Download luận án tiến sĩ ngành sinh học với đề tài: Sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử, sinh học và chẩn đoán miễn dịch Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

1. i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LƢU ANH TÚ
SÁN LÁ PHỔI Paragonimus heterotremus VÀ Paragonimus
westermani Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI, PHÂN TỬ,
SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2018

2. ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LƢU ANH TÚ
SÁN LÁ PHỔI Paragonimus heterotremus VÀ Paragonimus
westermani Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI, PHÂN TỬ,
SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Ký sinh trùng học
Mã số: 62.42.01.05
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. Phạm Ngọc Doanh
2. TS. Bùi Khánh Linh
Hà Nội – 2018

3. i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của chúng tôi. Các số liệu và kết
quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được sử dụng trong luận án nào khác.
Hà Nội, ngày 2 tháng 3 năm 2018
Tác giả

4. ii
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc
Doanh và TS. Bùi Khánh Linh - giảng viên hướng dẫn khoa học, đã tạo điều kiện tối
đa và truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài và viết luận án,
đồng thời luôn động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Xin trân trọng cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ quốc gia
(NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho 2 đề tài mã số 106.12-2012.52 và 106-NN.05-
2016.17 để tôi được thực hiện các nội dung nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Học Viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Phòng Quản lý tổng hợp, cùng các thầy cô trong Viện
Sinh thái và TNSV đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn
thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Hoàng Văn Hiền cùng tập thể cán bộ Phòng Ký
sinh trùng học, Viện Sinh thái và TNSV đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi
thực hiện các thí nghiệm.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Trung ương đã giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, các nhà khoa học,
các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã luôn
quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là chỗ dựa vững
chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn vợ
và các con của tôi đã cho tôi thêm sức mạnh, động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn.
Hà Nội, ngày 2 tháng 3 năm 2018
Tác giả

5. iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt Viết đầy đủ/nghĩa tiếng Việt
CO1 Cytochrome c oxidase subunit mitochondrial gene
Gien ty thể CO1
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết enzym
dot-ELISA dot-ELISA
ELISA điểm trên giấy
DNA Deoxyribonucleic acid
ITS2 Internal transcribed spacer 2
Đoạn chèn hệ gen nhân ITS2
16S rDNA 16S ribosomal DNA/ Gien ty thể 16S
PCR Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuyếch đại gien
MC Metacercaria
LC Lào Cai
YB Yên Bái
QT Quảng Trị
SLP Sán lá phổi

6. iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................ iii
MỤC LỤC....................................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH...................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU...........................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................................4
1.1. Khái quát chung về sán lá phổi................................................................................4
1.1.1. Lịch sử phát hiện, hình thái, cấu tạo và phân loại sán lá phổi ............................4
1.1.2. Vòng đời phát triển của sán lá phổi..........................................................................8
1.1.3. Dịch tễ học bệnh sán lá phổi....................................................................................11
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và tổn thương bệnh sán lá phổi............................................13
1.1.5. Chẩn đoán bệnh sán lá phổi....................................................................................14
Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA): .......................................................16
1.1.6. Điều trị bệnh sán lá phổi..........................................................................................17
1.1.7. Phòng bệnh sán lá phổi............................................................................................18
1.2. ...........Tình hình nghiên cứu hai loài Paragonimus heterotremus và Paragonimus
westermani trên thế giới.........................................................................................................19
1.2.1. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus................................................19
1.2.2. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani...................................................20
1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi và bệnh sán lá phổi ở Việt Nam .....................21
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....25
2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................................25
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu.................................................................................................25
2.1.4. Thời gian nghiên cứu...................................................................................................26
2.2. Phương pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm.....................................................................26

7. v
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................................27
2.3.1. Xét nghiệm cua thu metacercaria của sán lá phổi .........................................................27
2.3.2. Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở cua suối tại địa điểm
nghiên cứu.......................................................................................................................................29
2.3.3. Nghiên cứu hình thái metacercaria..................................................................................29
2.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử của loài Paragonimus heterotremus và
Paragonimus westermani..............................................................................................................30
2.3.5. Gây nhiễm cho vật chủ chính..................................................................................31
2.3.6. Nghiên cứu hình thái sán lá phổi trưởng thành ..................................................31
2.3.7. Xác định vai trò vật chủ chứa..................................................................................32
2.3.8. Xác định vật chủ ngoài tự nhiên của sán lá phổi.................................................32
2.3.9. Nghiên cứu sức sống của metacercaria.................................................................35
2.3.10. Nghiên cứu phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi........................36
2.3.10.1. Nguyên vật liệu và hóa chất.....................................................................................36
2.3.10.2. Quy trình thực hiện dot-ELISA ..............................................................................36
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................40
3.1. Kết quả xác định phương pháp xét nghiệm cua và điều tra tình hình nhiễm
metacercaria ở cua suối tại các địa điểm nghiên cứu ...........................................................40
3.1.1. Xác định phương pháp xét nghiệm cua tìm metacercaria sán lá phổi........................40
3.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của sán lá phổi...............47
3.2.1. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. westermani47
3.2.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. heterotremus.
......................................................................................................................................54
3.3. ...............Một số đặc điểm sinh học của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và
Paragonimus westermani .......................................................................................................59
3.3.1. Vật chủ trung gian thứ nhất....................................................................................59
3.3.2. Vật chủ chính ngoài tự nhiên của sán lá phổi................................................................69
3.3.3. Sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chứa và vật chủ chính.........................72
3.3.4. Sức sống của metacercaria sán lá phổi ở các điều kiện khác nhau..................81
3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh sán lá phổi....................85
3.4.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng.............................................................................85
3.4.2. Xác định nồng độ kháng nguyên và thời gian phản ứng ở 37°
C .................................87

8. vi
3.4.3. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 20°
C .....................................88
3.4.4. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 10°
C .....................................89
3.4.5. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 4o
C..................................................90
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................94
KẾT LUẬN ..............................................................................................................................94
1. Phƣơng pháp xét nghiệm cua và tình hình nhiễm metacercaria của sán lá phổi ở
cua suối......................................................................................................................................94
2. Đa dạng hình thái và di truyền của Paragonimus heterotremus và Paragonimus
westermani ................................................................................................................................94
3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani
.....................................................................................................................................................94
4. Kỹ thuật dot-ELISA chẩn đoán miễn dịch...................................................................95
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................................95
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .............................................................97
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ....................................................98
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................99

9. vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Những vẫn đề đã và chưa được giải quyết của 2 loài sán lá phổi
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng để nhân bản trình tự đích nghiên cứu
ả g Metacercaria thu được với thời gian lắng cặn khác nhau
Bả g So sánh thời gian xét nghiệm ng phương pháp ép và giã-lọc cua
ả g So sánh số lượng metacercaria thu được từ 2 phương pháp xét nghiệm cua
Bảng 3.4 . Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở các địa điểm nghiên cứu
Bảng 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm các loài sán lá phổi ở cua suối
Bảng 3.6. Hình dạng và kích thước các dạng metacercaria của loài P. westermani
Bảng 3.7. Sai khác vị trí nucleotide của trình tự gen 16S giữa dạng diploid và triploid P.
westermani
Bảng 3.8. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu ốc thu từ Việt Nam so với các loài thuộc
giống Gammatricula dựa vào trình tự gen CO1.
Bảng 3.9. Kích thước ấu trùng sán lá phổi trong cơ thể ốc
Bảng 3.10. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá phổi ở ốc tại các địa điểm nghiên cứu
Bảng 3.11. Vật chủ ốc của các loài sán lá phổi ở các nước và Việt Nam
ả g . Kết quả gây nhiễm metacercaria P. westermani cho chuột bạch
ả g . Kích thước metacercaria mới thoát nang và sán non thu từ chuột bạch thí
nghiệm sau gây nhiễm 30 ngày
Bảng 3.14. Kết quả gây nhiễm P. westermani cho động vật nuôi
Bảng 3.15. Kích thước sán thu từ phổi m o sau 170-180 ngày gây nhiễm
Bảng 3.16. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30o
C) trong nước
muối sinh lý
Bảng 3.17. Sức sống của metacercaria trong dung dịch nước muối sinh lý tại 4o
C ở các
mật độ khác nhau
Bảng 3.18. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA
Bảng 3.19. Thời gian phản ứng ELISA ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

10. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hình dạng chung của sán lá phổi Paragonimus
Hình 1.2. Hình dạng chung của metacercaria sán lá phổi Paragonimus
Hình 1.3. Hình dạng chung cercaria của sán lá phổi Paragonimus
Hình 1.4. Hình dạng trứng sán lá phổi Paragonimus
Hình 1.5. Vòng đời phát triển của loài Paragonimus westermani
Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu
Hình 2.2. Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ trung gian thứ nhất
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ chính
Hình 2.5. Chuẩn bị nhỏ huyết thanh đối chứng và kháng nguyên lên giấy nitrocellulose
Hình 3.1. Các loài cua suối bắt được ở các địa điểm nghiên cứu
Hình 3.2. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Quảng Trị
Hình 3.3. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Yên Bái và Lào Cai
Hình 3.4. Paragonimus westermani metacercaria thu từ cua suối bắt tại Yên Bái
Hình 3.5. Các dạng P. westermani metacercaria thu từ cua suối tại tỉnh Quảng Trị.
Hình 3.6. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên trình tự
ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.
Hình 3.7. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên trình tự
gen 16S được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.
Hình 3.8. Metacercaria loài P. heterotremus thu từ Yên Bái và Lào Cai
Hình 3.9. Metacercaria loài P. heterotremus thu từ Quảng Trị
Hình 3.10. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên trình
tự ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.
Hình 3.11. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên trình
tự CO1 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.
Hình 3.12. Ốc nhiễm ấu trùng Microcercaria
Hình 3.13. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Quảng Trị tương đồng
cao nhất (99%) với loài S. quangtriensis.

11. ix
Hình 3.14. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Yên Bái và Lào Cai
tương đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis.
Hình 3.15. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Yên Bái và Lào Cai
tương đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis.
Hình 3.16. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài ốc thuộc họ Pomatiopsidae.
Hình 3.17. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.1 tại Yên Bái và Lào
Cai 100% tương đồng với loài P. heterotremus.
Hình 3.18. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.2 tại Quảng Trị 100%
tương đồng với loài P. proliferus.
Hình 3.19. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc S. quangtriensis tại Quảng Trị 100%
tương đồng với loài P. westermani.
Hình 3.20. Cercaria (trên) và redia (dưới) của các loài sán lá phổi
Hình 3.21. Ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá phổi
Hình 3.22. Trứng sán lá phổi Paragonimus sp. (a-c) và sán lá (d) thu từ mẫu phân của
mèo rừng tại Quảng Trị
Hình 3.23. Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. westermani.
Hình 3.24. Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với P. heterotremus.
Hình 3.25. Trình tự của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. skrjabini.
Hình 3.26. Trình tự ITS2 của trứng sán lá tương đồng với loài Pharyngostomum
cordatum.
Hình 3.27. Trình tự D-Loop từ các mẫu phân dương tính sán lá phổi tương đồng cao với
trình tự của mèo rừng, Prionailurus bengalensis.
Hình 3.28. Sự phát triển của sán lá phổi P. westermani ở động vật thí nghiệm.
Hình 3.29. Paragonimus westermani thu ở m o thí nghiệm sau gây nhiễm 120 ngày.
h . Bệnh tích phổi m o nhiễm sán lá phổi P. westermani (mũi tên chỉ ổ apxe, ên
trong thường chứa 2 cá thể sán, tổ chức phổi ị viêm).
Hình 3.31. Khác nhau về kích thước sán non thu ở cơ (a) và gan ( ) của chuột bạch sau
gây nhiễm 1 tháng.
Hình 3.32. Sự phát triển của P. heterotremus ở động vật thí nghiệm.
Hình 3.33. Bệnh tích đại thể phổi mèo nhiễm sán lá phổi P. heterotremus.
Hình 3.34. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30o
C) trong nước
muối sinh lý.

