Luận văn thạc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
NGUYỄN THỊ HỒNG
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP - NHÂN GIỐNG
VÀ NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG
HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Ở VIỆT NAM
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM
Hà Nội, 2019

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nghiên cứu nào khác.
Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu
nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá
luận văn của Hội đồng khoa học.
Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2020
Ngƣời cam đoan
Nguyễn Thị Hồng

ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành trong chương trình đào tạo nghiên cứu sinh khóa
26A của trường Đại học Lâm nghiệp.
Đ hoàn thành được Luận văn này, trước hết tôi xin chân thành cảm ơn tập
th Ban lãnh đạo Viện, các th y cô giáo của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp
và Ban Giám đốc Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc đã tạo đi u kiện tốt nhất
cho tôi trong quá trình thực hiện Luận văn này.
Đặc biệt, tôi xin g i lời biết ơn sâu s c đến TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm đã
tận tình hướng d n tôi ngay nh ng ngày đ u b t tay vào nghiên cứu đ tôi hoàn
thành tốt Đ tài nghiên cứu.
Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ kinh phí của Dự án thuộc Quỹ đổi
mới Công nghệ Quốc gia - Bộ Khoa học & Công nghệ tài trợ: “Hoàn thiện, nâng
cấp quy trình sản xuất và phát tri n sản phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Cordyceps
militaris”, do PGS.TS. Lê Minh S t, Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc làm
chủ nhiệm.
Cuối c ng, tôi xin g i lời cảm ơn tới gia đình, bạn b và người thân đã luôn
luôn kh ch lệ, động viên và tạo mọi đi u kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn
thành Luận văn này.
Tuy đã cố g ng đ hoàn thiện Luận văn, song kinh nghiệm của tôi c n hạn
chế, vì vậy Luận văn không tránh khỏi nh ng thiếu sót, k nh mong các qu th y cô
đóng góp kiến đ Luận văn của tôi được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
à Nội, ngày29 tháng 5 năm 2020
Học viên
Nguyễn Thị Hồng

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................i
LỜI CẢM ƠN...............................................................................................ii
MỤC LỤC ...................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.............................................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................ix
ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................1
Phần I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU........................................2
1.1. Tổng quan chung v Cordyceps militaris .............................................2
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu.........................................................................2
1.1.2. Phân loại........................................................................................2
1.1.3. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps militairs ...............................3
1.1.4. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris...............................4
1.1.5. Các hoạt chất chính trong nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris ...................................................................................................5
1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
ở Việt Nam và trên thế giới.........................................................................7
1.2.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris trên thế giới ...............................................................................7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris ở Việt Nam.................................................................................9
1.3. Các phương pháp định danh nấm ....................................................... 10
1.3.1. Phương pháp định danh thông qua hình thái................................ 10
1.3.2. Phương pháp định danh bằng phân tử .........................................11
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát tri n của nấm Đông
trùng hạ thảo Cordyceps militaris.............................................................. 15

iv
1.4.1. Yếu tố giống .................................................................................15
1.4.2. Yếu tố dinh dưỡng ........................................................................15
1.4.3. Các yếu tố môi trường..................................................................17
Phần 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU18
2.1. Mục tiêu nghiên cứu...........................................................................18
2.1.1. Mục tiêu tổng quát .......................................................................18
2.1.2. Mục tiêu cụ thể.............................................................................18
2.2. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu.......................................18
2.2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ....................................................18
2.2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................18
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................19
2.3.1. Phương pháp thu thập và định danh loài nấmCordyceps militaris....19
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm
Cordyceps militaris................................................................................22
2.3.3. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm
Cordyceps militaris................................................................................23
2.3.4. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp
phù hợp với Cordyceps militaris bản địa................................................24
2.4. Nguyên liệu,hóa chất, thiết bị............................................................. 27
2.5. Phương pháp thu thập và x lý số liệu................................................27
Phần 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 28
3.1. Kết quả thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris..............28
3.1.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai.....28
3.1.2. Kết quả định danh loài nấm Cordyceps militaris bằng phân tử....37
3.2. Kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris ....................... 51
3.3. Kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm Cordyceps militaris ............54
3.3.1. Nhân giống cấp 1 trên môi trường thạch......................................54
3.3.2. Nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng........................................63

v
3.4. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp ph hợp
với Cordyceps militaris bản địa................................................................. 73
KẾT LUẬN............................................................................................... 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 102

vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Viết đầy đủ
APS Acidic polysaccharide
C Cacbon
CMWE Dịch chiết từ quả th nấm Cordyceps militaris
C.militaris Cordyceps militaris
CNSH Công nghệ sinh học
Cu Đồng
ddNTP Dideoxynucleotide
ĐTHT Đông tr ng hạ thảo
FAME Fatty Acid Methyl Ester
IL-6 Interleukin-6
ITS Internal Transcribed Spacer
LPS Lipopolysaccharide
PCR Polemerase Chain Reaction
PDA Potato Dextro Agar
PGA Potato Glucose Agar
rRNA ARN riboxom
Se Selen
SSU Small Subunit
TNHH Trách nhiệm h u hạn
TNF - α yếu tố hoại t khối u α
VQG Vườn quốc gia
Zn Kẽm

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành ph n phản ứng PCR..................................................................221
Bảng 2.2. Công thức phối trộn 3 loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris....255
Bảng 2.3. Công thức phối trộn 3 loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris....255
Bảng 3.1. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM1 với các trình tự
tương đồng ở GeneBank........................................................................................37
Bảng 3.2. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM2 với các trình tự
tương đồng ở GeneBank........................................................................................39
Bảng 3.3. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM13 với các trình
tự tương đồng ở GeneBank....................................................................................41
Bảng 3.9. Kết quả phân lập m u nấm Codyceps militaris thu ngoài tự nhiên .........50
Bảng 3.10. Đường k nh sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên môi
trường cơ bản PGA................................................................................................55
Bảng 3.11. Đường k nh sinh trưởng của các hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các
đi u kiện nhiệt độ khác nhau .................................................................................57
Bảng 3.12. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành ph n môi trường đến khả năng
tạo sinh khối nấm trong môi trường dịch th ..........................................................62
Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ l c đến khả năng tạo sinh khối
nấm trong môi trường dịch lỏng ............................................................................69

viii
Bảng 3.14. Kết quả ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng hình thành và phát
tri n quả th ...........................................................................................................71
Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu đặc đi m sinh trưởng của hệ sợi khi nuôi cấy trên
môi trường C2 .......................................................................................................76
Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nguồn Nito đến khả năng hình thành và phát
tri n quả th ...........................................................................................................79
Bảng 3.17. Kết quả nghiên cứu đặc đi m sinh trưởng của hệ sợi khi nuôi cấy trên
môi trường N2.......................................................................................................83
Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng và phát
tri n quả th Cordyceps militaris ...........................................................................81
Bảng 3.19. kết quả nghiên cứu đặc đi m quả th khi chiếu sáng ở cường độ 700 lux..87
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng hình thành và phát
tri n quả th Cordyceps militaris ...........................................................................89
Bảng 3.21. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày ..90
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng hình thành và phát tri n quả th
Cordyceps militaris................................................................................................92
Bảng 3.23. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm 80% và 90% đến sinh trưởng
của quả th ............................................................................................................93
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành và phát tri n quả th
Cordyceps militaris................................................................................................96
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của quả th ...........................97

ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Hình ảnh m u nấm CM1 thu ngoài tự nhiên.........................................299
Hình 3.3. Hình ảnh m u nấm CM5 thu ngoài tự nhiên...........................................30
Hình 3.4. Hình ảnh m u nấm CM7 thu ngoài tự nhiên...........................................31
Hình 3.7. Hình ảnh m u nấm CM18 ngoài tự nhiên...............................................33
Hình 3.9. Hình ảnh m u nấm CM28 ngoài tự nhiên...............................................35
Hình 3.10. Hình ảnh m u nấm CM29 thu ngoài tự nhiên.......................................36
Hình 3.11. Hình ảnh m u nấm CM32 ngoài tự nhiên.............................................36
Hình 3.12. Hình ảnh m u nấm CM34 ngoài tự nhiên.............................................37
Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM1 trên BLAST NCBI ...............38
Hình 3.14. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM1 ...............................................39
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM2 trên BLAST NCBI ...............40
Hình.3.18. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM13 trên BLAST NCBI .............41
Hình 3.19. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM13 .............................................42
Hình 3.20. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM18 trên BLAST NCBI .............42

x
Hình 3.30. M u CM2 và CM13 sau 10 ngày phân lập ...........................................51
Hình 3.31. Hình ảnh các m u nấm ngoài tự nhiên sau 10 ngày phân lập................52
Hình 3.32. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường Hansen .55
Hình 3.33. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trườngCzapek-Dox ....56
Hình 3.34. Hình ảnh m u CM1 sau 7 ngày nuôi cấy và m u CM7 sau 15 ngày nuôi cấy.58
Hình 3.35. Hình ảnh các m u nấm sau 7 ngày nhân giống trên môi trường PGA ...58
Hình 3.36. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nhân giống trên môi trường PGA .59
Hình 3.37. Hình ảnh m u nấm CM1 ......................................................................61
Hình 3.40. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25o
C..............61
Hình 3.41. Hình ảnh m u CM1 trên môi trường M1(A) và môi trường M2(B) ......65
Hình 3.42. Hình ảnh các m u được nuôi cấy trên môi trường M1 sau 7 ngày l c dịch......66
Hình 3.45. Hình ảnh các m u khi l c ở tốc độ 100 vòng/phút ................................70
Hình 3.48. Hình ảnh các m u sau khi ươm sợi trên môi trường C2........................75
Hình 3.49. Hình ảnh m u nấm CM29 và CM32 sau 63 ngày và 56 ngày nuôi trồng
trên môi trường C1 ................................................................................................76
trên môi trường C3 ................................................................................................76
Hình 3.51. Hình ảnh m u CM1 sau 25 ngày nuôi cấy (A)và 57 ngày nuôi cấy (B)
trên môi trường C2 ................................................................................................78
Hình 3.52. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trên môi trường C2.....................79
Hình 3.53. Hình ảnh các m u sau khi ươm sợi trên môi trường N2............................81
trên môi trường N1................................................................................................................82

