SlideShare a Scribd company logo

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau

•
•
https://www.facebook.com/garmentspace
https://www.facebook.com/garmentspace

Tài liệu này có tính phí xin vui lòng liên hệ facebook để được hỗ trợ Liên hệ page để nhận link download sách và tài liệu: https://www.facebook.com/garmentspace https://www.facebook.com/garmentspace.blog My Blog: http://garmentspace.blogspot.com/ Từ khóa tìm kiếm tài liệu : Wash jeans garment washing and dyeing, tài liệu ngành may, purpose of washing, definition of garment washing, tài liệu cắt may, sơ mi nam nữ, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế quần âu, thiết kế veston nam nữ, thiết kế áo dài, chân váy đầm liền thân, zipper, dây kéo trong ngành may, tài liệu ngành may, khóa kéo răng cưa, triển khai sản xuất, jacket nam, phân loại khóa kéo, tin học ngành may, bài giảng Accumark, Gerber Accumarkt, cad/cam ngành may, tài liệu ngành may, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, vật liệu may, tài liệu ngành may, tài liệu về sợi, nguyên liệu dệt, kiểu dệt vải dệt thoi, kiểu dệt vải dệt kim, chỉ may, vật liệu dựng, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, tiêu chuẩn kỹ thuật áo sơ mi nam, tài liệu kỹ thuật ngành may, tài liệu ngành may, nguồn gốc vải denim, lịch sử ra đời và phát triển quần jean, Levi's, Jeans, Levi Straus, Jacob Davis và Levis Strauss, CHẤT LIỆU DENIM, cắt may quần tây nam, quy trình may áo sơ mi căn bản, quần nam không ply, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế áo sơ mi nam theo tài liệu kỹ thuật, tài liệu cắt may,lịch sử ra đời và phát triển quần jean, vải denim, Levis strauss cha đẻ của quần jeans. Jeans skinny, street style áo sơ mi nam, tính vải may áo quần, sơ mi nam nữ, cắt may căn bản, thiết kế quần áo, tài liệu ngành may,máy 2 kim, máy may công nghiệp, two needle sewing machine, tài liệu ngành may, thiết bị ngành may, máy móc ngành may,Tiếng anh ngành may, english for gamrment technology, anh văn chuyên ngành may, may mặc thời trang, english, picture, Nhận biết và phân biệt các loại vải, cotton, chiffon, silk, woolCÁCH MAY – QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH ĐÁNH SỐTÀI LIỆU KỸ THUẬT NGÀNH MAY –TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT – QUY CÁCH ĐÁNH SỐ - QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH MAY – QUY TRÌNH MAY – GẤP XẾP ĐÓNG GÓI – GIÁC SƠ ĐỒ MÃ HÀNG - Công nghệ may,kỹ thuật may dây kéo đồ án công nghệ may, công

Education
1 of 126
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VŨ THANH TRÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. TS. Trần Thị Phƣơng Liên Thái Nguyên - 2012
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Tác giả Vũ Thanh Trà
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải và các cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS. Nguyễn Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh. Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). Tác giả luận án Vũ Thanh Trà
iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan................................................................................................... i Lời cảm ơn ...................................................................................................... ii Mục lục............................................................................................................iii Danh mục các từ viết tắt.................................................................................. v Danh mục các bảng .........................................................................................vii Danh mục các hình..........................................................................................viii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4 1.1. Cây đậu tương và đặ c điể m hó a sinh củ a cây đậ u tương .........................................4 1.1.1. Cây đậu tương ..............................................................................................4 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương .........................................................5 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ..................................9 1.2.1. Bệ nh gỉ sắ t ở cây đậ u tương.........................................................................9 1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương...................................................13 1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương .........................17 1.3.1. Phương phá p sử dụ ng chỉ thị hình thái ........................................................17 1.3.2. Phương phá p sử dụ ng chỉ thị hoá sinh học .................................................18 1.3.3. Phương phá p sử dụ ng chỉ thị phân tử DNA ................................................20 1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ................................................26 1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương ..................................................29 Chƣơng 2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U ..................33 2.1. Vật liệu .........................................................................................................33 2.1.1. Vậ t liệ u và phương phá p thu thậ p lá bệ nh ...................................................33 2.1.2. Hóa chất........................................................................................................37 2.1.3. Máy móc và thiế t bị ......................................................................................37 2.1.4. Mồ i củ a phả n ứ ng RAPD và SSR................................................................38 2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................40 2.2.1. Phương phá p nhiễ m bệ nh nhân tạ o..............................................................40
