
Định tính chất béo:
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy.
Định tính sterol (phản ứng Liebermann – Burchardt):
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa. Bốc hơi dung môi đến
cắn. Thêm 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 450
. Cho từ từ theo
thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp
xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp
trên màu xanh lá.
b. Định tính các thành phần có trong dịch chiết cồn
Cân khoảng 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 50 ml cồn 900
,
đun sôi cách thủy vài phút. Dịch chiết được lọc và cô còn khoảng 10 ml để làm các
phản ứng định tính flavonoid, coumarin, acid amin.
Định tính coumarin
- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch
chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun
sôi cách thủy cả 2 ống nghiệm trong vài phút. Để nguội rồi quan sát thấy ống 1 có
màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2 trong. Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống

12
2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát, thấy ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục. Acid
hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thì ống 1 trở lại đục như ống 2.
- Phản ứng diazo hóa: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào đó 2
ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử
diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch.
Định tính flavonoid
- Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda): Cho 1ml dịch chiết cồn vào ống
nghiệm, thêm một ít bột magnesi kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt).
Để yên một vài phút, dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ.
- Phản ứng với kiềm:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy
xuất hiện tủa vàng. Thêm 1 ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng
lên.
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô rồi để trên miệng lọ amoniac đặc thấy
màu vàng của dịch chiết tăng lên. Nhỏ 1 giọt khác làm chứng.
- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt
dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa xanh đen.
Định tính acid amin
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài tinh thể ninhydrin thấy xuất
hiện màu xanh tím
c. Định tính các thành phần trong dịch chiết nước
Lấy 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 nước cất, đun
sôi cách thủy trong vài phút, để nguội, lọc lấy dịch chiết để định tính nhóm đường
khử, acid hữu cơ và tanin.
Định tính đường khử
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A
và 0,5 ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ
gạch.
Định tính acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm vài tinh thể natri carbonat
thấy xuất hiện bọt khí

13
sau:
Định tính tanin
Lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết nước để làm các phản ứng
- Ống 1: thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa màu hoặc tủa
màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.
- Ống 2: thêm 2 giọt chì acetat 10%, thấy xuất hiện tủa bông
- Ống 3: thêm 5 giọt gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa bông trắng.
Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành định tính tanin catechic trong mẫu nghiên cứu
bằng phản ứng đặc trưng: Lấy 0,2 g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol, đun cách
thủy đến sôi, để nguội, lọc. Lấy 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung
dịch vanilin 1% và 1 ml dung dịch HCl đậm đặc thấy xuất hiện màu đỏ đậm.
Định tính saponin (phản ứng tạo bọt): cho vào ống nghiệm 0,1 g bột dược liệu,
thêm 5 ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút, để yên. Nếu còn bọt bền vững sau 15
phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
d. Định tính các nhóm chất khác
Định tính alcaloid
Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch
H2SO4 1N, đun đến sôi trong vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm
hóa bằng dung dịch amoniac 6N đến pH = 9 – 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị
màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng ether hoặc cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml.
Dịch chiết ether hoặc cloroform được gộp lại, lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi
lần 5 ml. Gộp các dịch chiết nước, cho vào 3 ống nghiệm, mối ống 1ml, nhỏ vào
từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
- Ống 1: thuốc thử Mayer, cho tủa màu trắng đến vàng.
- Ống 2: thuốc thử Bouchardat, cho tủa nâu đến đỏ nâu.
- Ống 3: thuốc thử Dragendorff, cho tủa cam đến đỏ.
Định tính anthranoid: (phản ứng Borntraeger):
Cho vào ống nghiệm 0,5 g bột dược liệu, thêm 5 ml dung dịch H2SO4 1N, đun
sôi trực tiếp trên nguồn nhiệt, lọc dịch chiết còn nóng vào bình gạn, để nguội rồi lắc
với 5 ml ether hoặc cloroform. Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung
dịch NaOH 10%, lắc nhẹ thấy lớp nước có màu đỏ sim.

14
Định tính glycosid tim
Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 25%
rồi ngâm 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, loại tạp bằng dung
dịch chì acetat 30% đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ
dịch lọc vào bình gạn, lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml. Gộp dịch chiết
cloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natrisulfat khan. Dịch chiết được chia vào
các ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn để làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Liebermann – Burchardt: cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1
ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 450
. Cho từ từ theo thành ống
0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai
lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh
lá.
- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 900
, lắc
đều cho cắn tan hết. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha đến khi thấy xuất hiện
màu đỏ cam. Làm song song với một ống chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ
cam đậm hơn ống chứng.
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 900
, lắc
đều cho cắn tan hết. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung
dịch NaOH 10%, lắc đều thấy xuất hiện màu đỏ cam. Làm song song với một ống
chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
2.2.2.2. Định tính EGCG bằng sắc ký lớp mỏng
Nguyên liệu: mẫu lá Trà hoa vàng sấy khô ở 45o
C, xay nhỏ.
Chiết xuất: Cân 0,5 g mẫu, làm ẩm bằng methanol, chiết với 10 ml methanol
bằng phương pháp chiết siêu âm trong 30 phút. Lọc lấy dịch chiết, cất thu hồi dung
môi dưới áp suất giảm đến còn 1 ml thì dùng để chấm sắc ký.
Chuẩn bị mẫu chuẩn EGCG trong methanol nồng độ 1 mg/ml.
Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
- Bản mỏng: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110o
C trong
30 phút. Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm.
- Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được tiêm lên bản mỏng bằng máy Linomat 5.
Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng 8 mm, cách mép dung môi 3,0 mm.

15
Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng 15,0 mm. Độ dài băng
chấm 8,0 mm.
- Thể tích tiêm mẫu 3 µl.
- Điều kiện chạy TLC:
+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ 26o
C; độ ẩm tương đối 65%.
+ Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml.
+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.
+ Thời gian bão hòa bản mỏng: 3 phút.
+ Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 75,0 mm.
Khảo sát sắc ký với một số hệ dung môi sau:
 Hệ 1: Chloroform – methanol – aicd formic (6:3:1)
 Hệ 2: Chloroform – aceton – acid formic (5:5:1)
 Hệ 3: n- Butanol – aceton – acid acetic (5:5:3)
Lựa chọn hệ dung môi và điều kiện phát hiện tốt nhất để đánh giá kết quả và
sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Đánh giá: Mẫu thử được coi là có EGCG khi trên sắc ký đồ của mẫu thử, tại
vị trí Rf của EGCG chuẩn có vết với màu sắc giống như mẫu chuẩn.
2.2.2.3. Định lượng Polyphenol toàn phần
Nguyên tắc: Dựa trên phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong
Trà xanh theo TCVN 9745 - 1:2013 (ISO 14502 - 1: 2005), tiến hành định lượng
polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu bằng phương pháp đo quang với chất
chuẩn là acid gallic. Do mẫu nghiên cứu là Trà hoa vàng, không giống với đối
tượng Trà xanh trong TCVN 9745 - 1: 2013 và một số tài liệu cho thấy rằng sản
phẩm của phản ứng với polyphenol có độ hấp thụ cực đại khác với TCVN 9745 - 1:
2013 [4], [30], [45], nên khi tiến hành định lượng cần xác định bước sóng hấp thụ
cực đại của sản phẩm và độ lặp lại của phương pháp để cho kết quả chính xác.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung môi và thuốc thử
- Dung môi chiết (Methanol / nước): cho 700 ml methanol vào bình định
mức 1 vạch 1l, pha loãng bằng nước đến vạch.