xi
trên môi trường N3................................................................................................................82
Hình 3.56. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trên môi trường N2......................840
Hình 3.57. Hình ảnh m u CM29 sau 55 ngày nuôi cấy ở môi trường N2..................81
Hình 3.58. Hình ảnh m u CM29 sau 56 ngày nuôi cấy ở cường độ ánh sáng 500 lux....86
Hình 3.59. Hình ảnh các m u nấm sau khi nuôi trồng ở cường độ 700 lux...............88
Hình 3.60. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp ở thời gian
chiếu sáng 12 giờ/ngày .........................................................................................................91
Hình 3.61. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trong độ ẩm 80%............................90
Hình 3.62. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trong độ ẩm 90%............................95
Hình 3.63. Hình ảnh m u CM18 sau khi hệ sợi ăn lan k n b mặt cơ chất (A) và sau
khi nuôi sáng 3 ngày (B) ở nhiệt độ 22o
C.........................................................................96
Hình 3.64. Hình ảnh m u CM32 ở nhiệt độ 22o
C - 24o
C sau 50 và 52 ngày nuôi trồng.98
Hình 3.65. Hình ảnh m u CM1, CM29, CM34 ở nhiệt độ 22oC và 24oC sau khi
nuôi trồng trên giá th tổng hợp..........................................................................................99
Hình 3.66. Hình ảnhm u CM13 sau khi nuôi trồng 58 ngày ở nhiệt độ 22o
C và 24o
C.........99
Hình 3.67. Hình ảnh m u CM7 sau khi nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp ở nhiệt độ
22o
C và 24o
C.........................................................................................................................100

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông tr ng hạ thảo là một loài nấm dược liệu qu hiếm từ lâu đã được cả thế
giới biết đến. Nhi u nghiên cứu khoa học đã chứng minh Cordycep militaris có các
thành ph n hóa học ch nh có giá trị dinh dưỡng và dược t nh như: cordycepin,
adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid
béo, các sterol và các hoạt chất có tác dụng sinh học khác như acid amin, protein,
vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ...) và nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ...). Các bằng
chứng khoa học cũng đã xác nhận hiệu quả của Cordycep militaris như: cải thiện hệ
miễn dịch, chống lão hóa, chống mệt mỏi, tiêu diệt tế bào ung thư, vi rút và vi
khuẩn, hỗ trợ hệ tim mạch, cải thiện sự đ kháng insulin trên bệnh nhân ti u đường,
giảm cân và có th s dụng trong mỹ phẩm, .... Ch nh vì vậy, nhu c u các sản phẩm
từ Cordycep militaris trong nước hiện nay ước t nh đạt 300 tỷ đồng và đang ngày
càng gia tăng, trong đó trên 70% là các sản phẩm nhập khẩu. Trong khi đó, thị
trường tiêu thụ các sản phẩm từ Cordycep militaris trên thế giới hiện nay đạt mức
10.000 tấn/năm, tương đương khoảng 100 tỷ đô la Mỹ/năm. Việc Đông tr ng hạ
thảo tự nhiên d n trở nên khan hiếm đã thúc đẩy nhi u nghiên cứu hướng đến việc
nuôi trồng Đông tr ng hạ thảo nhân tạo. Cordyceps militaris hiện được s dụng như
nguồn Đông tr ng hạ thảo có th nuôi cấy nhân tạo đ tạo ra quả th , đáp ứng nhu
c u s dụng ngày càng gia tăng trong nước và trên thế giới với ch ph hợp l .
Ở Việt Nam có nhi u chủng nấm Đông tr ng hạ thảo (Cordyceps militaris)
mọc tự nhiên ở các v ng sinh thái khác nhau, tuy vậy việc phân lập, nhân giống và
định danh loài cũng như nuôi trồng chủng cho năng suất quả th cao, chất lượng
hoạt t nh tốt c n hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đ tài “Phân lập - nhân
giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) ở Việt Nam”
với mục đ ch định danh được nh ng chủng giống nấm Đông tr ng hạ thảo thu nhận
ngoài tự nhiên Việt Nam đ nuôi trồng cho năng suất quả th cao và hàm lượng các
hoạt chất Cordycepin, Adenosine tốt, sẽ góp ph n thúc đẩy sản xuất nh ng loài nấm
này tại Công ty Cổ Ph n Dược Thảo Thiên Phúc cũng như ở Việt Nam.

2
Phần I.
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan chung về Cordyceps militaris
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Nấm đông tr ng hạ thảo được xem là rất quý hiếm. Nh ng câu truyện mang
tính th n thoại và truy n thuyết liên quan đến loài nấm này được lưu truy n trong
nhi u thiên niên kỷ. Hiện nay, các ghi nhận v thời gian phát hiện đ u tiên loài nấm
này chưa được thống nhất. Theo Das (2009) thì nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps
được biết đến từ nh ng năm 2000 trước công nguyên. Nhưng theo Holliday và cộng
sự (cs.) (2004) tổng hợp từ nhi u nguồn tài liệu ghi nhận đ u tiên v nấm đông
trùng hạ thảo được thực hiện tại Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên, vào
tri u đại nhà Đường. Sự ghi nhận này đã làm rõ bản chất sinh học từ nh ng câu
truyện huy n thoại và truy n thuyết v đông tr ng hạ thảo.
Đông tr ng hạ thảo là một sinh vật tồn tại hàng năm được chuy n một cách
th n bí từ động vật sang thực vật vào m a h và sau đó lại từ thực vật chuy n sang
động vật vào m a đông. Tiếp sau đó có nhi u công trình được xuất bản với nội
dung v loài nấm đông tr ng hạ thảo này của các học giả xứ Tây Tạng từ thế kỷ 15
đến thế kỷ 18, trong đó có công trình đ u tiên được cho là có cơ sở khoa học tin cậy
nhất mô tả v nấm đông tr ng hạ thảo của Wu-Yiluo năm 1757, trong cuốn sách
Dược đi n, dưới tri u đại Thanh. Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện
ra giá trị của đông trùng hạ thảo thuộc v nh ng người chăn b trên núi Hymalaya ở
Tây Tạng cũ và Nepal, họ thấy rằng nh ng chú bò gặm cỏ ăn phải cây nấm đông
trùng hạ thảo vào m a xuân đã trở nên cuồng nhiệt, b đực luôn tìm và theo sát bò
cái (Holliday J. và cs, 2004)
1.1.2. Phân loại
Chi nấm Cordyceps đã được thu m u và định loại trên 400 loài khác nhau.
Theo hệ thống phân loại truy n thống, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành
Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae (Sung J.H.
và cs, 2007).

3
Phân loại nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris:
Giới : Fungi
Ngành: Ascomycota
Phân ngành: Ascomycotina
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Clavicipataceae
Chi: Cordyceps
Loài: Cordyceps militaris.
1.1.3. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps militairs
Nấm Đông tr ng hạ thảo là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng
hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng, lớp nhện. Vào m a Đông nấm
xâm nhiễm, k sinh vào cơ th côn trùng và làm cho côn trùng chết và nấm tồn tại
trong cơ th côn trùng dạng hệ sợi và là giai đoạn vô t nh. Đến mùa Hè, nhiệt độ và
ẩm độ không khí cao, hợi sợi nấm vô tính tiến hành giao phối và chuy n giai đoạn
h u tính, hình thành cây nấm (chất đệm) là cơ quan chứa bào t vô tính và nhú lên
khỏi mặt đất nhưng gốc v n dính li n vào thân sâu. Chính vì vậy mà nấm có tên gọi
Đông tr ng hạ thảo (Phạm Quang Thu và cs, 2013).
Nấm đông tr ng hạ thảo thường phát hiện vào mùa hè ở một số cao
nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt bi n; đó là các v ng Tây Tạng,
Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam... Đây ch nh là nguồn đông tr ng hạ thảo tự nhiên
(Nguyễn Mậu Tuấn và cs, 2013). Ngoài ra còn phát hiện tại các vùng núi cao thuộc
Ấn Độ, Nepal, Bhutan. Hiện nay, khoảng hơn 400 loài đã được tìm thấy, trong đó
có khoảng 90 loài được phát hiện ở Trung Quốc (Zhou X. và cs, 2009).
Tại Việt Nam, đông tr ng hạ thảo cũng đã được phát hiện tại nhi u địa đi m
khác nhau. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cs đã phát hiện 3 chủng là
Cordyceps nutans Pat. tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên T - Sơn Động - B c
Giang, Cordyceps gunni Berk. tại vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc,
Cordyceps militaris Link. tại vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai. Năm 2009,
Đái Duy Ban và cộng sự cũng công bố phát hiện mới của mình v loài đông trùng

4
hạ thảo l n đ u tiên được tìm thấy ở Việt Nam đó là loài đông tr ng hạ thảo có tên
là Isaria cerambycidae. Năm 2010, Phạm Thị Thùy Viện phát hiện được 2 giống là
Cordyceps nutans ở Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và Cordyceps
militaris ở Vũ Quang (Hà Tĩnh).
1.1.4. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris
Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong
đi u trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá trị kinh tế
cao. Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Do đó, việc sản xuất ở
quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và đi u trị bệnh
từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đ cấp thiết.
Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ
nấm cho thấy có hoạt t nh kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, đi u h a
miễn dịch (Shonkor et al, 2010).
oạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2
chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có t nh kháng DPPH, hoạt t nh kh và tạo
phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao et al., 2011).
Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi d ng chế phẩm
từ Cordyceps militaris, số lượng tinh tr ng tăng, số ph n trăm tinh tr ng di động và
hình dạng bình thường tăng . Hiệu quả này được duy trì thậm ch sau 2 tu n ngưng
s dụng chế phẩm. Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian s dụng chế
phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh tr ng ở
lợn (Lin et al, 2007).
ạn chế vius cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ
nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy m m có khả năng ứng dụng trong
đi u trị cúm A. Chất này góp ph n đi u h a hoạt động miễn dịch của các đại thực
bào (Yuko et al, 2007).
Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư: C. militaris: protein (CMP) tách
chiết từ nấm có k ch thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt t nh trong khoảng pH 7-9.
Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư
bàng quan (Byung-Tae et al, 2009). Hợp chất cordycepin c n cho thấy khả năng