iv 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh...........................................................43 2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA........................................44 2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein ....................................................48 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................53 3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương nghiên cứu .......................................................................................................53 3.2. Phân tí ch đặ c điể̉ m hó a sinh hạ t củ a cá c giống đậu tương nghiên cứu.... 58 3.2.1. Kế t quả phân tích hà m lượng protein và lipid trong cá c hạ t củ a các giống đậu tương nghiên cứu .....................................................................58 3.2.2. Phân tích tính hà m lượ ng và thà nh phầ n amino acid trong hạt của mộ t số giố ng đậ u tương....................................................................................61 3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt ................................................................................64 3.3.1. Phân tí ch tính đa hình DNA củ a cá c giố ng đậ u tương bằ ng chỉ thị phân tử RAPD..............................................................................................................................64 3.3.2. Phân tí ch tính đa hình DNA của cá c giố ng đậ u tương bằng chỉ thị phân tử SSR ..................................................................................................70 3.4. Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương phản ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt ................................................................76 3.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE .........................................................77 3.4.2. Phân tích các protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều ......................79 3.4.3. Nghiên cứ u tính đa hình protein củ a cá c giống đậu tương bằ ng kỹ thuậ t điệ n di hai chiề u ......................................................................................90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................99 1. Kết luận .......................................................................................................99 2. Đề nghị ........................................................................................................100 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN........101 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................102
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µl Microliter 2DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều AFLP Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn được nhân bản APS Ammonium persulfate AUDPC Area Under Disease Progress Curve Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan bp Base pair - cặp bazơ CHAPS 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio] cm Centimeter CTAB Cetylmethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid - ADN dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid ESI-Q TRAP Elecspray ionization Q Trap- Phương phá p khố i phổ sử dụ ng tính năng bẫ y ion kế t hợ p nguồ n ion hó a bằ ng cá ch phun chù m điệ n tử EtBr Ethidium bromide HPLC High-performance liquid chromatography-Sắ c ký lỏ ng hiệ u năng cao IAA Indole-3-acetamide IEF Isoelectric Focusing – Phương phá p điệ n di theo điể m đẳng điện IMA Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria INTSOY International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế, Hoa Kỳ IPG Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định IRRI International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc tế, Philippin Kb Kilo base
vi kDa Kilo Dalton mA MiliAmpe MAS Marker Assisted Selection -Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử ml Mililiter MS/MS Mass spectrometry/ Mass spectrometry - Khố i phổ liên tụ c NST Nhiễ m sắ c thể OD Optical Density- Mậ t độ quang họ c PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợ p polymerase PEG Polyethylene glycol PIC Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride PR protein Pathogenesis-related protein - Protein liên quan đến mầm gây bệnh. QTL Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng R gen Resistant gen – Gen kháng bệnh R protein Resistant protein - Protein khá ngbệnh RAPD Random amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction fragment length polymorphism - Đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế RNA Ribonucleic acid SAR Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống SDS Sodium dodecyl sulfate SDS- PAGE SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis - Điện di biến tính trên gel polyacrylamide có SDS SSR Simple Sequence Repeat - Trình tự lặp lại đơn giản TAE Tris acetate EDTA TCA Trichloracetic acid TEMED N,N,N‟,N‟ Tetramethylethylenediamine UPGMA Phương pháp phân nhóm V Volt – Vôn w/v Weight/volume - Khối lượng/thể tích