16
- Thuốc thử: pha loãng dung dịch thuốc thử Folin- Ciocalteu 10 lần ngay
trước khi tiến hành phản ứng.
- Dung dịch Na2CO3 7,5%: Cân 37,5 ± 0,01 gam natri carbonat (Na2CO3)
cho vào bình định mức 1 vạch 500 ml. Thêm nước ấm đến nửa bình, lắc để hòa tan,
để nguội đến nhiệt độ phòng và pha loãng bằng nước cho đủ thể tích.
- Dung dịch chuẩn gốc acid gallic nồng độ chính xác khoảng 1000 µg/ml: Cân
chính xác khoảng 0,110 ± 0,001 gam acid gallic chuẩn 97% cho vào bình định mức
một vạch 100 ml. Hòa tan bằng nước và pha loãng đến đủ thể tích.
- Dung dịch chuẩn gallic: dùng pipet chính xác chuyển các thể tích dung dịch
chuẩn gốc gallic vào bình định mức 1 vạch 100 ml và pha loãng bằng nước theo
Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic
Dung dịch chuẩn
acid gallic
Thể tích dung dịch
chuẩn gốc (ml)
Nồng độ lý thuyết của dung dịch
chuẩn pha loãng (µg/ml)
C10 1,0 10
C20 2,0 20
C30 3,0 30
C40 4,0 40
C50 5,0 50
C60 6,0 60
Chuẩn bị mẫu thử:
Tiến hành lặp lại 6 lần với mẫu nghiên cứu.
- Lấy một lượng nhỏ mẫu để xác định hàm ẩm bằng cân hàm ẩm.
- Chiết polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu: Cân chính xác khoảng
0,3000 g bột dược liệu cho vào ống chiết 10 ml, thêm 5 ml dung môi chiết, đun
cách thủy ở 600
C trong 10 phút, trộn đều trên máy votex trong 5 phút, ly tâm với tốc
độ 3500 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch chiết lần 1. Bổ sung thêm 5 ml dung
môi, lặp lại thao tác trên, thu dịch chiết lần 2. Gộp dịch chiết 2 lần. Pha loãng dịch
chiết 100 lần để làm mẫu thử.
Tiến hành phản ứng theo sơ đồ Hình 2.1

17
T =
S x m x 10 000 x w
Dãy chuẩn Mẫu thử Mẫu trắng
1 ml dung dịch chuẩn
acid gallic ở các nồng
độ
1 ml dung dịch thử 1 ml nước
Thêm 5 ml thuốc thử đã pha loãng
Lắc, để yên 5 phút
Thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7.5%
Lắc đều
Để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng
Quét phổ chuẩn và đo mật độ quang ở bước sóng cực đại
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần
Xử lý kết quả
Quét phổ của mẫu chuẩn acid gallic ở nồng độ 50 µg/ml.
Dựng đường chuẩn tuyến tính acid gallic, tính hệ số tương quan r2
.
Xác định độ dốc đường chuẩn và giá trị giao điểm với trục tung của đồ thị.
Hàm lượng polyphenol toàn phần wT được tính bằng công thức sau:
(Dmẫu - Dgiao điểm) x Vmẫu x d x 100
w
chuẩn mẫu DM,mẫu
Trong đó:
Dmẫu là mật độ quang của mẫu thử
Dgiao điểm là mật độ quang tại điểm đường chuẩn giao với trục tung
Schuẩn là độ dốc của đường chuẩn
mmẫu là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam
Vmẫu là thể tích dịch chiết mẫu trước khi pha loãng, tính bằng mililit (ml)
d là hệ số pha loãng mẫu trước khi phản ứng
wDM, mẫu là hàm lượng chất khô của mẫu (%).

18
2.2.2.4. Xây dựng phương pháp bán định lượng EGCG trong lá Trà hoa vàng
bằng sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: Do EGCG là một thành phần chính trong Trà hoa vàng nên việc
bán định lượng EGCG đã được thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng. Để xây dựng
phương pháp này, sau khi lựa chọn được pha động và điều kiện phát hiện sắc ký đồ
theo mục 2.2.2.2, đề tài đã thực hiện khảo sát độ đặc hiệu, xây dựng đường chuẩn,
độ đúng và độ lặp lại của phương pháp.
Tiến hành: Tiến hành sắc ký theo điều kiện tốt nhất đã khảo sát ở mục 2.2.2.2.
Ảnh chụp sắc ký đồ được chuyển sang xử lý bằng phần mềm VideoScan.
Phần mềm này sẽ dựa trên hình ảnh sắc ký đồ vừa chụp được để ghi lại thành các
pic và tính toán diện tích pic hoặc chiều cao tương ứng.
Xử lý kết quả: Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tương đối RSD, phương trình hồi
quy tuyến tính được xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2013.
Đánh giá phương pháp
Phương pháp phân tích được đánh giá qua các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, đường
chuẩn và khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng.
a. Độ đặc hiệu
Tiến hành: Sử dụng mẫu trắng là methanol. Tiến hành tiêm 3 mẫu: mẫu trắng,
mẫu chuẩn và mẫu nghiên cứu trên cùng 1 bản mỏng, tiến hành sắc ký theo điều
kiện đã xây dựng, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD
của Rf [18], [21].
Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf. Phương pháp được coi
là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của
mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính
trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các
vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn [21].
b. Đường chuẩn
Tiến hành: Tiến hành tiêm 5 vết dung dịch chuẩn có thể tích lần lượt là 1 µl, 2
µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl. Khai triển sắc ký theo điều kiện đã xây dựng được theo mục
2.2.2.2.

19
Đánh giá kết quả: Xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương
quan giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn, xác định hệ số tương quan r2
.
Theo AOAC: Nếu r2
≥ 0,99 thì đường chuẩn có độ tuyến tính cao trong khoảng
nồng độ khảo sát [21].
c. Độ lặp lại:
Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần mẫu thử với thể tích 3 µl, triển khai sắc ký theo
theo điều kiện đã xây dựng theo mục 2.2.2.2.
Đánh giá kết quả: Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD của kết quả giữa các lần
phân tích.
Giới hạn độ lặp lại đối với một phương pháp theo AOAC là RSD ≤ 2% ở nồng
độ chất phân tích ≥ 1% và RSD ≤ 3% ở nồng độ chất phân tích ≥ 0,1% [21].
d. Độ đúng:
Độ đúng được đánh giá qua độ thu hồi, sử dụng phương pháp thêm chuẩn.
Tiến hành: Thêm 2 µl chuẩn (C) vào 6 dung dịch thử (C) với tỷ lệ 1:1 về thể tích
được các dung dịch thử (T + C) . Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã khảo sát.
Đánh giá kết quả: Tính độ thu hồi theo công thức:
H% = (CT+C- CT) x 100/Cc
Trong đó: H% là độ thu hồi
CT+C : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (T + C)
CT : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (T)
Cc là nồng độ chuẩn (C) thêm
Theo AOAC, giới hạn hệ số thu hồi đối với 1 phương pháp định lượng là từ
92 - 105% ở nồng độ chất phân tích ≥ 1%, từ 90 - 108% ở nồng độ chất phân tích ≥
0,1% [21].
2.2.3. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học
Chuẩn bị mẫu thử: Cân 10 g bột lá trà, cho vào bình nón, thấm ẩm bằng
methanol, ngâm với 50 ml methanol trong bình kín 3 ngày ở nhiệt độ phòng, chiết
lặp lại 2 lần. Gộp dịch chiết 2 lần, lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến
cắn để thử tác dụng chống oxy hóa và tác dụng độc đế bào ung thư.