12. x
Hình 3.35. Sức sống của P. westermani metacercaria theo thời gian bảo quản ở 4o
C ở các
mật độ khác nhau.
Hình 3.36. Sức sống của P. heterotremus metacercaria theo thời gian bảo quản ở 4o
C ở
các mật độ khác nhau.
Hình 3.37. Metacercariae thoát khỏi nang ở nhiệt độ 4o
C sau 2 tháng ở mật độ 200
metacercaria/2ml.
Hình 3.38. Kết quả phản ứng dot-ELISA với huyết thanh.
Hình 3.39. Phản ứng dot-ELISA với các nồng độ kháng nguyên và thời gian ủ khác nhau
ở điều kiện 37o
C.
Hình 3.40. Thời gian hiện màu của phản ứng dot-ELISA ở 37o
C.
Hình 3.41. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở thời gian khác nhau ở 20o
C.
Hình 3.42. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 20o
C.
Hình 3.43. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 10o
C.
Hình 3.44. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 10o
C.
Hình 3.45. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 4o
C.
Hình 3.46. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 4o
C.

13. 1
MỞ ĐẦU
Sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus, ký sinh ở phổi người và động vật,
gây nên bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của
người và động vật. Nguyên nhân nhiễm bệnh do ăn phải ấu trùng cảm nhiễm
metacercaria từ vật chủ trung gian thứ hai (chủ yếu là cua suối) hoặc sán non từ vật chủ
chứa [1]. Người bị nhiễm sán lá phổi có biểu hiện gầy yếu, khó thở, ho từng cơn, khạc ra
đờm có máu màu gỉ sắt, dễ bị chẩn đoán nhầm với lao phổi hoặc các bệnh khác ở phổi,
gây khó khăn cho công tác chẩn đoán và trị bệnh [1, 2].
Hơn 50 loài SLP thuộc giống Paragonimus đã được mô tả [1], trong số đó có 7
loài gây bệnh cho người: bao gồm 2 loài gây bệnh ở châu Mỹ, 2 loài ở châu Phi và 3 loài
ở châu Á [1, 2]. Tại châu Á, loài P. heterotremus gây bệnh cho người ở khu vực Nam Á
(Ấn Độ và Sri Lanka), Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Việt Nam) và 3 tỉnh phía Nam
Trung Quốc; loài P. westermani gây bệnh ở các nước Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc,
Trung Quốc, Đài Loan) và Philippines; ngoài ra loài P. skrjabini gây bệnh cho người tại
Nhật Bản và Trung Quốc [1].
Ở Việt Nam, SLP và bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu trong hơn 20 năm qua
ở các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ [3-24]. Cho đến nay, 7 loài SLP đã được phát hiện,
bao gồm P. heterotremus, P. bangkokensis, P. proliferus, P. vietnamensis,
P. westermani, P. skrjabini và P. harinasutai [22]. Trong số đó gồm cả 3 loài có khả
năng gây bệnh cho người tại châu Á là P. heterotemus, P. westermani và P. skrjabini.
Tuy nhiên, loài P. skrjabini hiếm gặp, mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa với tỷ lệ
nhiễm thấp; loài P. heterotremus phân bố phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và loài
P. westermani phổ biến ở các tỉnh Bắc Trung Bộ với tỷ lệ nhiễm metacercaria ở cua suối
rất cao [22]. Vì vậy, hai loài P. heterotremus và P. westermani cần được quan tâm nghiên
cứu.
Loài P. heterotremus đã được nghiên cứu về dịch tễ, bệnh học và vòng đời phát
triển [3-14], loài P. westermani mới chỉ dừng ở mức độ phát hiện metacercaria ở cua suối
tại Bắc Trung Bộ (19). Nhiều vấn đề về hai loài SLP này chưa được nghiên cứu: loài
P. heterotremus có phân bố ở miền Trung và P. westermani có phân bố ở miền Bắc hay
không? Tính đa dạng về hình thái metacercaria, đa dạng di truyền phân tử và đặc điểm

14. 2
sinh học (như sức sống của metacercaria, vật chủ tự nhiên, vai trò vật chủ chứa trong
vòng đời phát triển…). Hơn nữa, các ca bệnh SLP vẫn được phát hiện [20]. Bệnh SLP
chủ yếu xuất hiện ở các tỉnh miền núi, vì vậy việc nghiên cứu kỹ thuật chẩn đoán nhanh
bệnh SLP tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng là
cần thiết. Từ các cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Sán lá phổi
Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử,
sinh học và chẩn đoán miễn dịch”.
Mục tiêu chung của đề tài:
Hiểu biết về hai loài SLP P. heterotremus và P. westermani, cung cấp cơ sở khoa
học cho việc chẩn đoán và phòng trị bệnh SLP, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Mục tiêu cụ thể:
1. Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu metacercaria và xác
định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái,
Quảng Trị.
2. Xác định được sự đa dạng hình thái metacercaria và đa dạng di truyền phân tử của hai
loài P. heterotremus và P. westermani.
3. Xác định được một số đặc điểm sinh học của hai loài P. heterotremus và
P. westermani.
4. Thiết lập được phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP tại thực địa, giúp điều
trị bệnh kịp thời, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Nội dung nghiên cứu: Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung
nghiên cứu sau:
1. Nghiên cứu phương pháp xét nghiệm cua suối để thu metacercaria và xác định tình
hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị.
2. Nghiên cứu tính đa dạng hình thái metacercaria và đa dạng di truyền phân tử của hai
loài SLP P. heterotremus và P. westermani.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học hai loài P. heterotremus và P. westermani, gồm:
- Xác định vật chủ trung gian thứ nhất và vật chủ chính ngoài tự nhiên.
- Xác định sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chính và vai trò vật chủ chứa trong
vòng đời phát triển của P. heterotremus và P. westermani.
- Nghiên cứu sức sống của metacercaria.

15. 3
4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP.
- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh
SLP.
- Xác định nồng độ kháng nguyên của phản ứng.
- Xác định thời gian phản ứng ở các điều kiện nhiệt độ 37o
C, 20o
C, 10o
C và 4o
C,
tương ứng với nhiệt độ các mùa trong năm ở miền Bắc.

16. 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái quát chung về sán lá phổi
1.1.1. Lịch sử phát hiện, hình thái, cấu tạo và phân loại sán lá phổi
Trường hợp nhiễm SLP của động vật có vú đầu tiên trên thế giới được phát hiện bởi
Diesing từ một con rái cá (Pteronura brasiliensis) ở Brazin năm 1828. Hai mươi năm
sau, ông đã đặt tên cho loài ký sinh là Distomum rude. Năm 1878, Ker ert mô tả một loài
SLP từ phổi của con hổ đã chết tại vườn bách thú Amsterdam với tên là Distoma
westermani. Năm 1899, Braun đã thành lập giống Paragonimus gồm các loài ký sinh ở
phổi, với loài chuẩn là P. westermani. Giống sán lá phổi an đầu được đặt trong họ
Fasciolidae, sau đó được chuyển sang họ Troglotrematidae. Năm 1939, Dollfus thành lập
họ Paragonimidae chỉ gồm một giống Paragonimus [1].
Phân loại truyền thống của các loài SLP dựa vào đặc điểm hình thái của sán trưởng
thành và metacercaria (giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ hai), nhưng ít khi dựa
vào trứng và cercaria (giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ nhất).
1.1.1.1. Sá trưởng thành
SLP trưởng thành có hình hạt cà phê (hình 1.1). Cơ thể dài 7-15 mm, rộng 3-8 mm
và dày 3-5 mm. Các đặc điểm hình thái quan trọng được sử dụng trong phân loại SLP bao
gồm: hình dạng cơ thể, tỷ lệ chiều dài/rộng cơ thể, kích thước và tỷ lệ của giác
miệng/giác bụng, mức độ phân nhánh của tinh hoàn và buồng trứng, gai cơ thể [25].
Hình 1.1. Hình dạng chung của sán lá phổi Paragonimus [25]

17. 5
Tỷ lệ chiều dài/rộng cơ thể khác nhau giữa các loài SLP. Một số loài (như
P. skrjabini, P. proliferus và P. amazonicus) có dạng thon dài, các loài khác có chiều
rộng gần b ng chiều dài cơ thể.
Kích thước của giác miệng và giác bụng, cũng như tỷ lệ của chúng đã được sử
dụng để phân biệt các loài SLP. Loài P. heterotremus có giác miệng lớn gấp đôi giác
bụng, nhưng ở những loài khác kích thước giác miệng và giác bụng gần như ng nhau,
trong khi loài P. proliferus có giác bụng hơi lớn hơn giác miệng.
Buồng trứng và tinh hoàn của P. westermani điển hình có 5-6 thùy, trong khi các
loài khác phân chia thành nhiều nhánh. Tinh hoàn có kích thước lớn ở P. macrorchis,
nhưng tương đối nhỏ ở P. harinasutai và P. amazonicus.
Ở hầu hết các loài SLP, gai trên bề mặt cơ thể xếp đơn lẻ, nhưng một số loài (như
P. ohirai, P. bangkokensis, P. compactus, P. proliferus và P. siamensis) có gai xếp thành
nhóm [25].
1.1.1.2. Metacercaria
Metacercaria là giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở vật chủ trung gian thứ hai. Đặc
điểm đặc trưng của metacercaria SLP là ruột uốn lượn và túi bài tiết lớn chứa đầy hạt
glycogen (hình 1.2). Các đặc điểm hình dạng, kích thước metacercaria và độ dày lớp vỏ
được sử dụng để phân biệt giữa các loài [1, 25]. Metacercaria của hầu hết các loài đều có
một hoặc hai lớp vỏ có độ dày khác nhau, nhưng số ít loài như P. mexicanus và
P. proliferus không có vỏ nang. Metacercaria của P. westermani có nhiều lớp vỏ hơn các
loài khác.
Hình 1.2. Hình dạng chung của metacercaria sán lá phổi Paragonimus [25]

18. 6
Về kích thước, metacercaria của SLP được chia thành 3 nhóm: nhóm có kích
thước lớn (như P. vietnamensis, P. harinasutai…), nhóm có kích thước trung bình
(P. westermani, P. bangkokensis…) và nhóm có kích thước nhỏ (P. heterotremus). Tuy
nhiên, hình thái và kích thước metacercaria của cùng một loài SLP dao động đáng kể,
điển hình là sự đa dạng của loài P. westermani [1, 25]. Trái lại, metacercaria của một số
loài SLP lại giống nhau về hình dạng và kích thước; ví dụ sự giống nhau giữa
metacercaria của loài P. vietnamensis và P. harinasutai; giữa loài P. westermani và
P. skrjabini đã được ghi nhận [22]. Trong những trường hợp này, các đặc điểm hình thái
của metacercaria thoát khỏi nang có ích trong việc phân biệt giữa các loài SLP [1, 22,
25].
1.1.1.3. Cercaria
Cercaria là giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ nhất. Cercaria của các loài SLP
thuộc nhóm Microcercaria, với đặc trưng có stylet ở phần đầu và đuôi ngắn (hình 1.3)
[25]. Cercaria của các loài trong giống SLP rất giống nhau về hình thái và kích thước,
nên khó có thể phân biệt chúng ở cấp độ loài. Hiện nay chưa có nhiều số liệu về ấu trùng
cercaria của các loài SLP [1].
Hình 1.3. Hình dạng chung cercaria của sán lá phổi Paragonimus [25]