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sá ch các giống đậ u tương nghiên cứu....................................................33 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD ...........................................................38 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR .......................................................39 Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến ......................46 Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide ......................................................................49 Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt ..................................53 Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipid trong hạt của 50 giố ng đậ u tương ......................59 Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giố ng đậ u tương................................63 Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu.........................67 Bảng 3.5. Kế t quả phân tích sự đa dạ ng di truyề n bằ ng chỉ thị SSR....................................72 Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống ĐT 2000 đượ c nhậ n diệ n bằ ng phương phá p khố i phổ ...........................................................84 Bảng 3.7. Đa dạ ng mứ c độ biể u hiệ n củ a cá c protein giữ a mẫu thí nghiệ m và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh(ĐT12 và VMK)...................................92 Bảng 3.8. Nhậ n diệ n cá c protein có mứ c độ biể u hiệ n khá c nhau giữ a thí nghiệ m và đố i chứ ng ở hai giố ng nhiễm bệnh ĐT12 và VMK.........................93 Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và giống kháng (ĐT2000, CBU8325) .....................................................................96 Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm với và giống khá ng bệ nh gỉ sắt .................................................................97
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B)..............................................10 Hình 1.2. Hình ảnh nấm P. pachyrhizi gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương chụp dưới kính hiển vi điện tử .................................................................................12 Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm.........................................14 Hình 1.4. Sơ đồ phân tá ch protein bằ ng diệ n di 2-DE ....................................................19 Hình 2.1. Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm .......................................................................................................42 Hình 2.2. Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry............................43 Hình 3.1. Hình ảnh lá của các giống đậu tương ở 3 mức độ phản ứng với bệnh gỉ sắ t..................................................................................................57 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 ..............................................65 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18...............................................66 Hình 3.4. Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân nhóm UPGMA.................................................................................................69 Hình 3.5. Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C), Satt 005 (D) của 50 giống đậu tương......................................................................71 Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR ..................................74 Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá đậu tương VMK, CBU8325, ĐT12 và ĐT 2000 ............................................78 Hình 3.8. Hình ảnh điện di2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu tương giống ĐT2000 ở thời điểm6 (A) ngày và9 ngày (B)...............................79
ix Hình 3.9. So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống ĐT12, ĐT2000, CBU8325 và VMK...............................................................81 Hình 3.10. Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký - khối phổ ...........................................................................................................83 Hình 3.11. Sơ đồ phân nhó m chức năng protein lá đậu tương giống ĐT2000............................................................................................................89 Hình 3.12. So sá nh đa dạ ng protein lá đậ u tượ ng đố i chứ ng và thí nghiệ m của 2 giố ngsau khi gây nhiễ m bệ nh9 ngày(ĐT12 và VMK) ..............................91 Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9 ngày của 2 giố ng nhiễm bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và 2 giố ng khá ng bệ nh gỉ sắt (ĐT2000 và CBU8325)............................................95