20
2.2.3.1. Thử tác dụng chống oxy hóa bằng phép thử DPPH
Thử tác dụng chống oxy hóa được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn Lâm Khoa học Việt Nam.
Nguyên tắc: Phân tử DPPH là phân tử mang gốc tự do ổn định thông qua sự chuyển
dịch vị trí của một nguyên tử tự do trên toàn bộ phân tử của nó. Khi hòa tan trong
cồn tuyệt đối sẽ tạo ra dung dịch màu tím thẫm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng
517 nm. Gốc tự do DPPH có thể nhận một điện tử hoặc một gốc hydro để trở thành
một phân tử nghịch từ và có màu tím nhạt [37].
Khi một cơ chất được đưa vào dung dịch chứa DPPH và tạo ra màu tím nhạt thì
hoạt chất đó có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH và có hoạt tính chống oxy hóa.
Nếu khả năng trung hòa gốc tự do của mẫu thử càng mạnh thì màu tím càng nhạt,
và ngược lại. Đo độ hấp thụ của mẫu thử ở bước sóng cực đại 517 nm và so với
mẫu đối chứng, không chứa chất thử [37].
Tiến hành
- Tiến hành pha các nồng độ mẫu thử 200- 100- 50- 10 µg/ml với nước khử
khoáng.
- Pha acid ascorbic với nước khử khoáng, sử dụng làm đối chứng dương với
các nồng độ thử 100- 50- 10- 2 µg/ml.
- Dùng DPPH pha trong methanol (100%) nồng độ 100 µM
- Chuyển 100 l mẫu nghiên cứu vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng. Mỗi nồng
độ được làm lặp lại 3 lần.
- Tiếp tục đưa 100 l dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các giếng đã có
sẵn mẫu nghiên cứu.
- Ủ đĩa ở 37o
C trong 30 phút trên máy lắc. Xác định độ hấp phụ của dung dịch
sau phản ứng tại bước sóng 517 nm trên máy đọc ELISA 96 giếng.
- Giếng có dung môi hòa mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH là giếng trắng.
- Giếng có sử dụng aicd ascorbic là chất đối chứng dương.
- Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do (SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử
được tính theo công thức sau:
% SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%)

21
Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử
ODmẫu thử : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử
Tiêu chí đánh giá: Giá trị SC50 (nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của
DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve. Giá trị SC50
càng nhỏ thì khả năng chống oxy hóa càng cao.
Phương pháp xử lý số liệu:
- Đánh giá phương pháp phân tích và các kết quả phân tích: sử dụng phương
pháp thống kê, với công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Office Excel 2013 và
phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.
2.2.3.2. Phép thử sinh học xác định tính gây độc tế bào in vitro
Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro được tiến hành tại Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam.
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ
công nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm phát hiện các chất có khả năng
kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử được
thực hiện theo phương pháp của Monks (1991), tiến hành xác định hàm lượng
protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang (OD) đo được khi thành phần protein
của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD tỉ lệ thuận với
lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein
càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [48].
Tiến hành
- Mẫu thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96
giếng để có nồng độ nồng độ 100 g/ml, 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để
điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi
trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 2 ngày.

22
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 l)
sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố
định tế bào bằng acid trichloracetic (TCA).
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng
bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 o
C. Đổ bỏ SRB
và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô trong không khí
ở nhiệt độ phòng.
- Sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và
nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng
máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất
nhuộm SRB qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi
có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% tế bào sống sót =
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100
OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)
% ức chế tế bào = 100% ─ % tế bào sống sót
Trong đó: OD (đối chứng âm) : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử
OD (chất thử) : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine
(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các
nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.
- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm.
Tiêu chí đánh giá: Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào), được
xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa
học) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây
độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.

23
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái của Trà hoa vàng Thái Nguyên
Chú thích: 1. Cành mang hoa 2. Đỉnh lá 3. Gốc lá
4. Mép lá 5. Mặt trên lá 6. Mặt dưới lá
7. Cấu tạo hoa 8. Hoa 9. Lá bắc
10. Cánh hoa 11. Bộ nhị 12. Bộ nhụy
13. Mặt cắt ngang bầu nhụy
Hình 3.1. Hình thái mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên
Cây gỗ nhỏ, lâu năm, cành nhẵn không có lông. Cành non màu nâu nhạt,
cành già màu nâu sẫm. Lá có cuống dài 0,8 -1,2cm, nhẵn, lõm ở mặt trong. Phiến lá
hình elip đến bầu dục, nhẵn, dài 8,1 – 18,7cm, rộng 4,2 - 9,8cm, lá non dai và mỏng,
lá già cứng và dày, màu xanh đậm ở mặt trên, xanh sáng hơi vàng ở mặt dưới, mặt

24
dưới lá có nhiều điểm tuyến màu nâu nhạt, mật độ điểm tuyến 52 - 64/cm2
. Gốc lá
non hình nêm, lá già hơi tròn. Đỉnh lá nhọn, dài 0,7 – 1,0cm. Mép lá có răng cưa
kiểu cùn, tương đối đều, khoảng cách lớn nhất giữa 2 răng là 4mm. Gân chính nổi
rõ, lõm ở mặt trên, lồi ở mặt dưới, gân bên rõ. có 9 - 13 cặp, không có lông. Hoa
đều, lưỡng tính, mọc đơn độc hay thành cụm 2 - 3 hoa ở đầu cành hoặc nách lá.
Đường kính hoa khi nở 4 - 4,5cm. Cuống hoa nhẵn, dài 0,9cm. Lá bắc hình móng,
màu vàng hơi xanh, có lông rất mịn ở mặt trong, mặt ngoài nhẵn. Lá đài 6, có lông
mịn màu trắng ở mép, màu vàng, hình gần tròn đến trứng ngược. Cánh hoa 6, màu
vàng, nhẵn, dài khoảng 3, cm, rộng khoảng 1,5cm. Cánh hoa vòng trong dính với
chỉ nhị vòng ngoài ở gốc 0,9 cm. Bộ nhị nhiều, chỉ nhị dài 2,7 - 3,2cm, không có
lông, chỉ nhị vòng ngoài dính nhau ở gốc 1/2, chỉ nhị vòng trong rời. Bộ nhụy 3 lá
noãn hợp thành bầu 3 ô, mỗi ô chia 2 ngăn, vòi nhụy rời, không có lông, dài 1,9 -
2,1cm.
Dựa trên các đặc điểm hình thái, sơ bộ xác định mẫu Trà hoa vàng Thái
Nguyên thuộc chi Camellia sp., họ Theaceae, chưa xác định được đến loài do chưa
thu được quả và hạt.