5
kháng vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất d n xuất từ nấm được mong đợi ứng
dụng trong việc đi u trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột (Young-Joonet al.,
2000). Cordycepin ngăn sự bi u hiện của gen T2D chịu trách nhiệm đi u h a bệnh
ti u đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do
đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất đi u h a miễn dịch d ng trong
đi u trị các bệnh v miễn dịch (Seulmee et al., 2009).
Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps
militaris có hoạt t nh g n fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này
có khả năng s dụng trong đi u trị tan huyết khối tương tự như các enzym
fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme
này có th sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế h u hiệu cho các
enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được s dụng cho bệnh tim lão hóa ở
người (Jae-Sung et al., 2006).
Tính kháng viêm: Đ xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ
quả th nấm Cordyceps militaris (CMWE) được th nghiệm v tác dụng ki m soát
lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm k ch th ch việc sản xuất nitric oxide),
việc phóng th ch yếu tố hoại t khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào
RAW 264,7. Các đại thực bào được x l với nồng độ khác nhau của CMWE làm
giảm đáng k LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết.
Nh ng kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản
xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol et al., 2010).
Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc d
nấm Cordyceps sinensis được s dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên
các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau. Các chiết xuất từ
nấm Cordyceps militaris có th được s dụng trong các trường hợp suy giảm chức
năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Das et al., 2010).
1.1.5. Các hoạt chất chính trong nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
Theo số liệu nghiên cứu v thành ph n hóa học của th quả
nấm C.militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành ph n như protein chiếm
40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam),

6
vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9
mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm);
hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic
acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih et al, 2007)
Acid amin: Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả th
nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối
nấm (69,32 mg/g trong quả th và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng
acid amin mỗi loại trong quả th và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động
từ 1,15-15,06 mg/g và 0,36-2,99 mg/g. Thành ph n acid amin của mỗi loại trong
quả th bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68
mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) in the
fruiting body. Số liệu phân t ch của Chang và cộng sự (2001) cho thấy ph n lớn
trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine
(1,57 mg/g) (Chang, 2001).
Acid béo: Quả th nấm Cordyceps militaris chứa nhi u acid béo không no,
chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến
61,3% trongquả th và 21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid
palmitic, chiếm 24,5% trong quả th và 33,0% trong sinh khối (Hur, 2008)
Adenosine và cordycepin: Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược
t nh cao của nấm Cordyceps militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả th và
0,06% trong sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả th có hàm
lượng cao gấp 3 l n so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) (Hyun et al, 2008).
Polysaccharide: Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ
nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành ph n từ các đơn phân là các
đường monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai
loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và
tác dụng này tăng lên khi tăng li u d ng chiết xuất. Yan và cộng sự cho rằng tác
dụng này có th do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm
(Yan et al, 2008)

7
1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở
Việt Nam và trên thế giới
1.2.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
trên thế giới
Các công trình nghiên cứu trên thế giới v loại nấm này chứng minh được
công dụng vượt trội của nấm đông tr ng hạ thảo là một nguồn dược liệu quý.
Nh ng năm g n đây, rất nhi u tính chất dược lý của loài nấm này được nghiên cứu
một cánh khoa học và đã được công bố trên các tạp ch chuyên ngành như:
Năm 2004, Yoo H.S và cs công bố: Dịch chiết từ th quả Cordyceps militaris
có tác dụng chống ung thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch
rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu
mới bằng cách giảm sự bi u hiện của bFGF, một trong nh ng nhân tố kích thích
quá trình này. Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có th
ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát tri n của tế bào ung thư. Ngoài ra, dịch
chiết nấm Đông tr ng hạ thảo còn có tác dụng kìm hãm sự phát tri n của tế bào ung
thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J. và cs, 2001). Mặt khác, dịch chiết bằng nước ấm
nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm hãm sự phát tri n của dòng tế bào ung thư
máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt
hoá enzym caspase-3 (Lee H. Và cs, 2006).
Năm 2005, công trình nghiên cứu của Won S.Y và Park E.H. cho thấy
Cordyceps militaris có tác dụng chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy. Ahn Y.J.
và cs (2000) cho rằng nấm Đông tr ng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm
hãm sự phát tri n của một số virut, vi khuẩn và nấm. Ngoài ra nấm Đông tr ng hạ
thảo Cordyceps militaris còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipit, lipoprotein
và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004).
Vì vậy, việc nuôi trồng loài nấm quý hiếm này đã được các nhà khoa học
trên thế giới nghiên cứu từ quy mô phòng thí nghiệm thu sinh khối sợi nấm, tới quy
mô lớn hơn là thu quả th nấm.
Nuôi trồng quả th nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris được tiến
hành ở nhi u nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ... Tại

8
Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh:
Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô... Chỉ tính một trang trại
nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được
100000 kg sản phẩm. Sản phẩm nấm đông tr ng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã
có mặt ở nhi u nước trên thế giới k cả các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận
cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm (Phạm Quang Thu, 2013).
Patcharaporn Wongsa (2005) tại Thái Lan đã nghiên cứu phân lập và sự sinh
trưởng của hệ sợi, hình thành bào t chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký sinh
kiến. Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract
Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract
Agar) được d ng đ phân lập và nuôi cấy hệ sợi.
Tại Hàn Quốc, Jae Sung Kim và cs (2006), đã s dụng nhộng tằm đ nuôi
trồng th quả nấm Cordyceps militaris. Nhộng tằm được đựng trong các lọ nuôi cấy,
kh trùng ở 12o
C trong thời gian 90 phút, đ nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi
nấm ăn k n toàn bộ giá th trong đi u kiện nhiệt độ 20-250
C, cường độ ánh sáng
500-700 lux đã hình thành m m th quả. Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được
các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành ph n như sau: 40
g/l t đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít
K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. Duck-Hyun Cho và cs (2003), đã tiến
hành nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là CHO-7208;
CHO-7845; CHO-7846 của loài Cordyceps militaris trên môi trường dinh dưỡng
và quá trình hình thành th quả nấm Cordyceps militaris với giá th là sâu non loài
Allomyrina dichotoma Linnaeus. Kết quả cho thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của
các chủng khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thu n khiết. Chỉ có 2 chủng CHO-
7208 và CHO-7846 hình thành th quả khi s dụng sâu non Allomyrina dichotoma
Linnaeus làm giá th . Chi u dài của th quả đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy.
Tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty công nghệ sinh học
BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp loài nấm Cordyceps militaris. Sản
phẩm được tiêu thụ trong nước và thị trường quốc tế.

9
1.2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở
Việt Nam.
Các công trình nghiên cứu v nuôi cấy đông tr ng hạ thảo Cordyceps
militaris ở Việt Nam chưa nhi u và chưa có hệ thống. Một số ít các nghiên cứu
được tiến hành nhưng cũng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu v sự sinh trưởng của
hệ sợi hoặc nghiên cứu tạo quả th ở mức độ th nghiệm.
Đ tài: “Nghiên cứu đặc đi m sinh học hệ sợi trong nuôi cấy thu n khiết các
chủng nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris (L.Fr) Link.” của Phạm Quang
Thu và cs (2011) chỉ ra rằng: Đặc đi m sinh học của nấm Cordyceps militaris bao
gồm đặc đi m sinh trưởng, loại môi trường dinh dưỡng, pH của môi trường, nhiệt
độ và ẩm độ không khí tối ưu cho sự phát tri n của nấm đã được nghiên cứu. Kết
quả chỉ ra rằng 8 chủng nấm Cordyceps militaris gồm 4 chủng thu thập ở Việt
Nam, 3 chủng sưu t m từ Nhật và 1 chủng ở Trung Quốc, tất cả đ u sinh trưởng
bình thường trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong đó 4 chủng sinh trưởng
nhanh bao gồm chủng HL2, chủng CM, chủng F1010 và chủng F1080 với tốc độ
l n lượt là 104,66; 122,02; 107,64; 105,08 μm/giờ, 4/8 chủng nấm
sinhtrưởng chậm là chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 và chủng F1012 với
tốc độ sinh trưởng đạt 69,95; 71,92; 79,37 và 80,36 μm/giờ. Các đặc đi m nuôi cấy
cho sự phát tri n tối ưu của hệ sợi được xác định là môi trường dinh dưỡng là PDA
có bổ sung thêm 10% nhộng tằm, nhiệt độ không khí thích hợp nhất là từ 20 - 25o
C,
một số chủng như HL2 và chủng F1012 cho sinh trưởng nhanh ở cả nhiệt độ thấp
15o
C.Độ ẩm trong không khí trong khoảng 80 - 85%, và môi trường pH là axit từ
4,5 - 6,5.
“Nghiên cứu thành ph n loài nấm Đông tr ng hạ thảo tại Vườn Quốc gia
Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai” của Tr n Văn Tú (2011) cho thấy: Tại
Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Huyện Sa Pa Tỉnh Lào Cai, tác giả đã phát hiện, thu
hái, giám định và phân lập được 8 loài nấm Đông tr ng hạ thảo, k sinh trên 3 bộ
côn tr ng khác nhau: Cordyceps militaris, Cordyceps nutans, Cordyceps crinalis,
Cordyceps formosana, Cordyceps pseudomilitaris Beauveriabassiana,
Isariafarinosa, Isaria tenuipes, Trong đó có 2 loài nấm Cordyceps formosana và