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao , mang ý nghĩa trong cả i tạ o đấ t trồ ng , dễ canh tá c, đặ c biệ t có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau . Hạt đậu tương chứ a 30-55% protein, chứ a nhiề u loạ i amino acid không thay thế (lysine, leucine, tryptophan, methionine, cysteine…), 12-25% lipid và cá c vitamin (B1, B2, C, D, E, K…) cầ n thiế t cho cơ thể . Các sản phẩm từ đậu tương được sử dụ ng rộ ng rã i cho cá c mụ c đích khá c nhau như là m thứ c ăn , dầ u ăn, thự c phẩ m chứ c năng , nguyên liệ u cho y họ c và công nghiệ p…Bên cạ nh giá trị dinh dưỡ ng ca o, cây đậ u tương cò n có khả năng cố định đạ m nhờ vi khuẩ n Rhizobium số ng cộ ng sinh trên rễ cây tạ o thà nh cá c nố t sầ n. Vì thế, việ c trồ ng cây đậ u tương không chỉ mang lạ i hiệ u quả kinh tế cao mà cò n có tá c dụ ng cả i tạo đất. Do đó , cây đậ u tương đã đượ c quan tâm trồ ng và phá t triể n mạ nh ở nhiề u quố c gia trên thế giớ i . Ở Việt Nam, đậu tương là cây trồ ng chính đượ c ưu tiên khuyế n khích phá t triể n, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạ c. Việ t Nam từ ng là một nước “xuất khẩu” đậu tương vào những năm 1980 theo hạng mục tiểu ngạch , tuy nhiên cho đế n nay nướ c ta đã trở thà nh nướ c nhậ p khẩu đậ u tương vớ i số lượ ng lớ n hà ng triệ u tấ n khô dầ u đậ u tương hàng năm. Mặ c dù diệ n tích g ieo trồ ng có tăng hà ng năm nhưng năng suấ t thấ p và sả n lượ ng đạ t đượ c không ổ n định , khả năng chống chịu bệnh và các stress ké m. Sâu bệ nh nó i chung và bệ nh gỉ sắ t nó i riêng là nguyên nhân trự c tiế p ả nh hưở ng tớ i diệ n tích gieo trồ ng và là m giả m năng suấ t , chấ t lượ ng hạ t đậ u tương, gây tổ n thấ t lớ n về kinh tế . Bệ nh gỉ sắ t ở đậ u tương do loà i nấ m P. pachyrhizi gây ra và đang đượ c coi là mộ t trong nhữ ng mố i đe dọ a chính trên cây đậ u tương gây thiệ t hạ i đá ng kể , làm giảm từ 10-80% năng suấ t và chấ t lượ ng đậ u tương ở nhiề u
2 nướ c trên thế giớ i trong đó có Việ t Nam . Yêu cầ u đặ t ra hiệ n nay là cầ n phả i chuyể n giao cá c tiế n bộ khoa họ c kỹ thuậ t đặ c biệ t là tạ o ra nhữ n g giố ng cây có năng suất cao, có khả năng chống chịu bệnh để đưa vào sản xuất mở rộng diệ n tích gieo trồ ng và nâng cao chấ t lượ ng hạ t , đá p ứ ng đượ c nhu cầ u đậ u tương trong nướ c cũ ng như phụ c vụ xuấ t khẩ u . Do đó , nghiên cứ u chọn tạ o các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải pháp mang tính chiế n lượ c cho sự phá t triể n bề n vữ ng. Trong nhữ ng năm gầ n đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể , tuy nhiên hầ u hế t cá c nghiên cứ u nà y mớ i chỉ tậ p trung và o việ c giá m sá t quá trình phá t triể n bệ nh , nghiên cứ u dịch tễ họ c, đá nh giá sự thấ t thu năng suấ t hoặ c phân tích phả n ứ ng bệ nh mà chưa chú t rọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này . Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao. Xuấ t phá t từ nhữ ng lý do trê n chúng tôi lự a chọ n và thự c hiệ n đề tà i : “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Đánh giá đượ c khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ sắt nhằ m phá t hiệ n cá c giố ng khá ng và nhiễ m mớ i. 2.2. Xác định được sự đa dạng di truyền ở mứ c độ DNA củ a cá c giố ng đậ u tương nghiên cứ u.
3 2.3. So sá nh đa hình protein , lập đượ c sơ đồ điện di protein lá đậu tương , sơ bộ rú t ra đượ c né t đặ c trưng về protein giữ a giố ng khá ng và giố ng nhiễ m bệnh gỉ sắt. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương. - Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid trong hạt của các giống đậu tương nghiên cứu. - Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR. - Lập sơ đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein lá đậu tương bằng phương pháp điện di một chiều , hai chiều và nhậ n diệ n protein trên hệ sắ c ký -khối phổ. Đồng thời phân tích, so sá nh sự đa dạ ng thà nh phầ n protein lá củ a mộ t số giố ng đậu tương nhiễ m và khá ng bệnh gỉ sắt.
4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1. Cây đậu tƣơng Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ đậu (Fabaceae). Chi Glycine có hai chi phụ là Glycine và Soja. Chi phụ Soja có hai loài là G.max (L.) Merrill và G. soja Sieb. et Zucc. Glycine soja là dạng mọc leo hoang dại, hạt nhỏ, cứng và sản lượng thấp nên không được sử dụng trong nông nghiệp. Glycine max không thấy mọc hoang dại. Về nguồn gốc, đậu tương có nguồn gốc từ Đông Á , có thể mọ c hoang dại từ thung lũng sông Dương Tử , các tỉnh phía Bắc và Đông Bắc Trung Quốc, hoặ c các vùng kế cận của Cộng hò a liên bang Nga , Triều Tiên và Nhật Bản. Hầu hết các giống đậu tương địa phương đang trồng tại nước ta hiệ n nay đều du nhập từ Trung Quốc [8]. Về đặc điểm hình thái, cây đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá mầm (lá tử diệp), lá nguyên (lá đơn) và lá kép, mỗi lá kép có từ 3 - 4, thậm chí đến 5 lá chét, mọc so le. Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm, có màu sắc tuỳ từng giống khác nhau: màu trắng, tím, tím nhạt. Tỷ lệ đậu quả 20 - 30% tuỳ từng vụ... Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu nâu. Tuỳ điều kiện canh tác mỗi cây con cho từ 20 - 400 quả. Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt... có giá trị dinh dưỡng cao. Hạt to, nhỏ tuỳ theo các giống khác nhau, khối lượng 1000 hạt thay đổi trung bình từ 100 - 200g. Màu sắc rốn hạt ở các giống khác nhau là một biểu hiện đặc trưng của giống [9]. Về đặc điểm di truyền, đậu tương Glycine max có bộ nhiễm sắc thể (NST) lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn , ít có khả năng thụ phấn chéo .