19. 7
1.1.1.4. Trứng
Trứng SLP có hình dạng không đối xứng, một đầu to và một đầu nhỏ, đầu to có
nắp (hình 1.4). Mặc dù có sự khác nhau về kích thước trứng giữa các loài, nhưng rất khó
để phân biệt trứng giữa các loài SLP b ng hình thái [1, 25]. Hiện nay, trứng SLP được
định loại đến loài b ng kỹ thuật phân tử [22].
Hình 1.4. Hình dạng trứng sán lá phổi Paragonimus [25]
1.1.1.5. Phân loại sán lá phổi
Đến nay hơn 50 loài sán lá phổi thuộc giống Paragonimus đã được mô tả, phần
lớn các loài phân bố ở châu Á [1]. Phân loại truyền thống chủ yếu dựa vào đặc điểm hình
thái sán của trưởng thành và metacercaria. Tuy nhiên, các đặc điểm hình thái để phân biệt
các loài SLP tương đối ít so với số lượng lớn loài trong giống Paragonimus, vì vậy đôi
khi gặp khó khăn trong việc phân biệt giữa những loài có quan hệ gần [26].
Sự ra đời của phân loại phân tử đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu ở mức độ phân tử
của giống Paragonimus. Các trình tự Deoxyribonucleic acid (DNA) của hệ gen nhân
(bao gồm các gen và các đoạn chèn) và hệ gen ty thể từ lâu đã được sử dụng để nghiên
cứu mối quan hệ phân tử và phân loại giun sán. Đối với sán lá phổi, trình tự đoạn chèn
thứ hai the second internal transcribed spacer (ITS2) của hệ gen nhân là chỉ thị tốt để
phân biệt giữa các loài và trình tự gen Cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của hệ gen
ty thể là chỉ thị hữu ích để nghiên cứu các quần thể trong loài [27]. Hiện nay có hàng
trăm trình tự CO1 và ITS2 của các loài SLP trên GenBank và một số ít trình tự NADH
dehydrogenase subunit 1 (nad1) và 28S [29]. Ngoài ra, trình tự 16S rDNA có ý nghĩa
trong việc nghiên cứu các quần thể trong loài, cũng như phân iệt dạng lưỡng bội (2n) và
tam bội (3n) của loài P. westermani, chúng khác nhau ở 2 vị trí nucleotide [28].

20. 8
Phân loại SLP gặp phải một số khó khăn do sự đa dạng giữa các quần thể của cùng
một loài về hình thái metacercaria, di truyền, sinh học và khả năng gây bệnh [1]. Phân
tích phân tử đã khẳng định một số loài là đồng danh của các loài khác. Ví dụ,
P. iloktuenensis và P. sadoensis là đồng danh của P. ohirai; loài P. hokuoensis và
P. microrchis là đồng danh của P. proliferus và P. harinasutai, tương ứng. Một số loài
khác trở thành phân loài, như P. miyazakii được xếp là phân loài P. skrjabini miyazakii.
Phân tích phân tử dựa trên trình tự gen ty thể hoặc gen nhân đánh giá được sự đa
dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu, nhưng đôi khi không chỉ ra ranh giới phân biệt
giữa các loài. Sự khó khăn này dẫn đến việc sử dụng thuật ngữ "loài phức" (complex
species) để chỉ một nhánh bao gồm các loài bí ẩn (cryptic species), loài đa hình và các
taxon đang trong quá trình hình thành loài [29]. Phân tích tiến hóa phân tử của các loài
SLP ở châu Á cho thấy ngoài 2 loài P. vietnamensis và P. macrorchis làm thành các
nhánh riêng biệt, các loài khác làm thành 4 loài phức, bao gồm P. westermani, P. ohirai,
P. skrjabini và P. heterotremus [27]. Vì vậy, kết hợp định loại hình thái với phân tích
phân tử, đặc biệt là trình tự CO1 và ITS2, cho kết quả định loài SLP chính xác và thường
được sử dụng trong các công bố gần đây [27, 29].
1.1.2. Vòng đời phát triển của sán lá phổi
Các loài sán lá phổi có vòng đời phát triển phức tạp, cần trải qua 3-4 vật chủ, bao
gồm vật chủ chính, vật chủ trung gian thứ nhất, vật chủ trung gian thứ hai và vật chủ
chứa. Hình 1.1 thể hiện vòng đời phát triển của P. westermani.
Hình 1.5. Vòng đời phát triển của loài Paragonimus westermani [30]

21. 9
1.1.2.1. Vật chủ chính
Một số loài thú ăn thịt, đặc biệt là chó và mèo, là vật chủ chính của SLP [1]. Vật
chủ bị nhiễm bệnh do ăn phải vật chủ trung gian 2 bị nhiễm mầm bệnh (metacercaria)
hoặc vật chủ chứa. Thời gian phát triển đến sán trưởng thành ký sinh ở phổi tùy thuộc
vào loài sán lá phổi và loài vật chủ, có thể từ 30 ngày đến hơn 4 tháng [25]. Tính thích
nghi với vật chủ khác biệt giữa các loài SLP, thậm chí giữa các quần thể thuộc cùng một
loài, thấy rõ nhất là ở nhóm loài P. westermani. Người bị nhiễm 7 loài SLP. Trong vật
chủ cuối cùng, SLP trưởng thành thường sống thành cặp tạo thành ổ apxe ở phổi vật chủ.
Tuy nhiên, cũng có thể tìm thấy sán không cặp đôi của P. westermani [1, 25].
Theo phương pháp truyền thống, việc xác định vật chủ chính của giun sán nói
chung và SLP nói riêng là dựa vào hình thái. Vật chủ được định tên loài, sau đó mổ khám
để thu sán lá trưởng thành, định tên loài sán thu được, từ đó xác định vật chủ tự nhiên của
loài SLP. Tuy nhiên, hiện nay việc mổ khám vật chủ để thu sán trưởng thành rất khó thực
hiện, đặc biệt là đối với động vật hoang. Với sự tiến bộ của khoa học, kỹ thuật phân tử đã
được sử dụng để định loài sán dây Echinococcus multilocularis và vật chủ của nó từ mẫu
phân động vật hoang [31]. Mẫu phân động vật chia làm hai phần: một phần được xét
nghiệm để thu trứng sán, mẫu trứng này được định loài b ng kỹ thuật phân tử dựa trên
trình tự ITS2, phần mẫu phân còn lại được phân tích phân tử để xác định loài vật chủ. Cơ
sở khoa học của phương pháp này là mẫu phân của động vật chứa các tế bào niêm mạc
ruột bị bong tróc, vì vậy có thể dùng các bộ sinh phẩm để tách chiết DNA từ mẫu phân
động vật, từ đó dùng kỹ thuật PCR để nhân bản trình tự đích, thường là vùng Dloop của
hệ gen ty thể với cặp mồi thích hợp, sau đó đọc trình tự gen, phân tích so sánh để xác
định loài vật chủ [31]. Đây là cơ sở để áp dụng kỹ thuật này trong việc xác định vật chủ
chính của SLP ngoài tự nhiên thông qua thu thập mẫu phân động vật ăn thịt hoang dã,
mặc dù ở thực địa không biết mẫu phân đó của loài động vật nào.
1.1.2.2. Vật chủ trung gian thứ nhất
Cũng như các loài sán lá khác, vật chủ trung gian thứ nhất của SLP là các loài ốc
nước ngọt. Miracidium nở ra từ trứng SLP ơi trong nước, tìm vật chủ ốc thích hợp để
xâm nhập. Trong cơ thể vật chủ ốc, ấu trùng SLP phát triển qua các giai đoạn sporocyst,
redia và cercariae. Thời gian phát triển đến cercaria trưởng thành thoát khỏi ốc tùy thuộc
vào nhiệt độ, có thể từ 3-5 tháng [1].

22. 10
Số liệu về vật chủ trung gian thứ nhất của các loài SLP còn rất hạn chế, có thể vì
tỷ lệ nhiễm ấu trùng cercaria SLP ở vật chủ trung gian ốc tương đối thấp, thường dưới
1% [14, 32-34].
Xác định vật chủ ốc của SLP thường dựa vào hình thái của ấu trùng cercaria và
hình thái của vật chủ ốc. Cercaria của SLP thuộc nhóm microcercaria đặc trưng ởi đuôi
ngắn và stylet ở phần đầu. Định loại vật chủ ốc dựa vào hình thái cũng gặp khó khăn vì
số lượng loài trong một giống thường rất lớn, dễ dẫn đến nhầm lẫn [35, 36], vì vậy giám
định loài ở mức độ phân tử là cần thiết. Đối với vật chủ ốc, trình tự gen CO1 thường
được sử dụng để định loài [35, 36]. Vì vậy, để xác định chính xác vật chủ ốc của SLP,
cần kết hợp phương pháp định loại hình thái và phân tử để xác định loài cả ấu trùng SLP
và vật chủ ốc của chúng.
1.1.2.3. Vật chủ trung gian thứ hai
Trái với hiểu biết còn hạn chế về vật chủ trung gian thứ nhất, vật chủ trung gian
thứ hai của hầu hết các loài SLP đã được công bố. Vật chủ trung gian thứ hai là một số
loài tôm và cua nước ngọt, thường là cua suối thuộc họ Potamidae [1]. Một loài cua có
thể bị nhiễm nhiều hơn một loài SLP, thậm chí 4 hoặc 5 loài [22, 37, 38], cho thấy tính
thích nghi vật chủ thấp.
Hai con đường nhiễm ấu trùng cercaria sang cua là: cua ăn ốc nhiễm cercaria hoặc
cercaria xâm nhập qua bề mặt cơ thể của cua. Sự phân bố của metacercaria trong cơ thể
cua có thể tùy vào từng loài sán lá hoặc tùy vào từng loài cua [39], nhưng thường thấy ở
cơ, mang và gạch cua [1].
1.1.2.4. Vật chủ chứa (Paratenic host)
Vật chủ chứa bị nhiễm SLP do ăn phải metacercaria ở VCTG2. Trong cơ thể vật
chủ chứa, ấu trùng SLP không phát triển đến trưởng thành ở phổi, mà tồn tại dưới dạng
sán non ở cơ hoặc nội tạng [1]. Thời gian cần ở vật chủ chứa từ 1-40 ngày để có thể
nhiễm cho vật chủ chính [1]. Vật chủ chứa được xác định là nguồn lây nhiễm chính sang
các động vật ăn thịt lớn, vì các loài động vật này có thể không ăn cua suối [40]. Trong thí
nghiệm, động vật gặm nhấm và một số loài chim (gà, vịt và ngỗng) được xác định là vật
chủ chứa của SLP [1]. Ngoài tự nhiên, lợn rừng và hươu được xác định là vật chủ chứa
truyền bệnh SLP cho con người ở Nhật Bản [41, 42].