10
Cordyceps pseudomilitaris l n đ u tiên được mô tả ở Việt Nam. Thành ph n loài
nấm ĐTHT thu được trên địa bàn khu vực nghiên cứu khá đa dạng, với 8 loài khác
nhau. Nấm phân bố trên nhi u loại hình rừng, độ cao, độ tàn che khác nhau, tập
trung chủ yếu ở: rừng tự nhiên, có độ cao từ 1500- trên 2000m và độ tàn che > 0,5.
Các loài nấm ĐTHT thu được tại khu vực nghiên cứu khá đa dạng v giá trị thương
mại, dược liệu, công nghiệp. Đặc biệt là giá trị dược liệu, đáng k nhất là 5 loài nấm
ĐTHT thuộc chi nấm Cordyceps và nấm Isaria tenuipes, Isaria farinosa là 2 loài
nấm ở giai đoạn vô t nh của chi nấm Cordyceps.
Năm 2011, Tô Quang Huyên và Lê Thị Xuân tiến hành đi u tra thành ph n
nấm k sinh côn tr ng tại khu rừng di t ch lịch s cảnh quan môi trường Mường
Phăng huyện Điện Biên tỉnh Điện Biên. Kết quả đi u tra từ tháng 4 đến tháng 8 thu
được 7 loài nấm khác nhau bao gồm 6 loài thuộc chi Cordyceps và 1 loài thuộc chi
Beauveria. Loài có t n suất b t gặp nhi u nhất tại khu vực đi u tra là C. nutans với
t n suất xuất hiện 96,40%, loài Beauveria bassiana với t n suất 1,35% các loài c n
lại mỗi loài chỉ chiếm 0,45%.
Ngoài ra, có một số đ tài đã đánh giá ảnh hưởng của đi u hiện nuôi trồng
đến khả năng hình thành quả th như:
Công trình nghiên cứu của Đỗ Tuấn Bách và cs (2017) chỉ ra rằng khi s
dụng giá th gạo lứt với dung dịch dinh dưỡng tối ưu thu được gồm glucose 40 g/L,
peptone 5 g/L, MgSO4.7H2O 1,5g/L, K2HPO4 1,5 g/L, NAA 1 mg/L, bột nhộng tằm
3%. Đi u kiện nhiệt độ duy trì ở mức 12h chiếu sáng ở 250
C-12h tối ở 200
C. Quả
th nuôi trồng trên môi trường tối ưu có hàm lượng cordycepin đạt 4,33±0,08 mg/g
khô, cho thấy ti m năng ứng dụng quy trình trên quy mô công nghiệp.
1.3. Các phƣơng pháp định danh nấm
1.3.1. Phương pháp định danh thông qua hình thái
S dụng phương pháp truy n thống đ định danh thường dựa vào các chỉ tiệu
phân loại như: đặc đi m hình thái, sinh l , đặc đi m biến dưỡng năng lượng. Trong
đó các th nghiệm đ xác định các đặc đi m sinh l , sinh hóa là các chỉ tiêu quan
trọng nhất.
 Sử dụng khóa phân loại
Thông thường đ định danh theo phương thức truy n thống, người ta thường

11
dựa vào các khóa phân loại. Riêng đối với nấm men việc định danh theo phương
thức truy n thống rất phức tạp. Từ trước đến nay có rất nhi u khóa phân loại nấm
men của nhi u tác giả khác nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men
đ u tiên. Trong khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau
Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh s a khóa
phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện.
Đến năm 1952, J. Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá
hoàn thiện vấn đ phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J.
Lodder and N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952, the yeast, a taxonomic study, North
Holland, Pub Co. Amsterdam), được xuất bản l n thứ hai năm 1957. Năm 1970, J.
Lodder bổ sung s a ch a lại và in tái bản l n thứ nhất năm 1970, l n thứ hai 1971.
Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng
nhất hiện nay trên thế giới. Hệ thống phân loại này dựa trên ki u phân chia tế bào,
hình thái bào t nang và đã xác định 349 loài nấm men thuộc 39 chi khác nhau.
 Sử dụng phương pháp số học
Ngoài ra, dựa vào nh ng thông tin v đặc đi m của nấm, người ta c n có th
tính hệ số tương đồng đ đánh giá mức độ tương đồng gi a các chủng nấm với
nhau. Trong đó hệ số Jaccard được s dụng đ so sánh mức độ tương đồng gi a hai
chủng khi muốn bỏ qua các đặc đi m mà cả hai chủng đ u thiếu.
1.3.2. Phương pháp định danh bằng phân tử
Ngày nay, sự phát tri n của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân
loại, định danh nấm lên một bước phát tri n mới. Phương pháp hiện đại trong định
danh nấm dựa trên vật liệu di truy n có th cho kết quả ch nh xác trong một thời
gian ng n. Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đ i hỏi phải có trang
thiết bị hiện đại và hóa chất đ t ti n.
Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân t sinh học có th
là “tài liệu của lịch s tiến hóa”, là “thước đo tiến hóa”.
Phân t rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình
tự đoạn D1/D2 26S rRNA và v ng ITS 5.8S rRNA được s dụng phổ biến đ xây
dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ h u ch trong phân loại và định danh.

12
Ngoài đặc đi m là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân
t rRNA 16S c n có ưu đi m là có nhi u bản sao trong tế bào, có t nh bảo tồn cao
nhưng v n có nh ng v ng trình tự khác biệt gi a các loài và trình tự đặc trưng cho
từng nhóm; đặc biệt là th ch hợp với mục tiêu phân loại nhờ 16 có k ch thước vừa
phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự.
Phương pháp hiện đại d ng đ định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào
trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được s
dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có t nh b n cao hơn RNA.
Một số phương pháp phân loại dựa vào vật liệu di truy n đang được s dụng
hiện nay:
 Sử dụng mẫu d kết hợp với phương pháp lai in-situ phát huỳnh quang
(Fluorescence in-situ Hybridazation - FISH)
M u dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid
nucleic (DNA) được g n với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh
quang, d ng đ nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một
chủng đã biết trước.
Phân tích d liệu các trình tự SSU rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ
cho phép xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự
nhận diện cho một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm ch một giống,
một loài cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhi u trình tự tương tự được xác
định và sẽ rất h u dụng trong việc nhận diện và định danh.
Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho sinh vật có th được tổng hợp, đánh
dấu bằng chất phát huỳnh quang và d ng đ phát hiện chuyên biệt các giới này. Các
m u d này được gọi là “m u d phát sinh chủng loại” (phylogenic prode).
Bằng việc x lý m u bằng một tác nhân th ch hợp làm tăng t nh thấm của
màng, cho phép m u dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân t
(lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào m u), và quan sát dưới k nh hi n vi huỳnh
quang, người ta có th xác định trực tiếp chủng thu n thuộc giới nào hay qu n xã
sinh vật hiện diện trong một m u tự nhiên gồm nh ng giới nào. Kỹ thuật lai và phát

13
hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH).
 Phương pháp lai nucleic acid
Thành ph n base của DNA chỉ có tác dụng chứng minh các chủng là không
có liên hệ với nhau. Tỷ lệ các base trong DNA có th thay đổi trong phạm vi rất
rộng. Nếu hai chủng có thành ph n base khác nhau thì chúng không có liên hệ với
nhau. Tuy nhiên, hai chủng có c ng thành ph n base chưa hẳn là có quan hệ với
nhau do trình tự base có th khác nhau. Việc lai gi a các DNA của hai chủng cho
phép định danh một loài mới hoặc xác định mối quan hệ đến mức giống và loài gi a
hai vi khuẩn.
Đ xác định mối quan hệ gi a các chủng, thông thường người ta so sánh
ph n trăm lai (DNA-DNA) gi a chủng c n khảo sát với một chủng đã biết (chủng
chuẩn). DNA từ chủng chuẩn được ly tr ch, tinh chế, đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ, phân đoạn thành nh ng đoạn ng n có chi u dài ng u nhiên, đun nóng đ tách
mạch. DNA từ các chủng được khảo sát cũng được chuẩn bị tương tự nhưng không
được đánh dấu. Tiến hành lai m u DNA chủng chuẩn với nhau (đối chứng). Sau đó
tu n tự lai DNA chủng chuẩn với DNA chủng c n khảo sát. Thu lấy DNA mạch kép
(có lai), loại bỏ DNA mạch đơn. Đo năng lượng phóng xạ của trường hợp đối
chứng. Lượng này được xem là tương đương 100% lai. Tương tự t nh năng lượng
phóng xạ thu được từ các trường hợp lai gi a chủng chuẩn với chủng được khảo sát.
Tính ph n trăm lai.
Từ số liệu v mức độ lai có th xác định mối tương quan gi a các chủng
như sau:
Trên 70% lai: 2 chủng c ng loài (khác chủng)
Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (khác loài)
Dưới 10% lai: 2 chủng khác giống
Lai nucleic acid dựa vào nguyên t c bổ sung gi a các base A-T và G-C. Các
đoạn polynuclotide đơn có nguồn gốc khác nhau nhưng có cấu trúc bổ sung với
nhau thì chúng có th b t cặp với nhau tạo ra phân t lai.
Một số phương pháp lai nucleic acid thường được s dụng:
- Phương pháp lai Southern Blot

14
- Kỹ thuật đa hình chi u dài các đoạn c t giới hạn (Rectriction Fragment
Length polymorphism – RFLP) hay phương pháp dấu vân tay (Finger Printing)
- Phương pháp lai Northern Blot
 Khuếch đại trình tự đặc hiệu nhờ phương pháp PCR (Polymerase Chain
Reaction)
Trước khi giải trình tự đoạn gen mong muốn, thì ta c n khuếch đại chúng
bằng phương pháp PCR. PCR là một phương pháp in vitro đ tổng hợp DNA từ
mạch khuôn là một trình tự đ ch DNA ban đ u, khuếch đại, nhân số lượng bản sao
của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và
một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và ctv
(Mỹ) phát minh năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được s dụng rộng rãi đ phát
hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các m m bệnh vi sinh
vật có trong thực phẩm.
Tất cả các DNA polymerase đ u c n nh ng mồi chuyên biệt đ tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc gen quy
định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của sinh vật này. Mồi là nh ng đoạn
DNA ng n, có khả năng b t cặp bổ sung với một đ u của mạch khuôn và nhờ hoạt
động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài đ hình thành mạch mới.
Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt b t cặp bổ sung với hai đ u của một
trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở đi u kiện đảm bảo hoạt động của DNA
polymerase, đoạn DNA nằm gi a hai mồi sẽ được khuếch đại thành một số lượng
lớn bản sao đến mức có th thấy được sau khi nhuộm bằng ethibium bromide. Kỹ
thuật PCR được coi là n n tảng của nhi u kỹ thuật phân t ch DNA.
 Giải trình tự các gen mã hóa cho tiểu phần rRNA 16S
Muốn nghhiên cứu trình tự các nucleotide của một gen, một đoạn DNA, hoặc
cả phân đoạn DNA c n phải tiến hành giải trình tự. Một số phương pháp giải trình
tự thường dùng hiện nay:
Phương pháp hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert, 1977): Các đoạn