25
3.1.1.2. Đặc điểm vi phẫu của Trà hoa vàng Thái Nguyên
a. Vi phẫu lá
1 2
3 4
Chú thích: 1. Biểu bì dưới 2. Mô dày dưới
3. Mô mềm 4. Thể cứng
5. Mô cứng 6. Libe
7. Mạch gỗ 8. Mô dày trên
9. Biểu bì trên 10. Mô giậu
11. Mô khuyết
5 6
7 8
Hình 3.2. Vi phẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên
Mặt cắt ngang phiến lá gồm 2 phần: Gân và phiến lá.
Phần gân lá lồi cả 2 mặt, mặt dưới lồi rõ. Từ dưới lên trên gồm các phần:
Biểu bì dưới (1) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật kích thước không đều, có phủ
một lớp cutin mỏng. Mô dày (2) gồm 4-5 lớp tế bào hình đa giác, thành dày ở góc,
kích thước không đều, xếp sít nhau. Mô mềm (3) gồm các lớp tế bào hình tròn, kích
thước không đều nhau. Mô cứng (5) gồm 2-5 lớp tế bào hình đa giác kích thước
không đều nhau sắp xếp tạo thành một cung bao quanh bó libe-gỗ. Bó libe-gỗ có gỗ
ở trên, libe phía dưới; libe (6) gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác kích thước đều,
xếp lộn xộn thành từng đám; mạch gỗ (7) hình đa giác hay vuông xếp thành dãy xen
lẫn với mô mềm gỗ (tế bào hình vuông hay đa giác) hóa mô cứng. Nằm rải rác trong
mô mềm là thể cứng (4) kích thước lớn nhánh nhọn, đa hình dạng và các tinh thể
calci oxalat (8) hình cầu gai.
Phần phiến lá: Biểu bì (1), (9) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, tế bào
biểu bì trên (9) lớn hơn tế bào biểu bì dưới (1); lỗ khí có thể quan sát được ở biểu bì

26
1 4
dưới. Mô giậu (10) gồm các tế bào thuôn dài xếp xít nhau. Mô khuyết (11) gồm các
lớp tế bào đa giác hoặc tròn, sắp xếp lộn xộn.
b. Vi phẫu thân
Chú thích:
1. Biểu bì 2. Mô mềm vỏ
3. Mô cứng 4. Libe 5. Mạch gỗ
6. Thể cứng 7. Mô mềm ruột
Hình 3.3. Vi phẫu thân Trà hoa vàng Thái Nguyên
Mặt cắt ngang thân cây có thiết diện gần tròn, gồm những bộ phận sau:
Biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật tương đối đều nhau, phía ngoài
có phủ lớp cutin. Mô mềm vỏ (2) gồm nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước không
đều, sắp xếp lộn xộn. Vòng mô cứng (3) gồm 2-3 lớp tế bào sợi, kích thước không
đều, thành dày hóa gỗ, bắt màu xanh, kích thước không đều nhau. Bó libe gỗ cấp
hai có libe ở ngoài, gỗ nằm phía trong. Libe cấp hai (4) gồm các tế bào hình tròn,
kích thước không đều, xếp thành dãy xuyên tâm. Trong libe xuất hiện rải rác các thể
cứng với kích thước khác nhau. Gỗ cấp hai (5) gồm các mạch gỗ xếp rất sít nhau,
tia ruột hẹp. Mô mềm ruột (7) gồm các lớp tế bào hình tròn, kích thước không đều
nhau, xuất hiện rải rác thể cứng (6) với kích thước khác nhau.
3 4
5
7
6 6

27
3.1.2. Kết quả nghiên cứu hóa học
3.1.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất hóa học
Kết quả định tính các nhóm chất hóa học có trong mẫu lá Trà hoa vàng Thái
Nguyên được thể hiện trong Bảng 3.1:
Bảng 3.1. Kết quả định tính
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Flavonoid
Phản ứng với hơi FeCl3 +++
Có
Phản ứng với NaOH 10% ++
Phản ứng với hơi NH3 +
Phản ứng với Cyanidin ++
2 Alcaloid
Thuốc thử Mayer -
Không có
Thuốc thử Bouchardat -
Thuốc thử Dragendroff -
3 Saponin Phản ứng tạo bọt +++ Có
4 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không có
5
Glycosid
tim
Phản ứng Liebermann -
Burchardt
+
Không
có
Phản ứng Baljet -
Phản ứng Legal -
6 Tanin
Phản ứng Chì acetat 10% +
Có
Phản ứng với FeCl3 5% +++
Phản ứng với gelatin 1% ++
Phản ứng của tanin catechic +++
7 Coumarin
Phản ứng đóng mở vòng lacton -
Không có
Phản ứng với TT Diazo -
8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc + Có
9 Sterol
Phản ứng Liebermann –
Burchardt
+ Có
10 Acid amin
Phản ứng với thuốc thử
Ninhydrin
+ Có

28
11 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Felling ++ Có
12
Acid hữu
cơ
Phản ứng với Na2CO3 - Không có
Chú thích: Phản ứng âm tính : - Phản ứng dương tính rõ: ++
Phản ứng dương tính: + Phản ứng dương tính rất rõ: +++
Nhận xét: Trong lá của mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên có các nhóm chất:
tanin, flavonoid, saponin, đường khử, sterol, chất béo và các acid amin. Trong đó có
một số phản ứng cho thấy sự có mặt của polyphenol trong mẫu nhiên cứu như: phản
ứng tạo tủa xanh đen với dung dịch Fe3+
, phản ứng với kiềm NaOH 10% và hơi
NH3, phản ứng Cyanidin, đặc biệt có phản ứng đặc hiệu với vanilin/HCl cho thấy sự
có mặt của tanin catechic.
3.1.2.2. Kết quả định tính EGCG bằng sắc ký lớp mỏng
Qua khảo sát một số pha động, chúng tôi nhận thấy hệ 2: chloroform- aceton-
acid formic (5:5:1) cho kết quả tách sắc ký tốt nhất và phát hiện được các vết rõ nét
nhất khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 ở ánh sáng thường. Do đó đề tài
chọn hệ dung môi này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Hình ảnh sắc ký đồ khi
khai triển với pha động trên và giá trị Rf của các vết tách ra trên sắc ký đồ được
trình bày trong Hình 3.4 và Bảng 3.2.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của chuẩn
EGCG và mẫu thử hiện màu bằng
thuốc thử vanilin - H2SO4 ở ánh
sáng thường
Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc các vết trên
sắc ký đồ
STT Rf Màu sắc
Mẫu
chuẩn
1 0,451 Hồng nhạt
Mẫu
thử
3 0,451 Hồng nâu

29
Nhận xét: Sau khi tiến hành sắc ký với pha động chloroform- aceton- acid
formic (5:5:1) chúng tôi nhận thấy rằng chất chuẩn EGCG có Rf = 0,451 và dịch
chiết toàn phần lá Trà hoa vàng tách được 5 vết, trong đó có 1 vết có giá trị Rf
tương ứng với EGCG. Như vậy có thể sơ bộ xác định trong mẫu nghiên cứu có chứa
EGCG.
3.1.2.3. Kết quả định lượng polyphenol toàn phần
a. Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả
Khảo sát độ hấp thụ cực đại của dung dịch chuẩn
Hình ảnh phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn acid gallic chuẩn nồng độ 50µg/ml
sau khi phản ứng được thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh quét phổ của dung dịch chuẩn acid gallic nồng độ 50 µg/ml
Nhận xét: Đồ thị thể hiện độ hấp thụ theo bước sóng cho thấy sản phẩm của
phản ứng đối với chất chuẩn acid gallic có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 760 nm.
Vì vậy đề tài lựa chọn bước sóng này để đo độ hấp thụ của các mẫu chuẩn và mẫu
nghiên cứu.
Khảo sát khoảng tuyến tính
Nồng độ chuẩn gốc Cgốc= 107,6 µg/ml. Bảng 3.3 trình bày các giá trị đo độ
hấp thụ cực đại của dãy dung dịch chuẩn acid gallic tại bước sóng 760 nm.
Bảng 3.3. Độ hấp thụ của dãy chuẩn
Mẫu chuẩn C10 C20 C30 C40 C50 C60
Nồng độ lý thuyết 10 20 30 40 50 60
Nồng độ chuẩn thực tế 10,76 21,52 32,28 43,04 53,80 64,56
Độ hấp thụ ABS 0,092 0,178 0,266 0,369 0,463 0,575