5 Những nghiên cứu về hệ gen (genome) đậu tương cho thấy, bộ gen đậu tương có từ 1,29 x 109 đến 1,8 x 109 bp cho bộ đơn bội. Trong số đó có khoảng 40 - 65% trình tự lặp lại (những trình tự này có kích thước nhỏ hơn 0,3 - 0,4kb), các trình tự không lặp lại chiếm khoảng 35 - 60% (có chiều dài 1,1 - 1,4kb) được xếp xen kẽ với trình tự lặp lại [95]. Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm (từ 75 - 85 ngày); chín trung bình (từ 85 - 100 ngày) và chín muộn (từ 100 - 120 ngày). Thời gian sinh trưởng là yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh hay xen vụ. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và các mầm bệnh, các giống thường thích hợp với từng vụ khác nhau [3]. 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tƣơng 1.1.2.1. Thành phần protein trong hạt đậu tương Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 12-55%. Thực tế cho thấy, tuy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong hạt của loài thực vật này nhưng chúng vẫn lớn hơn hàm lượng protein của nhiề u loài thực vật khác [6]. Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp nguồn amino acid và nitơ hoặ c là cá c enzyme tham gia và o quá trình nảy mầm của hạt. Loại protein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin. Dựa vào hệ số lắng, người ta chia protein của hạt đậu thành 3 loại: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Những loại protein chính trong hạt đậu tương là: protein dự trữ (chiếm 70% tổng số protein), các enzyme, các chất ức chế protease và lectin. Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan trong nước (75,8%), globulin tan trong NaCl là 3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7%. Protein dự trữ trong hạt đậu tương bao gồm hai thành phần: conglyxinin (7,9S) và glyxinin (12,2S). Conglyxinin là vixilin của đậu tương,
6 có hệ số lắng là 7,9S, là protein dự trữ phổ biến trong hạt. Conglyxinin tách biệt ra trong các thể protein và được dự trữ trong suốt quá trình phát triển của hạt. Nó được thuỷ phân sau khi hạt nảy mầm để cung cấp nguồn carbon và nitơ cho hạt phát triển. -conglyxinin là một trong những cấu tử của conglyxinin, có khối lượng phân tử là 140 - 180 kDa. -conglyxinin gồm có nhiều tiểu phần khác nhau, trong đó có 3 tiểu phần chính là  (76 kDa), ‟ (72 kDa),  (53 kDa). Ngoài ra, còn có các tiểu phần nhỏ khác hiếm hơn đã được mô tả là ‟, ,  [94]. Thành phần thứ hai là glyxinin vớ i hệ số lắng 12,2S và là dạng legumin của đậy tương. Glyxinin là protein chứa nhiều nhất trong đậu tương. Glyxinin là một hexamer protein gồm 5 tiểu phần. Mỗi tiểu phần bao gồm một chuỗi polypeptide có tính acid (trọng lượng phân tử xấp xỉ 31 - 45 kDa) ký hiệu là A1a, A1b, A2, A3, A4 và chuỗi polypeptide có tính kiềm (khối lượng phân tử xấp xỉ 18 - 20 kDa) ký hiệu là B1b, B1a, B2, B3, B4, được nối với nhau bằng cầu nối disulfide [114]. Các giống đậu tương khác nhau cũng khác nhau về thành phần các chuỗi polypeptide cấu tạo nên glyxinin. Glyxinin của các giống khác nhau đã được chứng minh là khác nhau về thành phần amino acid, trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện (isoelectric point-pI). Tỷ lệ giữa glyxinin và -conglyxinin là 1,6: 1,0 (biến thiên từ tỉ lệ 3,0: 1,0 đến 1,0: 1,0 tuỳ giống). Glyxinin là nguồn dự trữ carbon và nitơ và được tích trữ trong quá trình hình thành phôi. Protein của cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng được coi là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, bởi vì chúng chứa tất cả các amino acid không thay thế và cần thiết cho cơ thể. Hơn nữa protein của cây họ đậu còn có hàm lượng lysine rất cao so với protein từ các loại ngũ cốc khác. Tuy vậy, hàm lượng các amino acid chứa gốc SH như methionine, cysteine vẫn còn thấp [3].