15
DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ở d u 5 , và được x lý bằng các chất
hóa học nhằm b gãy các đoạn DNA tại các vị tr các base khác nhau.
Phương pháp dideoxy (Phương pháp Sanger,1977): dựa trên hoạt động của
enzyme DNA Polymerase xúc tác phản ứng kéo dài chuỗi polynucleotide, và dừng
lại khi gặp các dideoxynucleotide (ddNTP).
Giải trình tự DNA tự động: Dựa vào sự phát t n hiệu huỳnh quang từ nh ng
dNTP được đánh dấu. Ngoài ra, g n đây hai kỹ thuật mới được thiết lập cũng được
s dụng đ định danh sinh vật dựa trên vật liệu di truy n là Ribotyping và FAME
(Fatty Acid Methyl Ester).
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Đông
trùng hạ thảo Cordyceps militaris.
1.4.1. Yếu tố giống
Bản chất của giống sẽ quyết định đến khả năng sinh trưởng phát tri n của
giống. Một giống khỏe sẽ sinh trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác
nhau và khả năng hình thành và phát tri n quả th tốt. Mỗi 1 giống lại được xác
định 1 thời gian s dụng nhất định. Vượt qua thời gian này giá trị s dụng của giống
sẽ giảm, sức sinh trưởng của giống sẽ giảm, giống bị suy thoái. Thoái hóa giống
đang được xác định là một trong nh ng vấn đ tồn tại lớn nhất trong nuôi trồng
ĐTHT hiện nay. Một số dấu hiệu của các giống ĐTHT bị thoái hóa gồm: Giảm tỷ lệ
sinh trưởng, mật độ sợi thấp, thay đổi màu s c quả th , năng suất thấp, hình dạng và
k ch thước của quả th bị biến dạng.
1.4.2. Yếu tố dinh dưỡng
a) Nguồn dinh dưỡng Cacbon
Nấm yêu c u một lượng lớn cacbon trong quá trình sinh trưởng và phát dục.
Dinh dưỡng cacbon cung cấp vật chất cho các quá trình sinh tổng hợp các chất cung
cấp năng lượng cho các hoạt động của tế bào. Hàm lượng cacbon chiếm khoảng
50% trọng lượng khô của quả th nấm. Nguồn cacbon thích hợp cho sợi nấm phát
tri n gồm các monosacharide và polysacharide….Nấm có sự phân biệt khác nhau
rất lớn trong khả năng s dụng các nguồn cacbon (Trịnh Tam Kiệt, 2012). Nh ng
nghiên cứu đã công bố cho thấy nh ng nguồn cacbon có th s dụng đ nuôi trồng

16
nấm ĐTHT là các loại đường, tinh bột… trong đó th ch hợp nhất là nh ng loại có
cấu trúc phân t nhỏ (Shrestha et al., 2012).
b) Nguồn dinh dưỡng nito
Nito là nguyên tố b t buộc đ tổng hợp acid nucleic và protein cấu trúc nên
tế bào. Dinh dưỡng nito có th được lấy từ nguồn nito h u cơ tự nhiên, nguồn nito
tổng hợp, nguồn nitơ vô cơ là các muối nitrat hay muối amoni.
Gao et al. (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu c u hàm lượng nito
tương đối thấp. Nếu hàm lượng nitơ quá nhi u trong môi trường sẽ làm chậm quá
trình biệt hóa đ hình thành quả th . Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ
C/N vào khoảng 4/1 - 6/1 là thích hợp, giai đoạn sinh trưởng sinh thực tỷ lệ thích
hợp từ 10/1 - 15/1. Đi u đó l giải vì sao sản lượng ĐTHT trên côn tr ng thấp hơn
trên ngũ cốc.
c) Nguồn dinh dưỡng khoáng
Một số muối khoáng như K+, Mg2+ và Ca2+ ở nồng độ 0,1 g/l có th làm
tăng năng suất quả th . Một vài nguyên tố có th làm tăng hoạt chất sinh học của
Cordyceps militaris (Dong et al., 2012).
d) Vitamin
Vitamin có vai trò trong chu kỳ phát dục của Đông tr ng hạ thảo Cordyceps
militaris. Tuy nhiên ĐTHT không có khả năng tổng hợp vitamin c n thiết, vì vậy
trong nuôi trồng người ta thường bổ sung thêm một hàm lượng vitamin nhất định.
e) Hormon
Hormones tác động tới hình thái di truy n và sự phát tri n trong nuôi cấy
mô tế bào thực vật. Hormon được xác định là nhân tố môi trường làm thay đổi
giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng đến giai đoạn sinh sản của nấm. Một số
hormones thực vật như 2, 4-D, citric acid triamine, colchicines và các hormones
khác có th làm tăng k ch th ch quá trình hình thành quả th của ĐTHT (Wang et
al., 2010; Xiao et al., 2010).
f) p môi trường
Đông tr ng hạ thảo là loài nấm có xu tính acid, sợi nấm có th phát tri n ở

17
giá trị pH 6 - 7, ở giá trị pH thấp 3 - 4 hệ sợi nấm phát tri n chậm. Giá trị pH tối ưu
cho sự phát tri n của sợi nấm ĐTHT là 6 (Park et al., 2001; Sung et al., 2002).
1.4.3. Các yếu tố môi trường
a) Nhiệt độ
Nhiệt độ là đi u kiện quan trọng đ nấm ĐTHT sinh trưởng và phát dục.
Nấm ĐTHT thích hợp với các vùng có nhiệt độ trung bình. Nhiệt độ thích hợp cho
sinh trưởng hệ sợi và sinh tổng hợp cordycepin là 18 - 20o
C và ở nhiệt độ trên 30oC
cả tăng trưởng của hệ sợi nấm và sản xuất cordycepin đ u ngừng lại (Hung et al.,
2009).
b) Độ ẩm và sự trao đổi không khí
Độ ẩm cao 70 - 90% phù hợp cho hình thành quả th nấm ĐTHT. Độ ẩm
thấp là nguyên nhân d n đến môi trường nuôi cấy khô nhanh. Sự trao đổi khí cao
trong môi trường nuôi cấy phù hợp cho sự sinh trưởng sợi, hình thành m m quả th
và năng suất sinh khối (Zhang et al., 2010).
c) Ánh sáng
Theo Trịnh Tam Kiệt (2012) ánh sáng có ảnh hưởng tới sinh trưởng phát
tri n của h u hết các loại nấm. Đối với nấm Cordyceps militaris, ánh sáng có nh ng
ảnh hưởng đặc biệt quyết định đến chu kỳ sinh trưởng, khả năng hình thành và phát
tri n quả th nấm. Ánh sáng ảnh hưởng tới chu kỳ phát tri n của nấm ĐTHT thảo ở
các mặt: Thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và loại ánh sáng. Nghiên cứu
của Chen et al. (2011) cho thấy ánh sáng thích hợp nhất cho sự phát tri n của quả
th nấm ĐTHT là 12 giờ chiếu sáng/12 giờ tối với cường độ chiếu sáng 600 ± 20
lux. Thời gian chiếu sáng dài không có lợi cho sự phát tri n của Cordyceps militaris
và giảm hàm lượng cordycepin.

18
Phần 2.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu tổng quát
Xây dựng được quy trình phân lập giống và nhân nuôi các chủng giống
Cordyceps militaris bản địa của Việt Nam.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Thu thập và định danh loài nấmCordyceps militaris bằng chỉ thị phân t .
- Xác định được kỹ thuật phân lập giống gốc nấmCordyceps militaris
- Xác định được kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấmCordyceps militaris.
- Xác định được kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp ph hợp với
Cordyceps militaris bản địa.
2.2. Đối tƣợng, phạm vi và nội dung nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu:Đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris được thu
thập tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên - Lào Cai.
- Phạm vi nghiên cứu:
+ Phạm vi về nội dung: nghiên cứu phân lập, nhân giống và nuôi trồng
các chủng giống Cordyceps militaris được thu thập tại Vườn Quốc gia Hoàng
Liên - Lào Cai.
+ Phạm vi về không gian: Nghiên cứu tại Công ty Cổ ph n dược thảo Thiên Phúc.
+ Phạm vi về thời gian: từ tháng 5/2019 đến tháng 5/2020.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris thu thập được;
- Nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris;
- Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp 1 và nhân giống cấp 2 nấm
Cordyceps militaris.
- Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp ph hợp với
Cordyceps militaris bản địa.