30
Dựa trên kết quả độ hấp thụ của các mẫu chuẩn tại bước sóng 760nm, xây
dựng được đường chuẩn sau (Hình 3.6):
Hình 3.6. Đường chuẩn acid gallic
Nhận xét: Mối quan hệ giữa mật độ quang với nồng độ chất chuẩn là tuyến
tính trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tương quan r2
= 0,998 > 0,99. Vì vậy,
khoảng nồng độ khảo sát là phù hợp để định lượng polyphenol toàn phần trong mẫu
lá Trà hoa vàng Thái Nguyên.
Khảo sát độ lặp lại
Bảng 3.4 trình bày kết quả khi khảo sát độ lặp lại của phương pháp khi tiến
hành trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu nghiên cứu
Lần
Khối lượng
(g)
Hàm lượng
chất khô(%)
Mật độ quang
(ABS)
Hàm lượng
polyphenol toàn
phần (%)
1 0,3000 92,9 0,151 6.7
2 0,3001 93,0 0,151 6,7
3 0,3001 92,9 0,154 6,8
4 0,3002 92,8 0.152 6,7
5 0,2999 92,9 0,151 6,7
6 0,3003 92,9 0,153 6,8
Hàm lượng polyphenol trung bình: 6,7% RSD= 0,7%
Nhận xét: Phương pháp có độ lặp lại cao khi tiến hành với mẫu nghiên cứu
với RSD= 0,7%.
0,7
y = 0,009x - 0,0135
0,6 R² = 0,998
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80

31
Như vậy, phương pháp đã khảo sát có thể áp dụng để định lượng polyphenol
toàn phần trong mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên ở bước sóng 760 nm.
b. Kết quả định lượng mẫu nghiên cứu
Theo phương pháp đã khảo sát, hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu
lá Trà hoa vàng Thái Nguyên là 6,7% (tính theo dược liệu khô). Kết quả được thể
hiện trong Bảng 3.4.
3.1.2.4. Bán định lượng EGCG theo phương pháp sắc ký lớp mỏng
a. Đánh giá phương pháp
Độ đặc hiệu
Kết quả chồng pic của nghiên cứu, mẫu chuẩn và mẫu trắng được thể hiện
trong Hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng
Nhận xét: Kết quả chồng pic của mẫu nghiên cứu, mẫu chuẩn và mẫu trắng
cho thấy pic của mẫu thử và chuẩn trùng khớp tại vị trí Rf của chất chuẩn EGCG,
sắc ký đồ của mẫu trắng (methanol) không có sự xuất hiện của chất chuẩn EGCG.
Như vậy, phương pháp được coi là đặc hiệu khi bán định lượng EGCG trong mẫu
thử.
Khoảng tuyến tính
Hình ảnh sắc ký đồ khi triển khai sắc ký đối với dãy chuẩn EGCG và diện tích
pic tương ứng được thể hiện trong Hình 3.8 và Bảng 3.5.

32
300000
250000 y = 46429x + 20732
R² = 0,9951
200000
150000
100000
50000
0
0 2 4 6
Bảng 3.5. Kết quả xây dựng đường
chuẩn EGCG
Hình 3.8. Sắc ký đồ dãy chuẩn
EGCG
Từ kết quả trong Bảng 3.5, tiến hành xây dựng đường chuẩn của phép bán
định lượng EGCG trong Trà hoa vàng Thái Nguyên (Hình 3.9).
Hình 3.9. Đường chuẩn EGCG
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy nồng độ EGCG và diện tích pic thể hiện
tương quan tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tương quan r2
=
0,9951 > 0,99. Vì vậy khoảng nồng độ khảo sát phù hợp để bán định lượng EGCG
trong các mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên.
Độ lặp lại
Hình ảnh sắc ký đồ và kết quả diện tích pic khi tiến hành sắc ký lặp lại trên
mẫu nghiên cứu với điều kiện khảo sát được thể hiện trong Hình 3.10 và Bảng 3.6.
Nồng độ chất chuẩn
EGCG (mg/ml)
Diện tích pic
(mAu)
Lý thuyết Thực tế
1 0,9654 59978,12
2 1,9308 114876,3
3 2,8962 157694,5
4 3,8616 203834,5
5 4,8270 239610,9

33
Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp
lại trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái
Nguyên
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại
trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên
Lần
Diện tích pic
(mAu)
1 212920,5
2 214386,6
3 210289,2
4 214767,3
5 211041,8
6 210273,4
Trung bình 212279,8
RSD = 0,9%
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao khi khảo sát
trên mẫu nghiên cứu với RSD = 0,9%. Vì vậy có thể tiến hành bán định lượng với
mẫu nghiên cứu theo phương pháp này.
Độ đúng
Hình ảnh sắc ký đồ và diện tích pic thu được khi khảo sát độ đúng của
phương pháp được trình bày trong Hình 3.11 và Bảng 3.7.
Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của phương pháp

34
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Mẫu
thử
Diện tích pic
(mAu)
Nồng độ mẫu
thử (mg/ml)
Nồng độ chất chuẩn
tìm lại (mg/ml)
Độ thu
hồi**
(%)
Lần 1 175630,6 1,9161 0,9061 95,5
Lần 2 177358,1 1,9368 0,92175 97,6
Lần 3 179063,1 1,9573 0,9425 99,7
Lần 4 182805,0 2,00225 1,0079 104,4
Lần 5 183651,4 2,0124 1,0181 105,4
Lần 6 178806,3 1,9542 0,96485 99,4
** So với nồng độ thực đã biết của chuẩn (hệ số thu hồi)
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy phương pháp có độ đúng của phương pháp
bán địnhlượng EGCG nằm trong khoảng 95,5 - 105,4%. So với độ đúng chấp nhận
của AOAC cho một phương pháp định lượng là từ 90,0 – 108,0% ở nồng độ chất
phân tích ≥ 0,1% thì giá trị này là được chấp nhận [22].
Như vậy, phương pháp bán định lượng EGCG trong lá Trà hoa vàng Thái
Nguyên đã đảm bảo được độ đúng, độ lặp lại và độ đặc hiệu để bán định lượng
EGCG cho mẫu nghiên cứu.
b. Kết quả bán định lượng EGCG trong mẫu nghiên cứu
Kết quả bán định lượng EGCG trong mẫu nghiên cứu theo phương pháp đã xây
dựng được trình bày trong Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả bán định lượng EGCG
Khối lượng mẫu
(g)
Hàm lượng chất
khô (%)
Diện tích pic
(mAu)
Hàm lượng
EGCG (%)
0,5002 93,0 212279,8 0,5%
Nhận xét: Hàm lượng EGCG trong mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên khi
xác định theo phương pháp bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng là 0,5%.