23. 11
1.1.3. Dịch tễ học bệnh sán lá phổi
Các loài thuộc giống SLP phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Mặc dù
vật chủ chính chủ yếu là động vật ăn thịt, bao gồm cả động vật hoang dã và động vật
nuôi, nhưng có ít dữ liệu về tỷ lệ nhiễm SLP ở động vật. Mối quan tâm lớn nhất là bệnh
SLP trên người. Bệnh SLP thường ở các vùng cục bộ ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ
[29].
Ở châu Phi, các ca bệnh chủ yếu xuất hiện ở Cameroon, Bờ Biển Ngà và Nigeria.
Bệnh nhân bị nhiễm các loài P. uterobilateralis và P. africanus.
Ở Bắc Mỹ, P. kellicotti là loài duy nhất nhiễm ở người, trong khi ở Trung và Nam
Mỹ là loài P. mexicanus.
Ở châu Á, các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan đã từng được
coi là các khu vực nhiễm bệnh cao nhất, nhưng tỷ lệ mắc bệnh ở Nhật Bản, Hàn Quốc và
Đài Loan đã giảm mạnh từ những năm 1980. Tuy nhiên, gần đây sự tái xuất hiện bệnh đã
được báo cáo ở Nhật Bản [30]. Ngoài ra, các ổ bệnh mới được phát hiện ở Đông Bắc Ấn
Độ, miền Bắc Việt Nam và Lào [12, 37, 43, 44].
Các tác nhân gây bệnh SLP cho người ở châu Á là P. heterotremus,
P. westermani và P. skrjabini (bao gồm cả phân loài P. skrjabini miyazaki). Loài
P. heterotremus gây bệnh cho người ở một số nước Nam Á, Đông Nam Á và 3 tỉnh phía
Nam của Trung Quốc [1]. Loài P. westermani phân bố rộng ở châu Á, tuy nhiên, các ca
bệnh trên người do loài này chỉ gặp ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và
Philippines [1]. Các báo cáo về bệnh SLP do P. westermani gây ra ở những nơi khác có
thể do nhầm lẫn, vì thường mặc định r ng bệnh SLP ở châu Á do loài P. westermani gây
nên. Ví dụ ở Ấn Độ, loài P. westermani được phát hiện lần đầu bởi Kerbert từ phổi của
một con hổ và sau đó được tìm thấy trong nhiều động vật hoang dã và vật nuôi khác. Vì
vậy, trước đây cứ phát hiện trứng SLP trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân thì được
xác định là loài P. westermani [45, 46]. Sau đó, kỹ thuật phân tử được sử dụng đã xác
định trứng trong các mẫu đờm của nhiều bệnh nhân ở Ấn Độ thuộc loài P. heterotremus
[47]. Do đó, các áo cáo trước đây cho r ng P. westermani là tác nhân gây bệnh trên
người là không chính xác. Gần đây, duy nhất một bệnh nhân nhiễm sán lá phổi ở Ấn Độ
đã được xác định nhiễm loài P. westermani dựa trên phân tích phân tử mẫu trứng thu từ

24. 12
đờm của bệnh nhân [48]. Tuy nhiên, cần xác định nguồn gốc bệnh nhân này bị nhiễm
SLP ở đâu, ị nhiễm ở Ấn Độ hay ở vùng nào khác khi đi du lịch.
Ngoài ra, loài P. skrjabini được tìm thấy ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Thái
Lan và Việt Nam, nhưng các ca ệnh trên người do loài này mới chỉ được báo cáo ở Nhật
Bản và Trung Quốc, mà không có ở Thái Lan và Việt Nam [1].
Nhiễm bệnh SLP ở người có liên quan chặt chẽ đến thói quen ăn uống. Rất nhiều
món ăn địa phương từ cua hoặc tôm chưa được nấu chín. Nhiễm bệnh cũng có thể xảy ra
trong quá trình chế biến thực phẩm [26]. Tập quán sử dụng cua và tôm để chữa bệnh sởi
ở Hàn Quốc và Lào cũng có thể dẫn đến nhiễm SLP. Ngoài ra, ăn thịt vật chủ chứa cũng
là nguyên nhân nhiễm bệnh tại Nhật Bản, nơi người dân có tập quán ăn thịt động vật sống
[41].
Tỷ lệ nhiễm SLP có liên quan đến tuổi và giới tính. Ở một số vùng, tỷ lệ nhiễm
cao nhất được phát hiện ở trẻ em tại Ấn Độ [47], Trung Quốc [49], Việt Nam [12]. Về
giới tính, tỷ lệ nhiễm ở nam giới nói chung cao hơn ở nữ giới. Lý do có thể là vì nam giới
thường đánh bắt và ăn cua sống nhiều hơn nữ [26]. Tại Mỹ, các ca mắc SLP do nhiễm
loài P. kellicotti chủ yếu được phát hiện ở những người đàn ông đi cắm trại, những người
này thường bắt tôm và ăn sống [50].
Thay đổi thói quen ăn uống cũng ảnh hưởng tới đặc điểm dịch tễ học của bệnh
SLP. Tại Nhật Bản trong những năm 1950, tỷ lệ nhiễm cao nhất thấy ở trẻ em, gần đây
các bệnh nhân SLP chủ yếu là nam giới trung niên [51]. Điều này lý giải là vì đàn ông
Nhật Bản thích ăn thịt lợn rừng sống, các ca này chiếm tới 70% số ca nhiễm bệnh ở Nhật
Bản. Ở Thái Lan và Nigeria, những người trẻ đã dần bỏ tập quán ăn cua sống, do đó, hầu
hết các bệnh nhân SLP thuộc nhóm trung niên [26]. Ở Trung Quốc, một khảo sát gần đây
đã phát hiện tỷ lệ nhiễm SLP cao nhất tại các thành phố lớn của Thượng Hải và Trùng
Khánh [52]. Nguyên nhân là do người thành phố muốn ăn cua nhập từ các vùng nông
thôn. Cua nhiễm metacercaria từ Nhật Bản cũng có thể được xuất khẩu sang các nhà hàng
Nhật Bản ở Mỹ, vì vậy người dân ở đây ăn cua chưa nấu chín cũng có thể bị nhiễm SLP
[53, 54]. Ở Cameroon, số lượng ca mắc SLP đã giảm ở người lớn, nhưng tỷ lệ nhiễm ở
trẻ em dưới 10 tuổi vẫn còn cao [55].

25. 13
Tỷ lệ nhiễm SLP ở nhiều nơi đã giảm, nhưng ở một số vùng bệnh vẫn còn tỷ lệ
nhiễm cao và các ổ bệnh mới vẫn được phát hiện. Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc và
Thái Lan đã thành công trong việc giảm tỷ lệ nhiễm bệnh thông qua các chiến dịch chẩn
đoán đại trà, sau đó là hóa trị liệu và giáo dục phòng chống bệnh SLP. Trung Quốc cũng
có một chương trình kiểm soát quốc gia, nhưng ệnh vẫn còn hiện diện ở nhiều khu vực,
thậm chí tỷ lệ mắc gia tăng ở một số nơi [56, 57]. Ở Nigeria, bệnh SLP là một vấn đề lớn
trong giai đoạn chiến tranh (1967-1970), sau đó gần như biến mất khỏi nhiều khu vực.
Tuy nhiên, các khảo sát gần đây cho thấy tỷ lệ nhiễm ở đất nước này tương đối cao [58].
Các vùng bệnh mới đã được tìm thấy ở Ấn Độ [42, 43, 59], Việt Nam [22] và Lào [37,
60]. Điều này gợi ý r ng bệnh SLP có thể hiện diện ở nhiều nơi khác chưa được phát
hiện.
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và tổn thương bệnh sán lá phổi
Sán lá phổi thường ký sinh thành từng đôi ở phổi tạo thành các ổ áp xe ở nhu mô
phổi giống như các hang lao. Nếu bị nhiễm nặng, bệnh nhân có triệu chứng nghiêm
trọng, như vỡ ổ áp xe gây tràn khí và tràn dịch màng phổi, giãn phế quản, viêm phổi, kèm
theo là đau ngực và ho ra máu, khạc ra đờm sền sệt và có màu nâu đỏ. Sán lá phổi có thể
gây tử vong cho người do suy nhược cơ thể và những cơn ho ra máu.
Nếu bị nhiễm nhẹ thì bệnh nhân thể hiện các triệu chứng mãn tính như ho, có đờm,
đau ngực và khó thở khi gắng sức là những dấu hiệu chính của bệnh. Khi nghe phổi thấy
tiếng ral mạnh. Bác sĩ có thể không nghĩ đến bệnh SLP khi thấy bệnh nhân có những
triệu chứng này [2].
Cũng như các ệnh giun sán khác, đặc điểm cận lâm sàng của nhiễm SLP là sự
tăng bạch cầu ái toan máu ngoại vi, sự thâm nhiễm bạch cầu ái toan trong màng phổi
hoặc mô phổi. Tuy nhiên, ngay cả trong các trường hợp đó, ác sĩ thường chẩn đoán là
viêm phổi dị ứng hoặc bệnh viêm phổi vô căn mãn tính [2].
Một số trường hợp SLP có thể ký sinh lạc chỗ ở não, cũng có khi ở tủy sống, cơ
ngực, hoặc tổ chức dưới da, gây nên các triệu chứng tại chỗ và toàn thân phức tạp, vì vậy
thường rất khó khăn trong chẩn đoán, thậm chí nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân [2].
Tổ thươ g bệnh học: Ấu trùng SLP sau khi được nuốt vào ruột vật chủ sẽ xuyên
qua thành ruột non vào xoang bụng, gây nên những điểm xuất huyết rải rác trên niêm

26. 14
mạc ruột, sau đó ấu trùng xuyên qua một số tổ chức trong xoang bụng, gây tổn thương và
xuất huyết ở nhu mô gan trước khi đến phổi.
Ở phổi, sán sống từng đôi tạo thành các ổ apxe với kích thước khác nhau (1-4 cm).
Trong ổ apxe chứa chất dịch đỏ, tổ chức phổi xung quanh bị viêm, xuất huyết và tăng
sinh.
1.1.5. Chẩn đoán bệnh sán lá phổi
Chẩn đoán bệnh SLP đôi khi gặp phải khó khăn vì các triệu chứng của bệnh SLP
thường không rõ ràng [2, 30]. Ngoài ra, chẩn đoán nhầm với bệnh lao phổi và ung thư
phổi rất dễ gặp vì có sự giống nhau về lâm sàng và chồng chéo về dịch tễ học. Các
phương pháp chẩn đoán bệnh SLP bao gồm bốn nhóm: ký sinh trùng học, huyết thanh
học/miễn dịch học, chẩn đoán hình ảnh và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử.
1.1.5.1. Chẩ đoá ký si h trù g học
Phát hiện trứng SLP với đặc điểm đặc trưng có nắp ở một đầu trong phân, đờm, dịch
rửa phế quản là chẩn đoán chính xác nhất. Sự phát hiện trứng trong đờm hoặc phân có thể
được thực hiện b ng kỹ thuật Kato-Katz hoặc lắng cặn. Tuy nhiên, trứng SLP không phải lúc
nào cũng phát hiện được, ngay cả ở một số bệnh nhân có sán trưởng thành trong phổi và
không bao giờ tìm thấy trứng trong giai đoạn tiền phát hoặc khi SLP ký sinh lạc chỗ [1, 2].
Tỷ lệ bệnh nhân có trứng SLP ở đờm hoặc phân chiếm khoảng 40-50% [61]. Đối với các
bệnh nhân nghi ngờ giữa nhiễm lao và nhiễm SLP, khi xét nghiệm đờm sử dụng kỹ thuật
nhuộm Ziehl – Neelsen cải tiến để nhuộm vi khuẩn lao nh m tránh phá hủy trứng SLP [62].
Để chẩn đoán bệnh SLP thể ngoài phổi, mẫu sinh thiết được nhuộm haematoxylin
và eosin. Quan sát hiển vi cho thấy một u dày, tinh thể Charcort-Leyden và các tế bào
viêm như ạch cầu ái toan, lymophocytes và bạch cầu trung tính. Sán n m ở trung tâm
của u.
1.1.5.2. Chẩ đoá h h ảnh
Các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh được sử dụng trong chẩn đoán bệnh SLP bao
gồm chụp x-quang ngực thông thường, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ và siêu
âm.