19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sơ đồ tổng quát các phương pháp thực hiện cho các nội dung nghiên
cứu như sau:
2.3.1. Phương pháp thu thập và định danh loài nấmCordyceps militaris.
(1) Phương pháp thu thập nấm Cordyceps militaris ngoài tự nhiên
a) Chuẩn bị:
- Thu thập số liệu chung v vị tr địa l , đi u kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội
các xã nằm trong phạm vi khu vực nghiên cứu, các tài liệu, báo cáo, nghiên cứu
khoa học... v các khu vực các vùng mi n và các Vườn Quốc Gia, các tài liệu v
nấm Đông tr ng hạ thảo và nh ng vấn đ có liên quan đên lĩnh vực nghiên cứu.
- Chuẩn bị bản đồ, máy ảnh, máy định vị và các dụng cụ phục vụ cho đi u
tra và thu hái nấm.
- Thời gian ủ tối
- Quan sát đặc đi m hệ
sợi sau ủ tối
Quả th nấm C.militaris ngoài
tự nhiên
Hệ sợi C.militaris sau khi phân
lập
Hệ sợi C.militaris sau khi nhân
giống cấp 1
Sinh khối hệ sợi sau nhân
giống cấp 2
Phâ
n lập
- Đo đường kính khuẩn lạc
- Quan sát đặc đi m hệ sợi
Nhân
giống
cấp 1
- Đo đường kính khuẩn
lạc
Nhân
giống
cấp 2
- Đo đường kính khuẩn
lạc
- Khối lượng sinh khối
hệ sợi
- SLKL/10ml dịch
sợi
Hộp cơ chất tổng hợp đã cấy
giống và ủ tối
Cấy
giống, ủ
Quả th nấm
C.militaris
Nuôi
trồng tạo
quả th
- Thời gian ra quả th
- Khối lượng quả th
- K ch thước quả th
- Màu s c quả th

20
- N m và phân loại các trạng thái, loại hình rừng hiện có trong khu vực
nghiên cứu.
- Xác định hệ thống tuyến, địa đi m đi u tra, trên cơ sở các tài liệu v đặc
đi m sinh vật học, sinh thái học của nấm như: m a vụ sinh trưởng; vị trí nấm
thường mọc, độ cao, độ ẩm, độ tàn che…
b) Điều tra ngoại nghiệp
Đi u tra được tiến hành vào các tháng m a mưa (từ tháng 5 đến tháng 8).
Khảo sát thu m u được thực hiện trên các tuyến đi u tra ngoài thực địa qua các
dạng địa hình, các dạng thực bì trong khu vực nghiên cứu. Các tuyến đi u tra được
thiết kế đi men theo rìa suối, dọc theo khe, suối cạn và đường mòn hoặc dông núi từ
dưới thấp lên cao và ngược lại. Trên tuyến đi u tra cứ 20 -30 (m) tiến hành 1 đi m
đi u tra, hoặc phát hiện địa đi m có đi u kiện thuận lợi cho nấm đông tr ng hạthảo
phát tri n thì tiến hành khoanh v ng và đi u tra tỷ mỷ. Tại các đi m đi u tra tiến
hành đi u tra kỹ ph a dưới thân cây đổ, dưới lớp lá mục và các khoảng đất trống
trong rừng. Phát hiện được m u nấm tiến hành đào thu m u nấm k cả côn trùng bị
ký sinh còn d nh; đánh số hiệu, chụp ảnh, đo đếm k ch thước mô tả đặc đi m hình
thái của nấm, côn trùng bị k sinh và các đặc đi m của địa đi m thu m u…
Các khu vực thu thập có sự khác biệt nhau v độ cao. Độ cao là yếu tố quyết
định đến ki u khí hậu và thực vật. Theo các tài liệu của các nhà khoa học trên thế
giới cho thấy nấm ĐTHT thường xuất hiện ở độ cao trên 1000m. Đây là độ cao lí
tưởng cho nấm sinh trưởng và phát tri n. Vườn Quốc Gia Hoàng Liên nằm ở núi
cao, có ki u khí hậu và thảm thực vật khác nhi u so với các khu vực khác. Với độ
cao trung bình 1.500m- 2500m so với mặt nước bi n, vì vậy thành ph n loài nấm
ĐTHT rất khác so với các VQG và Khu Bảo tồn thiên nhiên khác của Việt Nam.
M u nấm sau khi thu hái, được bọc trong lá cây hoặc giấy khô, m m, tránh
không làm tổn thương đến nấm và bỏ vào ống fancol bảo quản trong th ng đựng đá
đưa v phòng thí nghiệm đ giám định, nghiên cứu các đặc đi m giải ph u, bào t
và phân lập thu n khiết nấm.
(2) Phương pháp định danh loài nấm Cordyceps militaris bằng phân tử.
a) Phương pháp tách DNA tổng số
1. Nghi n 0,2g m u bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo ra bột
thật mịn, sau đó chuy n ngay vào ống eppendorf 2ml, gi trong đá.

21
2. Bổ sung 800 l đệm chiết, l c đ u và ủ ở 65o
C trong 1 giờ (cứ 15 phút đảo
đ u 1 l n).
3. Gi m u ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
4. Bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào m u, l c đ u và
gi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
5. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4o
C.
6. Dùng pipet hút chuy n dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml.
7. Bổ sung một th t ch tương đương Isopropanol tuyệt đối (lạnh) và đảo
nhẹ, gi m u trong đá 30 phút.
8. Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4o
C.
9. Loại dịch nổi, r a DNA bằng cách thêm 500 l cồn 70%, ly tâm 12000
vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4o
C sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol
10. Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không
11. Hoà tan trong 100 l H2O kh ion.
12. Sau khi DNA được hoà tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l RNase
(10mg/ml). Gi sản phẩm ở 37o
C trong thời gian 1 giờ.
13. Điện di ki m tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.
b) Phương pháp PCR s dụng cặp mồi đặc hiệu
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi ITS2 và ITS5 có trình tự:
ITS2 (5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)
ITS5 (5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3')
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước deion kh trùng 6
2 Maste mix 10
3 Template (100ng/µl) 2
4 Mồi F 10 pmol 1
5 Mồi R 10 pmol 1
Tổng 20

22
c) Phương pháp giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự:
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2,0% và tinh sạch bằng
QiAquick gel extraction kit (Qiagen, Đức). Sản phẩm này được s dụng làm khuôn
cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chi u (mồi xuôi và mồi ngược).S dụng
BigDye terminator cycler v3.1 và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3500 XL (Applied
Biosystems, Mỹ). Trình tự nucleotide của các chủng nấm được so sánh với các trình
tự đã có trên Genbank, s dụng ph n m m BLAST trong NCBI (website
http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Trình tự DNA sau khi đọc được hiệu chỉnh
bằng m t với sự trợ giúp của ph n m m ChromasPro1.7.6 đ loại bỏ các vùng tín
hiệu nhiễu. Các trình tự phân t ch được s p xếp thẳng hàng bằng ph n m m Bioedit
v7.0.5.2, Clustal W, geneDoc Các vùng không có khả năng s p xếp bị loại bỏ trước
khi phân tích.
Thành phần
Chiều
F
Chiều
R
BigDye™ Terminator 3.1
Ready Reaction Mi
4 µL 4 µL
Forward primer (3,2 pmol) 1µL -
Reverse primer (3,2 pmol) - 1µL
Nước 4 µL 4 µL
Sản phẩm PCR 1µL 1µL
Tổng cộng 10 µL 10 µL
Đ xây dựng cây tiến hóa, xác định quan hệ di truy n bằng phương pháp
Maximum Likehood, d liệu DNA được chuy n vào ph n m m Mega 6.0.6
(Tamura et al., 2013) và chúng được thực hiện với 1.000 l n lặp lại đ xác định giá
trị ủng hộ (bootstrap).
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps
militaris
M u quả th sau khi thu thập ngoài tự nhiên sẽ được đưa v phòng thí
nghiệm Công Ty Cổ Ph n Dược Thảo Thiên Phúc, tại đây chúng tôi tiến hành phân
lập giống thu n. Nuôi cấy trong đĩa petri chứa môi trường cơ bản PGA ở nhiệt độ
phòng. Theo dõi và thống kê các chỉ tiêu: tỷ lệ m u sạch, tỷ lệ m u sạch tái sinh và
đo đường kính khuẩn lạc sau các ngày nuôi m u.

23
Phương pháp phân lập m u:
Kh tr ng m u: Cho m u vào ống fancol, d ng cồn 70% l c trong 1 phút.
Tiếp theo, d ng kháng sinh cefotaxim l c m u trong 2-3 phút (t y vào k ch thước
m u). Sau mỗi l n l c với cồn và kháng sinh l c lại với nước cất vô tr ng 2-3 l n đ
loại bỏ cồn và kháng sinh c n lại trên quả th nấm. D ng giấy thấm đ thấm khô b
mặt sau đó bóc bỏ lớp vỏ quả th ngoài của quả th nấm bằng dao mổ và panh
C t m u: D ng dao mổ, c t ngang quả th thành các mảnh nhỏ có k ch thước
1,5-2mm;
Cấy m u: M u được cấy vào các đĩa petri có chứa môi trường PGA, mỗi đĩa
cấy 1 m u. Trên mỗi đĩa petri có ghi tên m u và ngày phân lập. Sau khi cấy, d ng
parafilm hàn k n miệng đĩa đ gi m u luôn trong đi u kiện vô tr ng.
Nuôi m u: M u được nuôi trong đi u kiện không có ánh sáng trong 15 ngày
trên các giàn giá nuôi trồng
2.3.3. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm
Cordyceps militaris.
Phương pháp nhân giống cấp 1:
Cấy giống vào môi trường nghiên cứu bằng phương pháp cấy chấm đi m và
đưa đi nuôi ở đi u kiện khác nhau trong 7,10,15 ngày, không có ánh sáng.
Phương pháp cấy chấm đi m được thực hiện như sau: d ng pank lấy một
lượng t sợi nấm từ nh ng đĩa peptri đã được phân lập ở trên cấy vào môi trường đã
chuẩn bị. Trên mỗi đĩa petri có ghi tên m u và ngày nhân giống. Sau khi cấy, d ng
parafilm hàn k n miệng đĩa đ gi m u luôn trong đi u kiện vô tr ng.
Sau 7,10,15 ngày tiến hành chọn các chủng giống có hệ sợi đ u đẹp khuẩn lạc đạt
đường kính 20mm trở lên, hệ sợi có màu tr ng, phát tri n đồng đ u v đường kính
khuẩn lạc đ làm vật liệu cho quá trình nhân giống cấp 2.
2.3.3.1. Nhân giống cấp 1 trên môi trường thạch
a) Nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng đến khả năng sinh
trƣởng của hệ sợi
Tiến hành cấy chấm đi m các m u trên 3 môi trường khác nhau: PDA,
Hansen, Czapek-Dox, đi u chỉnh pH bằng 7, nuôi cấy ở 25o
C, độ ẩm 80%, không
chiếu sáng. Theo dõi sự sinh trưởng của hệ sợi thông qua việc đo khuẩn lạc các m u
sau 7, 10, 15 ngày.