35
3.1.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học in vitro
3.1.3.1. Xác định hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH
Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa thông qua phép thử trung hòa gốc
tự do của DPPH được thể hiện trong Bảng 3.9. Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa
nồng độ mẫu thử và tỷ lệ gốc tự do bị trung hòa (%SA) được thể hiện trong Hình
3.12.
Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính chống
oxy hóa của mẫu thử
Trà hoa vàng Thái Nguyên
Acid ascorbic
Hình 3.12. Đồ thị sự phụ thuộc Tỷ lệ
gốc tự do bị trung hòa theo nồng độ
mẫu thử
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy dịch chiết lá Trà hoa vàng Thái Nguyên thể
hiện rõ khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH với SC50 là 42,62 µg/ml. Đối chứng
dương là acid ascorbic có hoạt tính mạnh và ổn định trong quá trình thí nghiệm. Các
số liệu chính xác với r2
≥ 0,99.
3.1.3.2. Kết quả thử tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro
Kết quả xác định hoạt tính độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư MDA-BA-
231, LU-1, SK-Mel-2, HepG2, SW480 của mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên được
thể hiện trong Bảng 3.10:
Nồng độ
(µg/ml)
Tỷ lệ gốc tự do bị
trung hòa (%SA)
Trà hoa vàng
Thái Nguyên
Acid
ascorbic
200 85,97
100 81,12 88,24
50 52,25 81,63
25 28,67 76,32
12,5 9,99 39,89
6,25 3,33
SC50 42,62 14,08

36
Bảng 3.10. Kết quả ức chế tế bào ung thư in vitro
của lá Trà hoa vàng Thái Nguyên
Nồng độ
(µg/ml)
Tỷ lệ ức chế (%)
Mẫu thử: Trà hoa vàng Thái Nguyên
HepG2 LU-1 MDA-BA-231 SW480 SK-Mel-2
100 42,61 33,46 33,84 37,24 40,93
20 27,25 14,92 16,52 19,02 11,82
4 13,61 8,41 7,15 5,98 3,19
0.8 3,77 0,56 0,58 1,13 -2,14
IC50 >100 >100 >100 >100 >100
Nồng độ
(µg/ml)
Tỷ lệ ức chế (%)
Mẫu chứng dương: Ellipticine
HepG2 LU-1 MDA-BA-231 SW480 SK-Mel-2
10 102,19 98,01 101,82 95,02 97,81
2 81,56 68,89 79,23 71,12 72,16
0.4 49,42 51,82 48,65 49,22 49,92
0.08 25,01 21,77 22,30 25,98 27.11
IC50 0,37 0,47 0,42 0,45 0,42
Nhận xét: Mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên chưa thể hiện hoạt tính ức chế sự
phát triển của 5 dòng tế bào ung thư gồm ung thư gan (Hep-G2), ung thư vú (MDA-
BA-231, ung thư trực tràng (S 480), ung thư da (SK-Mel2) và ung thư phổi (LU-1),
thử nghiệm ở các nồng độ nghiên cứu với các giá trị IC50 > 100 µg/ml. Chất đối
chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là
chính xác với r2
≥ 0,99.
3.2. BÀN LUẬN
3.2.1. Về thực vật
Về đặc điểm hình thái, mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên có nhiều điểm giống
với mẫu Camellia euphlebia Merr. ex Sealy [59]. Điều này được thể hiện qua Bảng
3.11. Tuy nhiên, do còn chưa thu được mẫu quả và hạt nên giám định chính xác tới

37
loài còn hạn chế, chỉ sơ bộ xác định mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên thuộc chi
Camellia L., họ Theaceae.
Bảng 3.11. Một số đặc điểm tương đồng về hình thái của
Camellia euphlebia và Trà hoa vàng Thái Nguyên
Camellia euphlebia
Trà hoa vàng Thái
Nguyên
Cuống lá
Chiều dài 0,9 – 1,3 cm 0,9 cm
Đặc điểm Nhẵn Nhẵn
Phiến lá
Kích thước phiến lá
Dài 9 - 15 cm, rộng
4 - 7 cm.
Dài 8,1 – 18,7 cm, rộng
4,2 -9,8 cm
Gốc lá Hơi tù Hình nêm/ hơi tròn
Số cặp gân bên 8 - 13 8 - 13
Hoa
Đường kính khi nở 5 - 6 cm 4,5 cm
Cuống hoa Bị phủ bởi lá bắc Bị phủ bởi lá bắc
Lá bắc
7 - 8, có lông rất
mịn ở mặt trong
6, có lông rất mịn ở mặt
trong và mép
Lá đài Có lông mịn ở mép 6, có lông mịn ở mép
Tràng 7 - 9, nhẵn 6, nhẵn
Bộ nhị Chiều dài chỉ nhị 2 – 3,5 cm 2,7 – 3,2 cm
Bộ nhụy
Bầu 3 ô 3 ô
Vòi nhụy 3, rời 3, rời
Về đặc điểm giải phẫu, các đặc điểm cấu tạo giải phẫu thân và lá của Trà hoa
vàng Thái Nguyên mang nhiều đặc điểm đặc trưng của chi Camellia L. như đặc
điểm có vòng mô cứng hình cung bao quanh bó libe – gỗ ở gân lá, có nhiều thể
cứng tương đối lớn, rải rác ở cả cành và lá, trong mô mềm của gân lá có rất nhiều
tinh thể calci oxalat hình cầu gai [3].
3.2.2. Về thành phần hóa học
Đề tài đã tiến hành nghiên cứu định tính sơ bộ các nhóm chất trong mẫu lá
Trà hoa vàng Thái Nguyên và xác định trong thành phần của mẫu nghiên cứu có các
nhóm chất tanin, flavonoid, saponin, đường khử, sterol, chất béo và các acid amin.
Trong Trà hoa vàng Thái Nguyên không có alcaloid, một thành phần có nhiều trong
Trà xanh, đặc biệt là cafein. Kết quả này tương tự kết quả do Lixia Song và cộng sự