27. 15
Chụp x-quang ngực đã được sử dụng để chẩn đoán bệnh SLP và thường được kết
hợp với chụp cắt lớp vi tính để quan sát chi tiết hơn. Các quan sát phổ biến khi mới
nhiễm sán phổi bao gồm tràn khí ngực, tràn dịch màng phổi, sự mờ đục. Trong các ca
bệnh đã nhiễm lâu có thể thấy các tổn thương nang và nốt có đường kính nhỏ hơn 3-4 cm
và giãn phế quản. Các nang có dạng vòng tròn, ở một số ca bệnh có thể phát hiện sán ở
bên trong. Xung quanh các nang sán có thể thấy hiện tượng dày hóa màng phổi [63].
Những phát hiện này thường giống với bệnh lao phổi, ngoại trừ hiện tượng mờ đục gây ra
bởi sự di chuyển của sán là không thấy trong bệnh lao.
Trên phim chụp cắt lớp vi tính vùng ngực thấy các tổn thương dạng nang tròn
giảm bắt màu chứa đầy dịch. Sự mờ đục là dấu hiệu gợi tới đường di chuyển của sán.
Chụp cắt lớp vi tính có thể giúp phát hiện một loạt các trường hợp mắc bệnh SLP ở gan
và ổ bụng, đồng thời cung cấp thêm thông tin về nang sán và đường di chuyển, tuy nhiên,
kết quả có thể khác nhau tùy vào giai đoạn nhiễm [26].
Chụp cắt lớp và cộng hưởng từ có giá trị trong chẩn đoán nhiễm SLP ở não. Phát
hiện phổ biến nhất ở các ca mới bị bệnh SLP ở não là tổn thương dạng vòng (giống chùm
nho) đường kính khoảng 1–3 cm có phù nề xung quanh ở một bán cầu não. Ngoài ra,
phát hiện thấy sự tụ máu não và các vùng không có ranh giới rõ ràng. Khi bị nhiễm thời
gian dài thường quan sát thấy các tổn thương dạng u hạt can-xi hóa. Trong bệnh SLP ở
não mãn tính, sự can-xi hóa của các cấu trúc giống bong bóng xà phòng được quan sát
thấy trong ảnh x-quang hộp sọ. Chụp cộng hưởng từ cũng được sử dụng để chụp ảnh các
thương tổn của bệnh SLP ở cột sống [26].
1.1.5.3. Chẩ đoá miễn dịch
Kỹ thuật chẩn đoán miễn dịch để phát hiện kháng thể đã được sử dụng từ lâu để
chẩn đoán ệnh SLP [64], bao gồm các kỹ thuật xét nghiệm tiêm nội bì, xét nghiệm hấp
thụ miễn dịch liên kết enzyme ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), ELISA
điểm trên giấy (dot-ELISA).
Xét nghiệm tiêm nội bì: Đây là kỹ thuật miễn dịch được sử dụng sớm nhất. Tiêm
1 µg dịch chiết của sán đã khử lipid vào cánh tay, nếu thấy vết an đỏ xuất hiện sau 15
phút thì kết quả dương tính. Xét nghiệm này đơn giản, không tốn kém và khá nhạy,
nhưng độ đặc hiệu thấp (đôi khi thấp hơn 20%) vì các phản ứng chéo với các bệnh khác,
đặc biệt nếu kháng nguyên không tinh khiết; hoặc sự tồn tại lâu dài của kháng thể sau khi

28. 16
điều trị. Vì vậy, kỹ thuật xét nghiệm này hiện nay chỉ được sử dụng trong khảo sát thực
địa và sàng lọc bệnh nhân, chứ không dùng để chẩn đoán riêng rẽ từng bệnh nhân.
Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA):
Nhiều kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme đã được mô tả [2].
ELISA gián tiếp là một trong những kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện
kháng thể kháng SLP. Nhiều chế phẩm kháng nguyên đã được sử dụng để phát hiện
kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. Các chế phẩm này bao gồm các chiết xuất kháng
nguyên thô của sán trưởng thành, sán non, các sản phẩm tiết, các peptide tái tổ hợp và các
kháng nguyên tinh khiết hoặc bán tinh khiết gồm các protease cysteine hoặc các chiết
xuất từ trứng SLP [26]. Độ đặc hiệu của các kháng nguyên chất tiết cao hơn so với các
kháng nguyên thân (100% so với 91.3%). Một số protease cysteine của P. westermani từ
dịch chiết của sán trưởng thành đã được sử dụng trong xét nghiệm miễn dịch, chẳng hạn
như protease cysteine giống cruzipain (Pw28CCP). Gần đây, một peptide tổng hợp đã
được áp dụng để phát hiện kháng thể IgG4 [26].
Kỹ thuật ELISA điểm trên giấy gọi là dot-ELISA được sử dụng tại Nhật Bản, Thái
Lan, Trung Quốc để sàng lọc và chẩn đoán phân iệt với ký sinh trùng khác. Nguyên lý
của phản ứng dot-ELISA là ELISA gián tiếp thực hiện trên giấy, không phải trên đĩa
nhựa như ELISA thông thường. Trong kỹ thuật này, kháng nguyên được nhỏ vào các ô
riêng biệt trên giấy nitrocellulose, để khô, sau đó nhúng ( locking) vào dung dịch casein
1% trong 30 phút, lấy ra để khô và bảo quản ở 4o
C. Khi xét nghiệm, thực hiện theo các
ước tương tự như trong ELISA trên đĩa nhựa [65]. Nhưng đánh giá kết quả b ng mắt
thường, không cần máy đọc quang phổ. Dựa vào các ô có hiện màu hay không, màu đậm
hay nhạt ở các ô nhỏ kháng nguyên đã iết để đánh giả kết quả. Kỹ thuật này có ưu điểm
là dễ thực hiện tại thực địa, không cần máy đọc quang phổ.
Tương tự, kỹ thuật điện di trên gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate -
Polyacrylamide gel electrophoresis) được sử dụng để sàng lọc nhiều ký sinh trùng, các
ăng kháng nguyên tách từ gel được nhỏ vào các đĩa và sàng lọc như với ELISA [66].
Trong trường hợp này, một ăng kích thước 35-kDa là kháng nguyên mục tiêu của bệnh
SLP.
Gần đây Qiu et al. (2016) [67] phát triển một kỹ thuật ELISA nh m phát hiện
IgG4 đặc hiệu kháng nguyên SLP trong mẫu nước tiểu. Nghiên cứu cho thấy xét nghiệm

29. 17
có độ nhạy và đặc hiệu cao. Vì thu thập mẫu nước tiểu dễ dàng và an toàn nên xét nghiệm
này là hữu ích trong sàng lọc số lượng mẫu lớn khi điều tra đại trà. Những người có mẫu
nước tiểu dương tính sẽ được thực hiện các xét nghiệm khác, như xét nghiệm bạch cầu ái
toan, chẩn đoán hình ảnh để xác định tình trạng nhiễm bệnh.
1.1.5.4. Chẩ đoá phâ tử
Chẩn đoán phân tử b ng cách khuếch đại trình tự deoxyribonucleic acid (DNA)
của ký sinh trùng đã được sử dụng để chẩn đoán ệnh SLP. Trứng trong phân hoặc đờm
được phân tích phân tử để khẳng định loài SLP. Vùng chèn ITS2 của hệ gen nhân được
khuếch đại từ 3-5 trứng P. westermani [68], hoặc chỉ từ một trứng duy nhất của
P. heterotremus [20]. Trình tự ITS2 cũng được thu nhận từ một phần mô phổi đã đúc
paraffin của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm bệnh SLP do P. kellicotti [69].
Các đoạn dò (pro e) DNA đã được phát triển để chẩn đoán bệnh SLP. Kỹ thuật
này rất đặc hiệu và nhạy, có thể phát hiện khi chỉ có 5 trứng/gram phân [70].
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt (Loop mediated isothermal amplification =
LAMP) đã được sử dụng để chẩn đoán nhiễm P. westermani [71]. Kỹ thuật này sử dụng
4 đoạn mồi (primer) đặc hiệu loài có khả năng nhận biết sáu vùng DNA đích. Phản ứng
có thể được hoàn thành trong một giờ ở một nhiệt độ duy nhất 60°C và có thể quan sát
thấy kết quả của phản ứng khuếch đại ngay trên ống phản ứng [72]. Kỹ thuật LAMP
không cần các thiết bị phức tạp, nhưng có độ nhạy cao hơn so với PCR thông thường. Kỹ
thuật này cũng có thể được áp dụng để định loài SLP từ các dạng ấu trùng và trứng SLP.
1.1.6. Điều trị bệnh sán lá phổi
Hiện tại có 2 loại thuốc thường được khuyến cáo để điều trị bệnh SLP là
triclabendazole và praziquantel.
Praziquantel đã được sử dụng từ lâu trong điều trị bệnh SLP. Liều lượng khuyến
cáo là 25 mg/kg x 3 lần/ngày trong 2-3 ngày. Tỷ lệ chữa khỏi thường cao hơn 95%. Tuy
nhiên, đôi khi cần phải lặp lại quá trình điều trị, đặc biệt là khi xuất hiện tràn dịch màng
phổi. Praziquantel với liều lượng 25 mg/kg trong 14 ngày hoàn toàn có hiệu quả trong
giai đoạn đầu của bệnh SLP ở não. Việc sử dụng cùng với thuốc kháng viêm đôi khi được
khuyến cáo với bệnh SLP ở não để chống lại các chất tiết ra từ sán đang chết.
Praziquantel hiếm có tác dụng phụ và thường nhẹ, bao gồm chứng mất ngủ nhẹ và thoáng

30. 18
qua, buồn nôn, nhức đầu, chóng mặt, nôn mửa, đau ụng. Rất ít bệnh nhân thể hiện phản
ứng dị ứng sau khi sử dụng praziquantel [26].
Tricla endazole cũng hiệu quả trong việc điều trị sán lá phổi và có thể có một số
lợi thế. Chỉ cần 1 hoặc 2 liều với liều lượng thấp hơn so với praziquantel. Liều khuyến
cáo là 10 mg/kg trọng lượng, có thể được lặp lại sau 12-24 h ở các ca nhiễm nặng hoặc
20mg/kg trọng lượng cơ thể, chia làm 2 lần 10mg/kg, dùng trong cùng một ngày. Thậm
chí liều 5 mg/kg trong 3 ngày hoặc 10 mg/kg trong một ngày cũng có hiệu quả với bệnh
SLP mà không có tác dụng phụ. Triclabendazole có thể được dung nạp tốt hơn
praziquantel. Nó cũng là lựa chọn tốt hơn khi cấp thuốc cho số đông, một phần bởi vì có
thể cấp một hoặc hai liều một ngày dưới sự giám sát của ác sĩ, tránh được các vấn đề về
tuân thủ có thể phát sinh nếu bệnh nhân uống thuốc tại nhà trong vài ngày. Tuy nhiên, nó
ít hiệu quả trong các thử nghiệm quy mô nhỏ tại Philippines, Nhật Bản và Hàn Quốc
[26].
Phẫu thuật là sự can thiệp duy nhất với bệnh SLP ở não trước khi có thuốc
ithionol được sử dụng trong những năm 1960. Kể từ đó, phẫu thuật chỉ được thực hiện ở
những ca tổn thương ề mặt mà có thể tiếp cận và dễ dàng loại bỏ, đặc biệt là dưới da
hoặc trong các ca nhiễm ở màng phổi [26].
1.1.7. Phòng bệnh sán lá phổi
Để kiểm soát bệnh SLP cần tập trung vào việc giảm hoặc loại bỏ yếu tố lây truyền
bệnh. Cũng như đối với các bệnh sán truyền qua thực phẩm khác, các giải pháp bao gồm:
giảm nguồn lây nhiễm thông qua điều trị hiệu quả cho bệnh nhân và động vật nhiễm
bệnh; bảo vệ hệ thống nuôi trồng thủy sản khỏi nhiễm phân người và động vật; kiểm soát
số lượng ốc; thực hiện các chiến dịch giáo dục về bệnh để tránh ăn phải ấu trùng cảm
nhiễm từ vật chủ cua/tôm và sán non từ các vật chủ chứa.
Vì bệnh SLP là bệnh chung giữa người và động vật, có liên quan đến động vật
hoang dã và thói quen ăn uống, nên công tác kiểm soát có phần khó khăn. Tuy nhiên,
công tác phòng chống và kiểm soát đã thành công ở một số quốc gia như Nhật Bản, Hàn
Quốc và Thái Lan, b ng hóa trị liệu cho cộng đồng và các chiến dịch giáo dục. Nâng cao
nhận thức về bệnh và cách phòng chống đối với cả các chuyên gia y tế/thú y và đại chúng
là chìa khóa trong việc giảm nhiễm bệnh SLP. Sự thiếu nhận thức đã được chứng minh là