7 1.1.2.2. Lipid, vitamin và một số chất khác trong hạ t đậ u tương Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hoà tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, benzen, toluen, ete, dầu hoả... Lipid còn là thành phần quan trọng của màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể . Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô. Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E (200 mg/100g lipid). Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như carbohydrade , muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh trưởng [3]. Nói chung, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao. Giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipid, trong đó hàm lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quyết định, làm cho hạt đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người và làm thức ăn cho gia súc. Hạt đậu tương có thể chế biến ra 600 sản phẩm khác nhau. Bên cạnh đó, đậu tương còn được dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có màu đen. 1.1.2.3. Protein lá và hệ protein lá đậ u tương Protein là các đại phân tử có ở trong tất cả các loại tế bào và các bào quan. Protein lá đậ u tương rất đa dạng , có hàng nghìn loại với kích thước phân tử khác nhau , từ những peptide nhỏ đến những phân tử với khối lượng lớ n. Protein có nhiề u vai trò khác nhau về chức năng sinh học, nhưng chủ yế u đó ng vai trò quan trọ ng trong quá trình quang hợ p giú p tổ ng hợ p chấ t dinh dưỡ ng từ nguồ n năng lượ ng á nh sá ng mặ t trờ i. Hệ protein (Proteome) là phần bổ trợ của hệ gen (Genome), hệ protein lá đậu tương bao gồm tất cả các protein có mặt trong tế bào lá ở một thời điểm nhất định . Trong lá có cá c protein liên quan đế n chu trình quang hợ p ,
8 các protein tham gia vào phản ứng quang hóa, các protein dự trữ, các enzyme, các chất đề kháng , chấ t oxi hó a ... Ở các mô khác nhau, các giai đoạn khác nhau hệ protein lại có sự khác nhau . Vì hệ protein lá rất phong phú , đa dạng và không ổn định như hệ gen củ a cây đậ u tương cho nên nghiên cứu hệ protein lá không hề đơn giả n và đòi hỏi sự kết hợp của rất nhiều công nghệ và kỹ thuật [68], [86], [100]. Chức năng chính của lá thực vật là thu nhận năng lượ ng á nh sá ng , chuyển hóa chúng và dữ trữ dưới dạng các liên kết hóa học . Do đó, có một số lượng lớn các protein của lá đậu tương là các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất và chuyể n hó a năng lượng. Các protein lá đậu tương có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử như tiểu phần trung tâm phản ứng PSI, protein phức hệ liên quan oxi PSII, carbonic anhydrase, ferrodoxin. Các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi và chuyển hóa carbon như Rubisco, malate dehydrogenase, sedoheptulose-1,7-biphosphatase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triosephosphate isomerase, phosphoglycerate kinase. Rubisco là enzyme chính có vai trò rất quan trọng trong quá trình cố định carbon. Ngoài ra, protein lá đậu tương có thể là các protein dự trữ như vegetative storage protein, stem 28 kDa protein, cyclophilin hoặc các protein có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress như ascorbate peroxidase, catalase. 1.1.2.4. Mộ t số nghiên cứ u về hệ protein lá đậu tương Gầ n đây, các nghiên cứu về protein thực vật sử dụng phương pháp điện di 2 chiề u (Two dimension electrophoresis-2DE) đã được công bố [33], [58], [74], [86], [92]. Một số nghiên cứ u tập trung vào các protein của các bào quan như lục lạp [47], [72], ty thể [33], một số lại tập trung vào các mô thực vật như lá ngô [92], lá đào [101]. Các nghiên cứu trên rễ đậ u tương [116] hoặ c