38
nghiên cứu trên 6 loài Trà hoa vàng ở Trung Quốc là C. impressinervis, C.
euphlebia, C. microcarpa, C. nitidissima, C. tunghinensis và C. chrysantha. [51].
Đây là đặc tính rất tốt để sử dụng Trà hoa vàng năng dưới dạng chè để uống mà
không ảnh hưởng đến hệ thần kinh như Trà xanh, có thể tận dụng lợi thế này của
Trà hoa vàng để sử dụng thay thế Trà xanh.
Trong Trà hoa vàng Thái Nguyên, nhóm chất đặc trưng nhất là polyphenol,
được định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng như phản ứng Shinoda, phản
ứng với FeCl3 và đặc biệt là phản ứng với vanilin/ HCl đặc. Hàm lượng polyphenol
toàn phần trong lá Trà hoa vàng Thái Nguyên khi tiến hành định lượng bằng
phương pháp đo quang là 6,7% (tính theo khối lượng mẫu khô). Với cùng điều kiện
định lượng, so sánh hàm lượng polyphenol toàn phần của mẫu nghiên cứu với một
mẫu Trà hoa vàng khác là Camellia chrysanthoides (Quảng Ninh), nhận thấy mẫu
nghiên cứu có hàm lượng polyphenol toàn phần gần xấp xỉ với hàm lượng có trong
mẫu ở Quảng Ninh là 6,2% [16]. Trái lại, khi so sánh với mẫu Trà hoa trắng
Camellia sp1 (Quảng Ninh) có hàm lượng polyphenol toàn phần là 20,1% [16] thì
hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu tại Thái Nguyên thấp hơn
rõ rệt
Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy trong Trà hoa vàng Thái
Nguyên có chứa EGCG và hàm lượng EGCG trong mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên
khi bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng là 0,5%. Phương pháp có
độ đặc hiệu, tính tuyến tính với hệ số tương quan r2
= 0,995, độ lặp lại cao với RSD
= 0,9% và độ đúng 95,5-105,4% nằm trong khoảng chấp nhận theo AOAC [22].
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp đơn giản, kinh tế và nhanh gọn
được dùng cho phân tích định tính, định lượng. Phương pháp này rất hữu ích trong
nhận dạng một hợp chất đã biết và phát hiện sự có mặt của nhiều loại hợp chất khác
trong cây cỏ, ví dụ như phenols, steroids, alkaloid, flavonoid, và coumarin.
Trên thực tế, phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) được sử
dụng trong nghiên cứu phân loại các loài và dưới loài bởi sự chuẩn hóa ở tất cả các
bước tiến hành. Tuy nhiên, do điều kiện không cho phép, khóa luận chỉ thực hiện
sắc ký trên bản mỏng dành cho TLC. Nhưng các bước tiến hành thì đều sử dụng
công cụ, máy móc dành cho HPTLC như: tiêm mẫu bằng máy Linomat 5, khai triển

39
sắc ký trong máy ADC2, hiện vết bằng TLC Visualizer. Quá trình tiêm mẫu được
tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích phun mẫu, tốc độ tiêm và không
có nguy cơ ảnh hưởng về mặt cơ học làm hỏng bản mỏng. Trong quá trình khai
triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại
đầy đủ đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành ở những phòng thí nghiệm khác
nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số
liệu ứng dụng trong định tính và bán định lượng. Chính những điều kiện kỹ thuật
này đã giúp cho việc bán định lượng thông qua việc đo cường độ màu của các vết
sắc ký được thực hiện tương đối ổn định.
3.2.3. Về tác dụng sinh học
Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp pháp trung hòa gốc
tự do DPPH là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong những nghiên cứu về
hoạt tính chống oxy hóa của các ược liệu vì tính đơn giản, nhanh chóng, ổn định và
khá chính xác.
Dựa trên kết quả thu được cho thấy mẫu lá Trà hoa vàng thể hiện rõ khả năng
trung hòa gốc tự do DPPH với SC50 là 42,62 µg/ml. Ở nồng độ 100 μg/ml, mẫu
nghiên cứu có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH như tương tự như acid ascorbic
ở nồng độ 50 μg/ml (khoảng 81%).
Cũng tương tự như hàm lượng polyphenol toàn phần, khi so sánh với mẫu
Camellia chrysanthoides (Quảng Ninh) có SC50 là 42,43 µg/ml, khả năng trung hòa
gốc tự do của mẫu nghiên cứu là thấp hơn không đáng kể. Tuy nhiên, khi so sánh
với mẫu Trà hoa trắng (Quảng Ninh) có SC50 là 25,88 µg/ml thì mẫu Trà hoa vàng
Thái Nguyên có khả năng trung hòa gốc tự do thấp hơn rõ rệt [16]. Điều này phù
hợp với sự chênh lệch hàm lượng polyphenol toàn phần giữa các mẫu và cũng phù
hợp với các nghiên cứu trước đã cho rằng khả năng chống oxy hóa tỷ lệ với hàm
lượng polyphenol toàn phần [24], [39].
Về kết quả gây độc tế bào ung thư, mẫu nghiên cứu chưa thể hiện hoạt tính
ức chế sự phát triển của 5 dòng tế bào ung thư bao gồm: ung thư gan (Hep-G2), ung
thư vú (MDA-BA-231), ung thư trực tràng (S 480), ung thư da (SK-Mel2) và ung
thư phổi (LU-1. Điều này khác biệt so với các mẫu Trà hoa vàng khác ở Quảng
Ninh đều có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [16].

40
KẾT LUẬN
- Về đặc điểm thực vật:
Đã mô tả chi tiết đặc điểm hình thái của lá và hoa Trà hoa vàng Thái
Nguyên. Sơ bộ giám định được tên khoa học là Camellia sp., họ Trà (Theaceae).
Đã mô tả được đặc điểm giải phẫu của cành và lá Trà hoa vàng Thái Nguyên,
góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu.
- Về thành phần hóa học:
Đã xác định được các nhóm chất có trong lá Trà hoa vàng Thái Nguyên là:
flavonoid, tanin, saponin, đường khử, steroid, chất béo và các acid amin.
Đã xác định hàm lượng polyphenol toàn phần trong lá Trà hoa vàng Thái
Nguyên là 6,7% bằng phương pháp đo quang.
Đã xác định hàm lượng EGCG trong lá Trà hoa vàng Thái Nguyên là 0,5%
khi thực hiện bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
- Về tác dụng sinh học:
Cao lá Trà hoa vàng Thái Nguyên có tác dụng chống oxy hóa theo phương
pháp DPPH với giá trị SC50 là 42,62 µg/ml.
Cao lá Trà hoa vàng Thái Nguyên chưa thể hiện hoạt tính ức chế sự phát
triển của 5 dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-G2), ung thư vú (MDA-BA-231,
ung thư trực tràng (S 480), ung thư da (SK-Mel2) và ung thư phổi (LU-1).
ĐỀ XUẤT
- Tiếp tục theo dõi và thu thập đủ cơ quan sinh sản của Trà hoa vàng Thái
Nguyên để giám định đầy đủ tên khoa học.
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học trong các bộ phận khác của Trà hoa
vàng Thái Nguyên như cành, hoa, v.v.
- Nghiên cứu phân lập EGCG trong lá Trà hoa vàng Thái Nguyên

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất bản Y học.
2. Nguyễn Bá (2001), Hình thái học thực vật, Nhà xuất bản giáo dục.
3. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nhà xuất bản Y học.
4. Bộ khoa học và công nghệ (2003), TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005),
Phần 1: Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè-phương pháp đo màu
dùng thuốc thử Folin- Ciocalteur, Tiêu chuẩn quốc gia.
5. Bộ môn Dược liệu – Đại học Dược Hà nội (1998), Thực tập dược liệu, in tại
Trung tâm thư viện Đại học Dược Hà Nội.
6. Bộ môn Thực Vật (2002), Thực tập Thực vật và nhận biết cây thuốc, Trung
tâm thư viện Đại học Dược Hà Nội.
7. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Nhà xuất bản Khoa học kỹ
thuật.
8. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa
học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học.
9. Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ làm thuốc, tập 2, Nhà xuất bản Trẻ.
10. Bùi Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (2011), "Nghiên cứu tác
dụng của chè xanh (Camellia sinensis) trên dòng tế bào ung thư vú", Tạp chí
y học, tr. 32-37.
11. Trần Ninh & Hakoda Naotoshi (2010), Các loài trà của Vườn quốc gia Tam
Đảo.
12. Trần Ninh (2001), "Các loài trà hoa vàng thuộc chi Camellia ở Việt Nam",
Tạp chí sinh học, Số 23 (3a), tr. 12 -15.
13. Trần Ninh, Lê Nguyệt Hải Ninh (2004), "Một số dẫn liệu về ba loài trà hoa
vàng mới của Việt Nam". Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học
sự sống, Nhà XBKH&KT, Hà Nội, tr. 185-188.
14. Nguyễn Thị Phương (2014), "Thành phần hóa học, tác dụng sinh học chủ
yếu của Trà hoa vàng và khả năng ứng dụng trong Y Dược" , Hội thảo Bảo
tồn và Phát triển bền vững Trà hoa vàng tại Tam Đảo lần thứ nhất.