24
b) Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng hệ sợi
Nhiệt độ là một trong các đi u kiện môi trường quan trọng ảnh hưởng đến
sinh trưởng của vi sinh vật. Thí nghiệm tiến hành nuôi cấy nấm trong các thang
nhiệt độ khác nhau 20o
C, 25o
C và 30o
C. Tiến hành cấy chấm đi m các m u nấm
Cordyceps militaris, đem nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau, c ng đi u kiện độ
ẩm và ánh sáng. Xác định sự sinh trưởng của hệ sợi thông qua việc đo đường kính
sinh trưởng của khuẩn lạc sau 7, 10, 15 ngày.
2.3.3.2. Nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng
a) Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng tạo
sinh khối nấm trong môi trường dịch lỏng
Vật liệu nuôi cấy là hệ sợi nấm thu được từ các thí nghiệm trên. Thí nghiệm
được bố trí với các công thức môi trường khác nhau kí hiệu l n lượt là:
M1: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm
men + 3g/l Pepton
men + 5g/l Pepton
men + 7g/l Pepton
Tiến hành nuôi l c ở tốc độ 150 v ng/phút, c ng đi u kiện nhiệt độ, độ ẩm.
Sau 7 ngày nuôi l c dịch, quan sát đặc đi m hệ sợi nấm và thu thập số liệu.
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng tạo sinh khối nấm
trong môi trường dịch lỏng
Vật liệu nuôi cấy là hệ sợi nấm thu được từ các thí nghiệm trên. Môi trường
nuôi cấy là s dụng môi trường vừa nghiên cứu ở thí trên. Thí nghiệm được bố trí
trong c ng đi u kiện nhiệt độ, độ ẩm, và tốc độ l c thay đổi từ 100 - 200 vòng/phút.
Sau 7 ngày nuôi l c dịch, quan sát đặc đi m hệ sợi nấm và thu thập số liệu.
2.3.4. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp phù
hợp với Cordyceps militaris bản địa.
a) Ảnh hưởng của nguồn C
Đ xác định được nguồn Cacbon tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri n của
quả th , chúng tôi đã tiến hành th nghiệm trên 3 loại môi trường với hàm lượng
Glucose thay đổi: 20g, 25g, 30g. Sau đó chọn ra môi trường tối ưu nhất.

25
Chuẩn bị 30 hộp cho mỗi loại môi trường với thành ph n các chất được phối
trộn theo bảng 2.1 dưới đây.
Các lọ được bao k n, đem kh tr ng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1000
C trong thời
gian 3h. Sau khi kh tr ng môi trường được làm nguội tự nhiên rồi mới cấy giống.
S dụng phương thức cấy đa đi m giống sản xuất ở cả 3 loại môi trường.
Quan sát so sánh và ghi lại kết quả v tốc độ sinh trưởng hệ sợi và thời gian
hình thành quả th ở cả 2 loại môi trường đ xác định môi trường tối ưu.
Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số
lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.
Bảng 2.2. Công thức phối trộn 3 loại môi trƣờng nuôi cấy sợi nấm C.militaris
Môi trƣờng C1 Môi trƣờng C2 Môi trƣờng C2
Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g
Glucose: 20 gam Glucose: 25 gam Glucose: 30 gam
20ml gồm nước dừa, nước
chiết malt.
chiết malt.
chiết malt.
Nhộng tươi: 10 g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ
2ml hỗn hợp vi lượng
gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao
nấm men 1g/l, Pepton 3g/l
2ml hỗn hợp vi lượng gồm:
KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men
1g/l, Pepton 3g/l
b) Ảnh hưởng của nguồn nito
Trong th nghiệm này nhóm nghiên cứu s dụng hàm lượng Glucose đã được
nghiên cứu ở trên. Đ xác định được nguồn Ni tơ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát
tri n của quả th , chúng tôi đã tiến hành th nghiệm trên 3 loại môi trường với hàm
lượng Nhộng tằm thay đổi: 5g, 10g, 15g.
Bảng 2.3. Công thức phối trộn 3 loại môi trƣờng nuôi cấy sợi nấm C.militaris
Môi trƣờng N1 Môi trƣờng N2 Môi trƣờng N3
Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g
Nhộng tươi: 5 g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ Nhộng tươi:15gnghi nnhỏ
20ml gồm nước dừa,
nước chiết malt.
chiết malt.
20ml gồm nước dừa,
nước chiết malt.
2ml hỗn hợp vi lượng gồm:
KH2PO4 0,5g/l, cao nấm
men 1g/l, Pepton 3g/l

26
Tiến hành th nghiệm:
Chuẩn bị 30 hộp cho mỗi loại môi trường với thành ph n các chất được phối
trộn theo bảng trên đây.
Các lọ được bao k n, đem kh tr ng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1000
C trong thời
gian 3h. Sau khi kh tr ng môi trường được làm nguội tự nhiên rồi mới cấy giống.
S dụng phương thức cấy đa đi m giống sản xuất ở cả 3 loại môi trường.
Quan sát so sánh và ghi lại kết quả v tốc độ sinh trưởng hệ sợi và thời gian
hình thành quả th ở cả 2 loại môi trường đ xác định môi trường tối ưu nhất.
c) Nghiên cứu ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng lên quá trình sinh
trƣởng và phát triển của quả thể.
Chuẩn bị 90 lọ th nghiệm với c ng loại môi trường tối ưu đã được cấy
giống, chia thành 3 lô (mỗi lô 30 lọ) tương ứng dụng đ th nghiệm với 3 đi m
cường độ chiếu sáng được lựa chọn.
Chuẩn bị thiết bị chiếu sáng với hệ thống đ n có th đi u chỉnh đ có được 3
đi m cường độ chiếu sáng th nghiệm là 500Lux, 700Lux, 1000Lux.
Quan sát và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát tri n của quả th
C.militaris nhằm xác định cường độ chiếu sáng th ch hợp cho quá trình sinh trưởng
và phát tri n của quả th nấm.
d) Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng đến quá trình sinh
trƣởng và phát triển của quả thể nấm
Bố tr 90 lọ th nghiệm c ng với loại môi trường tối ưu đã được cấy giống,
chia thành 3 lô (mỗi lô 30 lọ) tương ứng d ng đ th nghiệm với 3 đi u kiện chiếu
sáng được lựa chọn l n lượt là 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ.
Quan sát và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát tri n của quả th nấm
C.militaris nhằm xác định thời gian chiếu sáng tối ưu cho quá trình sinh trưởng và
phát tri n của quả th .

27
e) Nghiên cứu ảnh hƣởng của độ ẩm lên quá trình sinh trƣởng và phát
triển quả thể C.militaris
Bố tr 90 hộp th nghiệm c ng với loại môi trường tối ưu đã được cấy giống,
chia thành 3 lô (mỗi lô 30 lọ) tương ứng dung đ th nghiệm với 3 đi m ẩm độ môi
trường được lựa chọn l n lượt là 70%, 80%, 90%.
Quan sát và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát tri n của quả th nấm
C.militaris nhằm xác định khoảng độ ẩm tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát
tri n của quả th .
f) Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên quá trình sinh trƣởng và phát
triển của quả thể C.militaris
Đi u kiện nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri n của ĐTHT trong tự
nhiên là khoảng 22-230
C. Vì vậy chúng tôi thiết kế th nghiệm trong môi trường có
nhiệt độ nằm trong khoảng 20 -250
C với 3 đi m nhiệt độ là 200
C, 220
C, 240
C.
Quan sát và ghi lại sự sinh trưởng và phát tri n của quả th nấm C.militaris
nhằm tìm ra các khoảng nhiệt độ tối ưu trong nuôi trồng.
2.4. Nguyên liệu,hóa chất, thiết bị
Chuẩn bị trang thiết bị gồm: Bếp từ đơn Goldsun BA2101GT công xuất
1650W; Tủ cấy vô tr ng thổi đứng TTS – V1000; Nồi hấp kh tr ng 150 l t dạng
đứng; Máy l c ngang China HY-2; Tủ sấy 125l của hang Biobase; máy phun sương và
các thiết bị đo pH, thiết bị đo nhiệt độ, độ ẩm không kh , thiết bị đo cường độ ánh sáng.
Chuẩn bị dụng cụ gồm: dụng cụ th nghiệm bao gồm: đĩa peptri, ống fancol
50ml, chai thủy tinh 300ml, chai thủy tinh 500ml, đũa thủy tinh, ca đong 1 l t (2 l t),
dao, nạo, giá đựng.
Chuẩn bị nguyên liệu gồm: glucose; gạo lứt; khoai tây; agar; bột nhộng khô;
nhộng tươi nghi n nhỏ; nước dừa; nước chiết malt.
Chuẩn bị hóa chất gồm: MgSO4.7H2O; KH2PO4; Cao nấm men; pepton;
2.5. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 l n và số liệu thu thập được x lý bằng ph n
m m excel.