31. 19
một trong những yếu tố góp phần làm tăng số ca mắc bệnh gần đây tại Nigeria [58]. Tại
Trung Quốc, một chương trình mới đã được xây dựng ở Trùng Khánh nh m đào tạo các
nhân viên y tế về SLP [73]. Các chiến dịch nâng cao nhận thức của người dân địa phương
cũng được thực hiện gần đây ở Mỹ hướng tới những người cắm trại và đi ca-nô, những
người có thể ăn tôm trong quá trình dã ngoại [74] và ở Colom ia hướng tới các em học
sinh [75].
1.2.Tình hình nghiên cứu hai loài Paragonimus heterotremus và Paragonimus
westermani trên thế giới
1.2.1. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus
Loài P. heterotremus được mô tả lần đầu tiên vào năm 1964 ở tỉnh Quảng Tây,
Trung Quốc, sau đó phát hiện ở 3 tỉnh phía Nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam,
Quảng Châu), các nước Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Việt Nam) và Nam Á (Ấn Độ, Sri
Lanka) [1], gần đây được phát hiện ở Myanmar [76]. Đây cũng là nguyên nhân gây bệnh
SLP quan trọng cho người ở các nước này.
Đặc điểm đặc trưng của sán trưởng thành là giác miệng lớn gấp đôi giác ụng và
metacercaria hình oval hoặc tròn, kích thước khoảng 200-300 µm, nhỏ nhất so với các
loài sán lá phổi khác [77].
Vật chủ trung gian thứ nhất là ốc thuộc họ Assimineidae và Pomatiopsidae [1]. Ở
Thái Lan, vật chủ trung gian thứ nhất xác định qua gây nhiễm thực nghiệm là các chủng
của loài Oncomenalia hupensis và Tricula aperta, còn ở Trung Quốc vật chủ trung gian
thứ nhất ngoài tự nhiên và thí nghiệm là Tricula sp. chưa xác định đến loài [34].
Vật chủ trung gian thứ hai phát hiện ở Trung Quốc và Thái Lan là 6 loài cua thuộc
họ Potamidae [1]. Các nghiên cứu gần đây ở Lào và Ấn Độ, Sri Lanka công bố vật chủ
trung gian thứ hai của loài P. heterotremus là cua thuộc giống Potamiscus cũng thuộc họ
Potamidae.
Vật chủ chính ngoài tự nhiên được phát hiện ở mèo và sóc ở Thái Lan [1]. Các ca
người nhiễm loài SLP này được phát hiện chủ yếu do liên quan đến ăn cua suối. Chưa có
thông áo trường hợp người nhiễm P. heterotremus do ăn thịt vật chủ chứa. Tuy nhiên,
trong thí nghiệm đã xác định chuột đóng vai trò vật chủ chứa của loài P. heterotremus
[1].

32. 20
Gần đây, loài P. pseudoheterotremus được mô tả ở Thái Lan có đặc điểm hình thái
và phân tử gần giống với loài P. heterotremus. Metacercaria của P. pseudoheterotremus
khoảng 200 µm, được cho là hơi nhỏ hơn P. heterotremus (khoảng 200-300 µm). Phân
tích phân tử cho thấy khoảng cách di truyền giữa 2 loài là 10% dựa vào gen ty thể CO1,
nhưng chỉ khác nhau 1 nucleotid ở đoạn chèn ITS2 [78]. Tuy nhiên, khi phân tích đặc
điểm hình thái và phân tử của các quần thể P. heterotremus từ các nước khác nhau cùng
với P. peudoheterotremus cho thấy đặc điểm của P. pseudoheterotremus n m trong phạm
vi dao động của loài P. heterotremus và được coi là một quần thể địa lý của phức hợp
loài P. heterotremus [23].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani
Paragonimus westermani được mô tả năm 1878. Đây là loài phân ố rộng nhất
trong số các loài SLP và là tác nhân gây bệnh quan trọng cho người ở châu Á [1]. Sán
trưởng thành của P. westermani đặc trưng ởi tinh hoàn và buồng trứng phân thành 5-6
nhánh. Metacercaria điển hình của chúng có hình tròn hoặc cầu, đặc trưng ởi lớp vỏ dầy,
tuy nhiên metacercaria của P. westermani rất đa dạng về hình thái và kích thước [1, 25].
Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể cho thấy P. westermani chủ yếu gồm 2 dạng: lưỡng
bội (diploid 2n) và tam bội (triploid 3n). Dạng diploid phân bố rộng ở châu Á, trong khi
triploid chỉ gặp ở các nước Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc). Dạng triploid có
khả năng gây ệnh ở người mạnh hơn so với dạng diploid [1, 2]. Chúng có thể phân biệt
được b ng hình thái: ở sán trưởng thành, túi nhận tinh của dạng triploid chứa đầy tinh
trùng, trong khi túi nhận tinh của dạng diploid không chứa tinh trùng [25]. Ngoài ra,
metacercaria của dạng triploid được cho là lớn hơn so với dạng diploid [25]. Chúng cũng
có thể phân biệt với nhau qua dữ liệu phân tử dựa trên trình tự 16S rDNA, dạng lưỡng
bội và tam bội khác nhau ở 2 vị trí nucleotid [28].
Số liệu phân tử cũng cho thấy sự khác biệt lớn về di truyền giữa các quần thể từ Bắc
Á, Nam Á và Đông Nam Á. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể P. westermani thậm
chí lớn hơn sự khác biệt giữa các loài của giống sán lá phổi [27, 29, 77].
Vòng đời của P. westermani sử dụng 3-4 loài vật chủ. Vật chủ trung gian thứ nhất
khác nhau giữa các quần thể địa lý: quần thể ở Malaysia và Philippines sử dụng các loài
ốc thuộc giống Brotia, trong khi các quần thể ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài

33. 21
Loan sử dụng ốc thuộc giống Semisulcospirus. Vật chủ ốc ở các nước khác chưa được
biết [1].
Vật chủ trung gian thứ hai của loài P. westermani đã được thống kê bao gồm 8
loài tôm và 40 loài cua [1].
Vật chủ chính là nhiều loài động vật có vú, như chó, cáo, m o, m o rừng, sư tử,
hổ, báo, cầy, khỉ… Tuy nhiên, sự mẫn cảm của động vật với P. westermani cũng khác
nhau rõ rệt giữa các vùng địa lý [1]. Đáng chú ý, người bị nhiễm loài P. westermani chỉ
giới hạn ở Bắc Á và Philiipines. Tại các nước khác ở khu vực Đông Nam Á chưa phát
hiện người nhiễm P. westermani [1, 77]. Gần đây, một ca bệnh SLP do nhiễm
P. westermani được thông báo ở Ấn Độ [48].
Vật chủ chứa tự nhiên là lợn, lợn rừng và vật chủ chứa trong thí nghiệm là chuột,
chuột lang, thỏ [1]. Người và chó săn nhiễm P. westermani do ăn thịt lợn rừng đã được
thông báo ở Nhật Bản [30, 79]. Gần đây, một số bệnh nhân mắc sán lá phổi khẳng định
r ng họ không ăn cua nước ngọt hoặc lợn rừng, nhưng đã ăn thịt sống (sashimi) chế biến
b ng thịt hươu, đó là một món ăn địa phương tại Nhật Bản [80]. Điều tra nghiên cứu đã
thu được sán non P. westermani còn sống từ cơ của hươu (Cervus nippon) bắt ở tỉnh
Kagoshima, Nhật Bản [81]. Một nghiên cứu hồi quy 567 ca bệnh thấy r ng 76 người đã
ăn thịt hươu hoang dã trước khi phát bệnh [42]. Ăn thịt hươu dẫn đến nhiễm bệnh SLP ở
Nhật Bản ước tính chiếm từ 6,8% đến 20.0% tổng số bệnh nhân SLP. Rõ ràng hươu là
động vật ăn cỏ, không chủ đích ăn cua nước ngọt, có thể chúng vô tình ăn phải cua sống
trong bụi cỏ [42]. Điều này cho thấy r ng các loài động vật khác có thể đóng vai trò vật
chủ chứa cho các loài SLP. Vì vậy, để tránh nhiễm sán lá phổi thì không nên ăn thịt sống
của bất kỳ loài động vật nào trong vùng có bệnh.
1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi và bệnh sán lá phổi ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh SLP được Monzel phát hiện đầu tiên năm 1906 [82]. Những năm
sau đó, ệnh ít được quan tâm, chỉ có những công bố lẻ tẻ các trường hợp bệnh nhân điều trị
tại các bệnh viện, mà chưa có các nghiên cứu điều tra dịch tễ bệnh. Từ năm 1994, khi một ổ
bệnh SLP tại Sìn Hồ - Lai Châu được phát hiện, bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu ở
nước ta. Theo nghiên cứu điều tra của Bệnh viện nhiệt đới trung ương từ 1994-1997 tại Sìn
Hồ – Lai Châu, bắt đầu từ một bệnh nhân nhiễm sán lá phổi được phát hiện vào năm 1993,
đến năm 1997 tổng số ca bệnh phát hiện là 102 trường hợp. Các tác giả cũng thu được sán lá
phổi trưởng thành ở động vật, bao gồm chó nhà (12/18=67%), cầy móc cua (Herpestes

34. 22
urva) (2/2 = 100%) và lợn nhà (1/25 = 4%). Tỷ lệ nhiễm metacercaria SLP ở cua suối
Potamicus mieni (= Ranguna luangprabangesis) là 52,6% [4].
Viện Sốt rét, ký sinh trùng và côn trùng Trung ương điều tra rộng hơn đã phát hiện
bệnh nhân SLP ở nhiều tỉnh miền núi phía bắc với tỷ lệ nhiễm ở người từ 0,2-15%, ở chó
nhà từ 18,2-33,3%, ở cua suối từ 52,5-98,1% [7-12].
Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật điều tra SLP ở vật chủ trung gian trên 56 địa
điểm của 3 tỉnh Tây Bắc phát hiện mầm bệnh SLP ở 6 xã. Các tác giả đã tìm thấy
metacercaria của SLP ở 3 loài cua suối là: Potamiscus mieni, Potamiscus tannanti và
Potamiscus kimboiensis. Các loài cua đồng Somannithelphusa sinensis,
Somannithelphusa brandti và tôm Macrobrachium nipponense, Macrobrachium
dienbienphuense không bị nhiễm metacercaria của SLP. Các tác giả cũng đã phát hiện ấu
trùng cercaria của sán lá phổi ở ốc Oncomelania [14].
Trước đây, bệnh SLP ở Việt Nam được cho là do loài P. westermani gây nên, vì
đó là loài phổ biến [83]. Khi phát hiện ổ bệnh ở Sìn Hồ, các mẫu SLP được xác định là
loài P. heterotremus [5, 84, 85]. Việc chẩn đoán ệnh SLP ở người tại Việt Nam hiện nay
chủ yếu là dựa vào lâm sàng, cận lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh. Các chẩn đoán cận
lâm sàng bao gồm xét nghiệm công thức máu, chú ý bạch cầu ái toan, xét nghiệm ELISA
phát hiện kháng thể. Kỹ thuật ELISA được sử dụng là ELISA thông thường, cần có máy
đọc quang phổ và phải thực hiện ở các bệnh viện lớn thường ở Hà Nội. Tuy nhiên, bệnh
nhân SLP chủ yếu gặp ở các tỉnh miền núi, vì vậy, đối với người dân nghi nhiễm bệnh
phải về các bệnh viện tại Hà Nội để chẩn đoán, hoặc các đoàn nghiên cứu điều tra SLP
phải lấy huyết thanh của người dân địa phương miền núi đưa về các phòng thí nghiệm
hoặc các bệnh viện ở Hà Nội để xét nghiệm ELISA, sau đó gửi kết quả cho các cơ sở y tế
địa phương để điều trị cho người bị nhiễm bệnh. Điều này gây khó khăn cho công tác
chẩn đoán và phòng trị bệnh kịp thời. Vì vậy, cần nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật xét
nghiệm có thể thực hiện ở thực địa để chẩn đoán nhanh ệnh SLP, giúp cho công tác trị
bệnh được nhanh chóng và hiệu quả.
Cho đến năm 2006, chỉ có loài P. heterotremus được phát hiện phổ biến ở các tỉnh
miền núi phía Bắc và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ở người [12, 85]. Các cuộc
điều tra sau đó đã phát hiện thêm các loài sán lá phổi [16, 17]. Năm 2009, lần đầu tiên
metacercaria của loài P. westermani được phát hiện ở tỉnh Quảng Trị [19], và sau đó là ở