15. Ngô Thị Thảo (2016), "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, xác định hàm lượng
polyphenol và EGCG, thử độc tế bào và chống oxy hóa của Trà hoa vàng tại
Ba Chẽ - Quảng Ninh" , Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
16. Đỗ Văn Tuân (2015), "Một số kết quả bảo tồn hai loài Trà hoa vàng Tam
Đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh ) và Trà vàng Pêtêlô (Camellia
petelotii (Mer.) Sealy) thuộc chi Chè (Camellia L.) tại Vườn Quốc gia Tam
Đảo", Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần
thứ 6, tr. 1791-1797.
17. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất
bản Khoa học và Kỹ thuật.
18. Viện Kiểm Nghiệm thuốc trung ương - Bộ Y Tế (2012), Khóa đào tạo thẩm
định quy trình phân tích SKLM và HPLC trong thuốc đông dược (theo thông
tư số 22).
Tài liệu tiếng Anh
19. A. Monks, D. Scudiero, P. Skehan, R. Shoemake, K. Paull, D. Vistica, C.
Hose, J. Langley, P. Cronise, H. Campbell, J. Mayo, M. Boyd (1991),
"Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of
cultured human tumor cell lines", Journal of National Cancer Institute, No.
11, Vol. 83, pp. 757-766.
20. Anderson, D (2007), Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 31 edition,
Elsevier Science Ltd, United Kingdom.
21. AOAC International (2013), AOAC Guideline for Single Laboratory
Validation of Chemical Methods of Dietary Supplements and Botanicals,
USA.
22. Armen Takhtajan (2009), Flowering plant, Spinger Netherlands.
23. Brighente I M C, Dias M, Verdi L G, Pizzolatti M G (2007), "Antioxidant
Activity and total phenolic content of some Brazilian species",
Pharmaceutical Boilogy, Vol. 45, No. 2, pp. 156-161.
24. D A Scudiero, R H Shoemaker, K D Paill, A Monks, S Tierney, T H
Nofziger, M J Curens, D Seniff, M R Boyd (1988), "Evaluation of a soluble

Tetrazolium/ Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture
using human and other tumor cell lines", Cancer Research, 48, pp. 4827-
4833.
25. Dale G. Nagle, Daneel Ferreira, Yu-Dong Zhou (2006), "Epigallocatechin-3-
gallate (EGCG): Chemical and biomedical perspectives", Phytochemistry,
(67), pp. 1849–1855.
26. Devi Datt Joshi (2012), Herbal Drugs and Fingerprints, Spinger.
27. Eike Reich (2006), High Performance Thin Layer Chromatography for the
analysis of Medicinal Plant, New York: Thieme.
28. European Medicines Agency (2009), Guideline on bioanalytical method
validation, London.
29. G. Orel, P. G. Curry and Luu Hong Truong (2013), "Camellia oconoriana
(Theaceae): A new species from Vietnam", Edinburgh journal of botany,
70(3), pp. 439-447.
30. Gabriel A Agbor, Joe A Vinson and Patrick E. Donnelly (2014), "Folin-
Ciocalteau Reagent for Polyphenolic Assay" International Journal of Food
Science, Nutrition and Dietetics ISSN 2326-3350, 3(8), pp. 147-156.
31. George Orel & Anthony S. Curry (2013), "Nine new yellow flowering
Camellia species from Vietnam", International Camellia Journal, pp. 149-
155.
32. George Orel & Peter G. Wilson (2012), "Camellia cattienensis: a new
species of Camellia (sect. Archaecamellia: Theaceae) from Vietnam", Kew
Bulletin, Vol. 66, pp. 565-569.
33. George Orel and Peter G. Wilson (2010), "Camellia luteocerata sp. nov. and
a new section of (Dalatia) from Vietnam", Nordic Journal of Botany, 28:
280-284.
34. George Orel, Peter G. Wilson, and Anthony S. CurryLuu Hong (2014), "Four
New Species and Two New Sections of Camellia (Theaceae) fromVietnam",
A Journal for Botanical Nomenclature, 23(3), pp. 307-318.

35. Higdon J. V., & Frei, B. (2003) "Tea catechins and polyphenols: Health
effects metabolism, and antioxidant functions", Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, pp. 89–143.
36. J. Sherma, B. Fried (2003), Handbook of Thin - Layer Chromatography, 3
editio,. New York: Marcel Dekker Inc.
37. Jin-Bin Wei, Xiong Li, Hui Song, Yong-Hong Liang, Yu-Zheng Pan, Jun-
Xiang Ruan, Xia Qin, Yong-Xin Chen, Cai-Li Nong,Zhi-Heng Su (2015),
"Characterization and determination of antioxidant components in the leaves
of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama based on compositioneactivity
relationship approach", Journal of Food and Drug analysis, (23), pp. 40-48.
38. Kamran G, Yosef G, Mohammad A, Ebrahimzadeh (2009), "Antioxidants
Activity, flavonoids phenol and contents pells and 13 citrus species tissues",
Pak. J. Pharm. Sci., Vol. 22, No. 3, pp. 277-281.
39. Karan Vasisht, Pritam Dev Sharma, Maninder Karan, Dev Dutt Rakesh,
Sandeep Vyas, Shalini Sethi and Ritu Manktala (2003), Study to Promote the
Industrial Exploitation of Green Tea Polyphenols in India, United Nations
Industrial Development Organization (UNIDO).
40. L. B. S. Kardono, C. K. Angerhofer, S. Tsauri, K. Padmawinata, J. M.
Pezzuto, A. D. Kinghorn (1991), "Cytotoxic and antimalarial constituents of
the roots of Eurycoma longifolia", J. Nat. Prod., No. 5, Vol. 5, pp. 1360-
1367.
41. Luu Hong Truong, V. D. (2015), "Camellia sonthaiensis (Theaceae): A new
species from Viet Nam", Ann. Bot. Fennici, vol 52, p. 289-295.
42. M C Alley, D A scudiero, A Monks, M L Hursey, M J Czerwinski, D L Fine,
B J Abbott, J G Mayo, R H Shoemaker, M R Boyd (1988), "Feasibility of
drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture
tetrazolium assay", Cancer Research, 48, pp. 589-601.
43. Naoshiko Hakoda and Tran Ninh (2001), "Camellia flava", Curtis Bot
Magazine, vol 18, pp.190-193.
44. Neeraj Kaul, Himani Agrawal, Bharat Patil, Abhijit Kakad, Dhaneshwar
(2005), "Application of stability - indicating HPTLC method for quantitive

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở thái nguyên.docx

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở thái nguyên.docx

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở thái nguyên.docx

Similar to Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở thái nguyên.docx (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở thái nguyên.docx