28
Phần 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris
3.1.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai
VQG Hoàng Liên là khu vực khá đa dạng v thành ph n nấm ĐTHT. Vườn
Quốc Gia Hoàng Liên có ph n lớn các đỉnh núi có độ cao trung bình từ 2000-
2500m, đặc biệt có đỉnh núi Panxipăng cao 3.143m so với mực nước bi n, nhiệt độ
trung bình năm 15,20
C vào m a đông có băng tuyết nhiệt độ khoảng -30
C phù hợp
với sự sinh trưởng và phát tri n của nấm ĐTHT. Theo đánh giá của các nhà khoa
học, VQG Hoàng Liên là một trong nh ng trung tâm đa dạng sinh vật vào bậc nhất
của Việt Nam, là nơi c n sót lại của nhi u loài đặc h u, quý hiếm được ghi trong
sách đỏ Việt Nam và sách đỏ thế giới.
Qua quá trình thu thập m u tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai chúng tôi đã thu
thập được 12 m u trong độ cao khoảng 2200m. Các m u được xác định là
Cordyceps militaris khi dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài được k hiệu như sau:
CM1, CM2, CM5, CM7, CM13, CM14, CM18, CM24, CM28, CM29, CM32,
CM34.
Phân t ch các d n liệu hình thái bằng cách xác định loại vật chủ, các đặc
đi m hình thái, màu s c, k ch thước thân nấm. Chúng tôi nhận thấy các m u nấm có
hình thái đặc trưng của loài Cordyceps militaris, phân nhánh đơn cấp hoặc đa cấp,
quả th có hình trụ, tr n, màu cam đậm, ph n đ u quả th có hình tr nvà có bào t
phủ quanh.Các m u này được tìm thấy trong thảm lá cây mục, trên lá cây hoặc
trong thân cây gỗ mục dưới gốc cây d , k sinh trên ấu tr ng bọ cánh vảy. Cụ th
như sau:
(1) Mẫu nấm CM1
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là
m u nấm Cordyceps militaris, có màu cam hơi vàng, quả th nhọn v ph a đ u, 1/3
ph n đ u nấm có bào t bao xung quanh. Màu s c của cây nấm chia rõ hai màu,
ph n chân nấm màu tr ng hơi vàng 1/5 chi u dài nấm, đỉnh sinh trưởng của nấm

29
chính là ph n sinh sản chứa các múi dạng gai có màu cam hơi vàng dài bằng 1/4
chi u dài của nấm. Nấm ký sinh trên nhộng.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng.
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu nấm CM1 thu ngoài tự nhiên
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên, nơi có độ ẩm 87%, dưới lớp lá
mục khô, dưới gốc cây tre, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ và cây tre.
(2) Mẫu nấm CM2
m u nấm Cordyceps militaris, mọc từ ph n đ u của con nhộng. Quả th nấm hơi
già, bào t phát tán g n hết. Màu s c của cây nấm chia rõ 3 màu, ph n chân nấm
màu vàng dài bằng 1/5 chi u dài của nấm, ph n tiếp tiếp theo ph n chân nấm có
màu cam hơi vàng dài bằng 1/3 chi u dài của nấm, và ph n còn lại có màu tr ng dài
bằng ½ chi u dài nấm, ph n nau có bào t bao xung quanh.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng sâu còn một lớp kén
mỏng của sâu gi .

30
Phân bố: Nấm được tìm thấy trên thân cây gỗ mục ven đường mòn ph n
nhộng nằm trong thân cây chỉ nhìn thấy quả th nhô lên khỏi mặt đất, nơi có độ ẩm
90%, có lớp rêu bao xung quanh, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ và cây bụi có độ
tàn che 3-4 m.
(3) Mẫu nấm CM5
m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm có màu
cam đậm, đ u quả th hơi nhọn d n, bào t nấm bao xung quanh 1/3 quả th , nấm
đang ở giai đoạn trưởng thành, bảo t b t đ u phát tán.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng còn nguyên kén và lớp
lông của con sâu d .
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới gốc
cây d bị khô mục, nơi có độ ẩm thấp khoảng 90%, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ
thấp và thảm cây bụi rêu xanh, ở độ cao 2200m.

31
(4) Mẫu nấm CM7
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u
nấm Cordyceps militaris này có màu vàng cam hơi nhạt, thân hơi dẹt, 1/3 đ u quả th
nấm có bào t xung quanh, đ u quả th nhọn, 2/3 quả th còn lại có màu nhạt hơn, quả
th nhọn d n v ph a đ u nấm. Nấm đang ở giai đoạn già, bào t đã phát tán g n hết.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris này ký chủ trên con nhộng của sâu tre.
Phân bố: Được tìm thấy dưới gốc tre trong rừng tự nhiên, xung quanh là lớp
lá khô, rêu xanh và thảm thực vật cây bụi thấp, độ ẩm 83%, ở độ cao 2200m.

32
(5) Mẫu nấm CM13
m u nấm Cordyceps militaris, nấm có hình thái là hình trụ thuôn, màu s c của
nấm có màu da cam hơi vàng, đ u quả th nấm hơi nhọn, 1/2 quả th nấm có các
bào t bao xung quanh nấm, 1/2 quả th còn lại không có bào t bao xung quanh,
có màu nhạt hơn. Giai đoạn này bào t nấm chưa phát tán. Vị trí quả th mọc là
đ u của con nhộng.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên con nhộng của sâu của loài
cánh vẩy.
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới lớp
đất, có rêu, ở độ cao 2000m, độ ẩm 90%.
m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm hình chuỳ,
1/4 chân nấm có màu tr ng hơi vàng, đ u quả th hơi nhọn d n, bào t nấm bao xung
quanh 2/3 quả th , nấm đang ở giai đoạn b t đ u trưởng thành, bảo t b t đ u phát
tán.

33
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng còn nguyên kén và lớp
lông của con sâu d .
Đặc điểm giải phẫu: Dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài có th nhận định
là m u nấm Cordyceps militaris có màu vàng cam, hình trụ thuôn. Chân nấm màu
tr ng hơi vàng, bằng 1/3 cây nấm, đ u nấm chứa các bào t màu vàng da cam. Ph n
còn lại có màu vàng nhạt hơn. Quả th nấm mọc ở ph n đ u và bụng của ký chủ có
khoảng 10 quả th . Nấm đang ở giai đoạn trưởng thành nên các bào t b t đ u xuất
hiện và phát tán.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris này ký sinh trên nhộng của sâu còn
nguyên lớp kén bên ngoài.

34
Hình 3.7. Hình ảnh mẫu nấm CM18 ngoài tự nhiên
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên, dưới gốc cây gỗ to, ven đường
m n xung quang là rêu xanh bao quanh, độ ẩm 90%, độ cao 2200m, sinh cảnh hỗn
giao cây gỗ và cây bụi.
m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm hình
chuỳ, 1/4 chân nấm có màu tr ng hơi vàng, đ u quả th màu vàng cam đậm, bào t
nấm bao xung quanh đ u quả th , nấm đang ở giai đoạn bảo t b t đ u phát tán.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký chủ trên kén của nhộng

35
Đặc điểm hình thái, giải phẫu: Dựa vào đặc đi m hình thái ban đ u có th
nhận định là m u nấm Cordyceps militaris có màu da cam hơi vàng, thân nấm hình
dẹt, nhọn v ph a đ u của cây nấm, ph n đ u nấm có bào t bao xung quanh, chân
nấm có màu tr ng. Nấm đang ở giai đoạn trưởng thành bào t b t đ u xuất hiện và
phát tán. Nấm có 1 quả th duy nhất to, dài hơi dẹt mọc ở ph n bụng của ký chủ.
Ký chủ: Cây nấm Cordyceps militaris CM28 ký chủ trên con nhộng của
sâu tre.
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên dưới lớp lá mục khô ở dưới gốc
cây tre, xung quanh là các cây bụi thấp, có độ ẩm 90%, ở độ cao 2200m.
m u nấm Cordyceps militaris, nấm có hình dạng là hình chuỳ, nấm có màu vàn
cam, vị trí quả th của nấm mọc trên ký chủ là cuối bụng của con nhộng. Đặc đi m
quả th nấm khi phân lập có màu tr ng, bông xốp.

36
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng, vị trí mọc là cuối
bụng của con nhộng.
Phânbố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy dưới lớp lá
khô trong rừng, ở độ ẩm cao 87%, độ cao 2100m.
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài có th nhận định
đây là m u nấm Cordyceps militaris. Nấm có màu vàng da cam, quả th hình trụ
thuôn, đ u quả th thuôn, 2/3 quả th nấm ở ph n đ u nấm có màu vàng cam có các
bào t bám xung quanh, ở gi a là thân nấm hình trụ thuôn có màu vàng nhạt hơn,
còn lại là chân nấm có màu tr ng hơi vàng. Nấm đang ở giai đoạn b t đ u trưởng
thành b t đ u phát tán bào t .

37
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris này ký chủ trên nhộng còn nguyên kén
của sâu tre.
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên, dưới gốc cây tre xung quanh
được bao bởi các lớp rêu xanh, với độ ẩm 90%, ở độ cao khoảng 2200m, sinh cảnh
rừng hỗn giao cây gỗ và cây tre, độ tàn che 5-7m.
Đặc điểm hình thái, giải phẫu: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận
định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu vàng nhạt, có 6 quả th nấm
trên một ký chủ. Nấm Cordyceps militaris có hình dạng là hình trụ, có quả là hình
chuỳ. Vị trí quả th mọc là ph n đ u, bụng, và cuối ph n bụng của ký chủ. Bào t
nấm bao xung quanh đ u quả th , bào t đang trong quá trình phát tán.
Ký chủ: Nấm ký sinh trên nhộng của sâu tre v n còn nguyên kén có lá khô
bao xung quanh.
Phânbố: Nấm được tìm thấy trongrừng tự nhiên, vị trítìmthấy dưới gốccâytre, dưới
lớp lá khô dày phủ chỉ thấy một ph n của đ u quả th nhô lên. Ở độ ẩm 85%, độ cao 2100 m,
sinh cảnhrừnghỗn giao cáccây gỗto và câytre, độtàn che khoảng5-7 m.
3.1.2. Kết quả định danh loài nấm Cordyceps militaris bằng phân tử
(1) Chủng nấm CM1
DNA của chủng nấm CM1 đã tinh sạch được định tên theo phương pháp sinh học
phân t bằng kĩ thuật PCR bằng 2 cặp mồi đặc hiệu tại Công ty TNHH Phát tri n Công
nghệ Ứng dụng Việt Nam. Kết quả thu được trình tự của chủng CM1 như sau:

Luận văn thạc sĩ

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận văn thạc sĩ

Similar to Luận văn thạc sĩ (20)

More from ssuser499fca

More from ssuser499fca (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận văn thạc sĩ