35. 23
các tỉnh khác thuộc khu vực miền Trung [22]. Cho đến nay, 7 loài sán lá phổi đã được
phát hiện ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung: bao gồm P. heterotremus, P. westermani,
P. skjabini, P. proliferus, P. bangkokensis, P. harinasutai và P. vietnamensis [22]. Trong
đó, loài P. heterotremus phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và P. westermani phổ biến ở các
tỉnh miền Trung, các loài khác có tỷ lệ nhiễm thấp hơn [22].
Như vậy, có thể nói r ng SLP ở Việt Nam tương đối đa dạng và phân bố ở nhiều
tỉnh miền núi, gây bệnh cho người cũng như động vật. Ba loài (P. heterotemus,
P. westermani và P. skrjabini) có khả năng gây bệnh cho người đều được phát hiện ở
Việt Nam. Trong đó loài P. skrjabini hiếm gặp, mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa
với tỷ lệ nhiễm thấp; loài P. heterotremus phân bố phổ biến ở các tỉnh miền Bắc; loài
P. westermani phổ biến ở các tỉnh miền Trung với tỷ lệ nhiễm metacercaria ở cua suối rất
cao [22]. Vì vậy, hai loài P. heterotremus và P. westermani cần được quan tâm nghiên
cứu. Loài P. heterotremus đã được nghiên cứu về dịch tễ, bệnh học và vòng đời phát triển
[3, 7-12, 14]; còn loài P. westermani mới chỉ dừng ở mức độ phát hiện metacercaria ở
cua núi tại Bắc Trung bộ [19]. Nhiều vấn đề về 2 loài sán lá này chưa được làm sáng tỏ
(bảng 1.2).
Bảng 1.1. Những vẫn đề đã và chưa được giải quyết của 2 loài sán lá phổi
Vấn đề nghiên cứu P. heterotremus P. westermani
Phân bố - Miền Bắc
- Miền Trung
+
?
?
+
Vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên
trong thí nghiệm
-
+
-
-
Vật chủ trung gian thứ hai ngoài tự nhiên + +
Vật chủ trung chính ngoài tự nhiên
trong thí nghiệm
+
+
-
+
Vật chủ chứa trong thí nghiệm + -
Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền + -
Sức sống metacercaria - -
Chẩn đoán nhiễm bệnh nhanh ở thực địa - -

36. 24
Tóm lại, số ca mắc bệnh SLP đã giảm ở nhiều nơi trên thế giới. Tuy nhiên, nó lại
trở thành bệnh bị lãng quyên và có thể tái xuất hiện ở một số nơi. Ngoài ra, nhiều ổ bệnh
mới cũng được phát hiện. Thói quen ăn uống không chỉ ở các nước nghèo có thu nhập
thấp và giáo dục thấp, mà còn ở các nước phát triển cũng góp phần vào việc nhiễm SLP.
Hơn nữa, nhu cầu khám phá văn hóa trong thời đại du lịch dễ dàng, cộng với việc nhập
khẩu thực phẩm có thể khiến cho bệnh SLP xuất hiện ở những nơi không phải là vùng
dịch tễ của bệnh, dễ gây nhầm lẫn cho công tác chẩn đoán bệnh. Do đó, để giảm nhiễm
SLP, cần tăng nhận thức về bệnh và cách phòng chống bệnh, đối với cả các chuyên gia y
tế/thú y và đại chúng. Về phân loại và sinh học, giống SLP rất phức tạp và đa dạng, phân
loại và tiến hóa của chúng vẫn còn chưa được giải quyết toàn diện, vì vậy nghiên cứu
toàn diện hơn về SLP và bệnh SLP là cần thiết.
Ở Việt Nam, đến nay đã phát hiện 7 loài SLP ở miền Bắc và miền Trung, trong
đó 3 loài có khả năng gây ệnh cho người đều được phát hiện. Tuy nhiên, phổ biến nhất
là loài P. heterotremus ở miền Bắc và P. westermani ở miền Trung. Nhiều vấn đề về 2
loài SLP quan trọng này chưa được giải quyết: như loài P. heterotremus có phân bố ở
miền Trung và P. westermani có phân bố ở miền Bắc hay không? Tính đa dạng về hính
thái, di truyền phân tử và đặc điểm sinh học (như sức sống của metacercaria, vật chủ
ngoài tự nhiên, vai trò vật chủ chứa trong vòng đời phát triển). Hơn nữa, các ca bệnh
SLP và những vùng bệnh SLP mới vẫn được tiếp tục phát hiện. Vì vậy, cần có những
nghiên cứu chẩn đoán nhanh, đơn giản để chẩn đoán và trị bệnh kịp thời, góp phần bảo
vệ sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu của chúng tôi sẽ tập trung giải quyết những vấn đề
này.

37. 25
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Sán lá phổi P. heterotremus và P. westermani.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu:
Vật chủ trung gian thứ nhất là ốc nước ngọt.
Vật chủ trung gian thứ hai là cua suối.
Vật chủ chính: chó nhà và m o nhà, phân động vật hoang.
Vật chủ chứa: chuột nhắt trắng.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Điều tra ở thực địa tại 6
xã thuộc 3 tỉnh Lào Cai,
Yên Bái và Quảng Trị
(hình 2.1), bao gồm:
- Xã Lương Sơn, huyện
Bảo Yên, tỉnh Lào Cai .
- Xã An Lạc, huyện Lục
Yên, tỉnh Yên Bái,
- 4 xã: Hướng Sơn và Tân
Thành (huyện Hướng
Hóa), xã Da Krong và Tà
Long (huyện Da Krong)
thuộc tỉnh Quảng Trị.
Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu
Nguồn: Wikimedia
- Nghiên cứu hình thái, sinh học, phân tử và chẩn đoán miễn dịch trong phòng thí
nghiệm tại Phòng Ký sinh trùng học và phòng Hệ thống học phân tử và di truyền bảo tồn,
Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

38. 26
2.1.4. Thời gian nghiên cứu
- Từ 10/2014 đến tháng 10/2017.
2.2. Phƣơng pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm
Dựa vào kết quả nghiên cứu của các công bố trước đây, metacercaria của loài SLP
P. heterotremus phổ biến ở các tỉnh miền Bắc (như Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái) và loài
P. westermani phổ biến ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ, đặc biệt là tỉnh Quảng Trị [22]. Vì
vậy, chúng tôi chọn địa điểm nghiên cứu tại 3 tỉnh Lào Cai, Yên Bái và Quảng Trị.
Metacercaria ở vật chủ trung gian thứ hai là chỉ thị nhanh và chính xác nhất để xác
định vùng phân bố của SLP, vì vật chủ chính (người và động vật) có thể bị nhiễm bệnh ở
nơi khác, còn tỷ lệ nhiễm ở vật chủ trung gian thứ nhất thường rất thấp [1], dẫn đến xác
xuất bắt gặp thấp. Vì vậy, tại các điểm nghiên cứu, trước tiên thu thập cua suối, nghiên
cứu phương pháp xét nghiệm cua để thu metacercaria dễ và chính xác nhất. Sử dụng
phương pháp xét nghiệm tốt nhất để xét nghiệm cua suối xác định tình hình nhiễm
metacercaria SLP. Thu metacercaria để sử dụng cho các nội dung nghiên cứu khác.
Từ kết quả điều tra tỷ lệ nhiễm metacercaria của SLP xác định được các địa điểm
có tỷ lệ nhiễm 2 loài P. heterotremus và P. westermani cao nhất để tiếp tục điều tra xác
định vật chủ chính, vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên. Kết hợp cả phương pháp
định loại hình thái và phân tử để định danh cả loài SLP cũng như vật chủ chính và vật
chủ trung gian thứ nhất của SLP. Sơ đồ nội dung nghiên cứu trình bày ở hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ nội dung nghiên cứu

39. 27
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xét nghiệm cua thu metacercaria của sán lá phổi
Hai phương pháp xét nghiệm cua đang được sử dụng phổ biến là giã-lọc cua [86]
và ép cua giữa 2 tấm kính [87] để thu metacercaria SLP. Tuy nhiên, chưa có tác giả nào
mô tả cụ thể thời gian lắng cặn của phương pháp giã-lọc cua, cũng như chưa có nghiên
cứu so sánh 2 phương pháp xét nghiệm cua để biết phương pháp nào tốt hơn. Vì vậy, để
xác định phương pháp xét nghiệm cua tốt hơn, chúng tôi thử nghiệm để xác định thời
gian lắng cặn của phương pháp giã lọc cua và so sánh với phương pháp ép cua.
Nguyên tắc của phương pháp giã-lọc là giã cua để tách metacercaria khỏi phần cơ
(thịt cua) và các nội quan của cua, sau đó dùng nước để lọc qua lưới lọc có kích thước 1 x
1 mm vì metacercaria sán lá phổi lớn nhất có đường kính khoảng 0,8 mm [27] để loại bỏ
bớt phần cặn có kích thước lớn. Sau đó gạn-lọc để loại bỏ những cặn có tỷ trọng nhỏ hơn
metacercaria còn lơ lửng ở trên khi metacercaria đã lắng xuống đáy. Do đó, nếu thời gian
để lắng quá lâu thì các cặn nhỏ cũng lắng xuống đáy, sẽ khó lọc đến khi dung dịch trong
có thể quan sát dưới kính hiển vi để thu metacercaria. Ngược lại, nếu thời gian để lắng
quá ngắn thì sẽ bị mất metacercaria. Vì vậy, xác định thời gian lắng giữa các lần lọc thích
hợp để thu được metacercaria nhanh và chính xác nhất là rất cần thiết trong nghiên cứu
dịch tễ SLP.
Các công bố trước đây chỉ mô tả chung chung để lắng trong vài phút, duy nhất
công bố của Sohn et al. (2009) [86] ghi cụ thể thời gian lắng trong 15 phút. Khi áp dụng
thời gian lắng cặn này chúng tôi thấy tất cả các chất cặn đều lắng xuống đáy, không lọc
được đến dung dịch trong, thậm chí thời gian lắng cặn là 5 phút cũng khó thu được dung
dịch trong. Vì vậy, chúng tôi thử nghiệm ở thời gian lắng cặn 3 phút, 2 phút và 1 phút.
Nguyên liệu
Metacercaria của loài P. heterotremus và P. westermani thu ở các địa điểm nghiên
cứu và một con cua suối bắt tại xã Yên Quang, huyện Lương Sơn, tỉnh Hòa Bình - vùng
không bị nhiễm SLP [14].
Thực hiện thí nghiệm
Phươ g pháp giã-lọc cua: Để xác định số lần gạn lọc và thời gian lắng cặn giữa
các lần lọc, thực hiện các ước sau:

40. 28
- Lấy một cá thể cua suối có kích thước trung bình chiều ngang mai cua 30 mm bắt
ở vùng không nhiễm SLP. Loại bỏ mai cua, dùng chày giã nhuyễn trong cối giã
cua.
- Đếm 50 metacercaria của loài P. westermani (thu từ cua suối bắt tại Hướng Sơn,
Hướng Hóa, Quảng Trị) nhỏ vào cối cua đã giã nhuyễn, cho thêm 250 ml nước,
khuấy đều và lọc qua lưới lọc kích thước 1 x 1 mm vào cốc nhựa thể tích 300 ml.
Để lắng trong thời gian thử nghiệm, sau đó gạn ½ phần dung dịch phía trên sang
một cốc khác, giữ lại để kiểm tra. Tiếp tục cho thêm đầy nước vào phần cặn. Tiến
hành gạn-lọc đến khi phần cặn trong có thể xem dưới kính hiển vi soi nổi. Thử
nghiệm thời gian lắng cặn giữa các lần lọc là: 3 phút, 2 phút và 1 phút b ng cách
dùng đồng hồ bấm giờ.
- Đem phần cặn cuối cùng kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi tìm metacercaria SLP.
Nếu đếm đủ 50 metacercaria chứng tỏ với thời gian lắng đó toàn ộ metacercaria
đã lắng xuống đáy, thực hiện thí nghiệm với thời gian gạn lọc ngắn hơn. Nếu đếm
không đủ 50 metacercaria thì kiểm tra phần nước lọc của tất cả các ước trước đó
để biết số lượng metacercaria đã ị gạn đi ở các lần lọc trước.
Xác định thời gian lắng cặn thích hợp nhất là thời gian để lắng ngắn nhất mà vẫn
thu lại đủ 50 metacercariae ở phần cặn của lần lọc cuối cùng. Thí nghiệm với mỗi
thời gian lắng cặn lặp lại 3 lần. Làm tương tự như vậy với metacercaria của loài
P. heterotremus.
Phươ g pháp ép cua giữa 2 tấm kính: thực hiện theo quy trình theo mô tả bởi
Sugiyama et al. (2013) [87]. Loại bỏ mai cứng, dùng panh gắp riêng phần mang và gạch
(gan) cua ép giữa 2 tấm kính để kiểm tra dưới kính hiển vi. Đối với phần cơ thân và cơ
chân, dùng kéo và dao để nạo lấy phần cơ, ép giữa 2 tấm kính, quan sát dưới kính hiển vi
tìm metacercaria SLP. Đếm số lượng metacercaria ở từng bộ phận cơ thể cua.
So sá h phươ g pháp ép cua và giã-lọc cua:
So sánh 2 phương pháp xét nghiệm cua về thời gian xét nghiệm và số metacercaria
thu được từ 10 cá thể cua suối bắt tại Yên Bái - nơi có tỷ lệ nhiễm P. heterotremus cao.
Xét nghiệm riêng từng bộ phận (mang, gạch cua, cơ thân và cơ chân) của từng cá
thể cua b ng phương pháp ép giữa 2 tấm kính [87]. Đếm số lượng metacercaria ở từng bộ
phận cơ thể cua.

41. 29
Sau khi đếm xong số lượng metacercaria ở từng bộ phận cơ thể theo phương pháp
ép cua giữa 2 tấm kính thì chuyển sang cối giã cua để xét nghiệm theo phương pháp giã-
lọc cua. Đối với phần cơ thân và cơ chân thì chuyển cả phần thịt đã nạo ra ép trên kính và
phần vỏ cứng vào cối giã để giã lọc cua theo quy trình mô tả như trên với số lần lọc và
thời gian để lắng thích hợp nhất đã được xác định. Đếm số lượng metacercaria ở từng bộ
phận cơ thể cua. So sánh thời gian xét nghiệm và số lượng metacercaria thu được từ 2
phương pháp trên.
2.3.2. Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở cua suối tại địa
điểm nghiên cứu.
- Bắt cua ở các khe suối tại các địa điểm nghiên cứu. Cua suối thường núp dưới các
hòn đá, lật đá lên để bắt cua. Tỷ lệ nhiễm metacercaria ở các khu vực nghiên cứu
đã được công bố tương đối cao [22], vì vậy mỗi địa điểm nghiên cứu xét nghiệm ít
nhất 50 con cua suối. Định loại cua dựa vào hình thái theo khóa định loại cua ở
Việt Nam [88-91]. Các đặc điểm hình thái chủ yếu là dựa vào giáp đầu ngực (mai
cua), chân giao cấu con đực và các đốt cuối phần bụng (yếm cua).
- Xét nghiệm cua theo phương pháp tốt nhất đã được xác định, tính tỷ lệ nhiễm theo
công thức sau
- Cường độ nhiễm trung ình tính như sau
2.3.3. Nghiên cứu hình thái metacercaria
- Nhận diện metacercaria của SLP với đặc điểm đặc trưng là ruột uốn lượn và túi bài
tiết lớn chứa đầy hạt glycogen màu đen [1].
- Quan sát hình dạng và đo kích thước chiều dài, rộng, độ dày lớp vỏ của
metacercaria dưới kính hiển Olympus vi gắn trắc vi thị kính.

42. 30
- Định loại metacercaria SLP dựa vào hình thái theo khóa định loại của Doanh et al.
[22].
2.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử của loài Paragonimus heterotremus và
Paragonimus westermani
- Chọn mẫu: mục đích nghiên cứu này là so sánh di truyền phân tử của các quần thể
cách xa nhau về địa lý ở miền Bắc và miền Trung. Ở mỗi quần thể chọn ít nhất 3
mẫu metacercaria (nếu đủ số lượng), với mỗi dạng metacercaria chọn ít nhất 2
mẫu, bảo quản trong cồn ethanol 100%.
- Chọn gen nghiên cứu: Nghiên cứu đa dạng di truyền của SLP thường sử dụng một
gen/đoạn chèn của hệ gen nhân và một gen ty thể, vì gen nhân là chỉ thị tốt để
phân biệt giữa các loài SLP, còn gen ty thể là chỉ thị tốt để nghiên cứu các quần
thể trong loài [1]. Vì vậy, đối với loài P. heterotremus chọn đoạn chèn ITS2 và
gen ty thể CO1, đối với loài P. westermani chọn đoạn chèn ITS2 và gen 16S, vì
gen này có thể phân biệt dạng 2n hay 3n của loài P. westermani [28].
- Tách chiết DNA tổng số b ng QIAamp DNA stool MiniKit (Qiagen, Hilden,
Germany), thực hiện phản ứng PCR để nhân bản trình tự đích với cặp mồi lựa
chọn ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng để nhân bản trình tự đích nghiên cứu
Trình tự
đích
Cặp mồi Tài liệu tham khảo
ITS2 3S : 5’- AGCGGTGGATCACTCGGCTCGTG- 3’
A28 : 5’-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCGC-3’
[92]
CO1 JB3:5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′
JB4.5: TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′
[93]
16S T7-1: 5’-ATTTACATCAGTGGGCCGTC-3’
SP6-1: 5’-GATCCAAAAGCATGTGAAAC-3’
[28]
- Điện di kiểm tra kết quả PCR trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và
soi đ n UV.
- Tinh khiết sản phẩm PCR b ng QIAquick PCR purification kit (QIAGEN Inc.
Mỹ), giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR b ng máy tự động ABI Prism 3130

43. 31
Genetic Analyser (Applied Biosystem), sử dụng BigDye Terminator Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystem).
- So sánh trình tự thu được với các trình tự tương đồng trên GenBank b ng chương
trình Blast (NCBI) và vẽ cây phát sinh chủng loại b ng phương pháp Maximum
Likelihood với mô hình tốt nhất (best model test) trên phần mềm MEGA 6.0 [94].
2.3.5. Gây nhiễm cho vật chủ chính
- Động vật thí nghiệm: 4 cá thể chó nhà và 8 cá thể mèo nhà mua tại Hà Nội, được
kiểm tra và tẩy giun sán trước khi thí nghiệm. Mục đích của nghiên cứu này là xác
định sự phát triển của SLP ở vật chủ chính, không nghiên cứu sự biến đổi sinh lý,
sinh hóa vì vậy không cần lô động vật đối chứng.
- Trước khi gây nhiễm để động vật nhịn ăn trong 4h, gây nhiễm cho động vật với số
lượng 30-50 metacercaria/vật chủ. Đếm số lượng metacercaria, dùng pipet hút số
metacercaria đã đếm nhỏ vào giữa miếng thức ăn mà động vật thí nghiệm ưa thích:
cho m o ăn cá và chó ăn phổi lợn. Theo dõi đảm bảo động vật thí nghiệm ăn hết
thức ăn chứa metacercaria.
- Sau khi gây nhiễm, nuôi nhốt động vật thí nghiệm, cho động vật ăn thức ăn nấu
chín, theo dõi động vật thí nghiệm. Vì thời gian thải trứng sớm nhất của các loài
SLP ở vật chủ chính là 45 ngày [1], vì vậy sau gây nhiễm 45 ngày xét nghiệm
phân tìm trứng sán theo phương pháp lắng cặn [95] để xác định thời gian trưởng
thành và thải trứng của sán ở động vật thí nghiệm.
- Sau khi phát hiện trứng SLP khoảng 30 ngày để sán phát triển đầy đủ nhất thì mổ
động vật thí nghiệm thu sán trưởng thành cho nghiên cứu hình thái và thu kháng
nguyên chất tiết để thực hiện phản ứng dot-ELISA.
2.3.6. Nghiên cứu hình thái sán lá phổi trưởng thành
- Thu SLP từ động vật thí nghiệm, ép nhẹ giữa 2 lam kính, định hình và bảo quản
trong cồn ethanol 70%.
- Sau khi bảo quản trong cồn ít nhất 2 tuần thì làm tiêu bản cố định b ng phương
pháp nhuộm carmine [95]. Đo kích thước cơ thể và nội quan của sán (bao gồm
chiều dài, rộng cơ thể, giác miệng và giác bụng, tinh hoàn, buồng trứng và kích
thước trứng) b ng kính hiển vi lắp trắc vi thị kính, vẽ sán b ng phần mềm
Illustrator.

44. 32
2.3.7. Xác định vai trò vật chủ chứa
- Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng dòng BALB/c mua tại Viện Vệ sinh dịch
tễ trung ương.
- Số lượng chuột gây nhiễm: mỗi loài SLP gây nhiễm cho 10 cá thể chuột với số
lượng 50 metacercaria/chuột.
- Khi gây nhiễm, gây mê chuột b ng Diethyl Ether, dùng pipet hút số lượng
metacercaria nhỏ vào cuống họng chuột.
- Sau khi gây nhiễm, nuôi chuột trong lồng, cho ăn thức ăn công nghiệp. Sau gây
nhiễm 1-2 tháng, mổ khám chuột thí nghiệm, thu sán non ở cơ và các nội quan
b ng dung dịch nước muối sinh lý và pepsin 1% theo mô tả của Sadaow et al.
(2013) [96]. Thu sán non để nghiên cứu hình thái và gây nhiễm chuyển tiếp cho
mèo nhà để xác định sán có tiếp tục phát triển ở vật chủ chính hay không theo các
ước trình bày ở mục 2.3.5.
2.3.8. Xác định vật chủ ngoài tự nhiên của sán lá phổi
2.3.8.1. Xác định vật chủ trung gian thứ nhất
- Xác định vật chủ trung gian thứ nhất bao gồm thu mẫu ốc, xét nghiệm ốc tìm
cercaria, định loài cercaria và định loài vật chủ ốc theo sơ đồ hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ trung gian thứ nhất