9 trên hạt đậ u tương đã thu được một số kết quả đáng kể [58], [83], [86], tuy nghiên các nghiên cứu về protein ở lá đậu tương vẫn đang ở mức sơ khai . Trong nghiên cứ u củ a Sarma và cộ ng sự , các tác giả đã thành công trong việc phân tá ch hà ng trăm cá c protein củ a cá c mô như lá, hạt và rễ đậu tương khi sử dụng phương pháp tách chiết protein và điện di 2 chiề u [100]. Trong khi đó , Krishnan và cộ ng sự đã nghiên cứ u hệ protein lá đậ u tương bằ ng phương phá p điệ n di 2 chiề u và khố i phổ , các tác giả đ ã phát hiện được 28 loại phosphoprotein trong lá [68]. Tương tự trong nghiên cứ u củ a Xu và cộng sự , bằ ng phương phá p điệ n di và khố i phổ cá c tá c giả đã phân tá ch đượ c 119 điể m protein trong đó đã nhậ n diệ n đượ c 71 protein ở lá đậ u tương [113]. Đây là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn , bằ ng việ c á p dụ ng cá c kỹ thuậ t proteomics (kỹ thuật nghiên cứu , phân lậ p, tách chiết, phân tá ch và nhậ n diệ n cấ u trú c , chứ c năng củ a hệ protein ) các tá c giả đã gợ i ý các ứng dụng trong việc xác định cá c protein khá ng bệ nh. Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế. Đặc biệt trong vấn đề phân tích, nhận dạng và so sánh các protein lá đậu tương còn ít được công bố [113]. Từ thực tiễn đó, trong khuôn khổ luận án này chúng tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và so sánh protein của lá đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồ ng đậu tương. Hầ u hế t cácnước nhiệt đới và cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương. Bệnh gỉ sắt(soybean rust) được phát hiện đầu tiên vào năm1902 ở Nhật Bả n sau đó lan nhanh sang hầu hết các nước châu Á , châu Phi, Nam Mỹ [80] và Mỹ
10 [102]. Các phát hiện về bệnh gỉ sắt ở Hawaii năm 1994 [67], Zimbabwe năm 1998 [69], Nigeria năm 1999 [28], Nam Mỹ năm 2001 [93], và Argentina năm 2002 [99] cho thấy nấm P. pachyrhizi vẫn đang lan tràn sang các vùng địa lý mới và ảnh hưởng nghiêm trọng đến mùa màng. Bệnh gỉ sắt được coi là mối đe dọa chính đối với năng suất đậu tương tại Mỹ [102]. Ở Brazil, bệnh này gây thiệt hại 1,2 tỷ đô la chỉ riêng trong năm 2003 [115]. Tại các nước bệnh đã trở thành dịch, năng suất đậu tương có thể giảm từ 10% đến 80% [90]. Về mầ m bệ nh, bệnh gỉ sắt ở đậu tương do hai loài nấm là P. pachyrhizi và P. meibomiae gây ra. Loài nấm gỉ sắt ở Châu Á P. pachyrhizi Sydow là loài gây hại nhất cho đậu tương và có độc tính cao hơn loài P. meibomiae (hình 1.2). Nấm gỉ sắt là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới cũ ng như ở Việt Nam. Nấm gỉ sắt là loại nấm ký sinh phá huỷ lớp tế bào bao bọc làm cho cây bị thoát hơi nước mạnh, các bộ phận cung cấp nước không thể tiếp tế đủ số nước bị mất đi, dẫn đến mất cân bằng giữa lượng nước hút vào và lượng nước thoát hơi, kết quả cây đậu tương bị héo. A B Hình 1.1. Mặt sau lá đậu tƣơng bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bà o tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) [118]
11 Dấ u hiệ u và triệ u chứ ng bệ nh : Nấm gỉ sắt phát triển trên tế bào và có mặt ở hầu hết các vụ cây trồng , nhưng bệnh chỉ phát sinh và phá hại nặng nhất trong vụ đậu tương xuân . Bệnh gây hại nặng nhất ở lá , nhưng cũng có thể ở trên thân, cành và quả. Biểu hiện sớm nhất của bệnh là những chấm màu trong ở phiến lá , cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu , đạt tới kích thướ c từ 2-5mm với hình đa dạng , có góc cạnh (Hình 1.1A). Các vết bệnh có thể phát triển rộng và liên kết với nhau thành từng mảng , làm cho phiến lá bị rách nát . Ở mặt dưới phiến lá , nơi có vết bệnh , xuất hiện lớp bột màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm. Khi bị nấ m tấ n công, trong mỗ i đố m lá bị tổn thương có nhiều vết nứt , hoặ c cá c ổ bà o tử hạ (uredinia) màu nâu đỏ bên trong chứ a cá c bà o tử hạ (urediniospore) hình oval, màu sẫm, bề mặ t có nhiề u gai nhỏ (hình 1.1B và 1.2). Các thể bào tử sẽ được giải phóng từ các lỗ nhỏ hoặc vết nứt trên mặt lá. Bệnh gỉ sắt phát sinh ở các lá già gần mặt đất, sau lan lên các bộ phận khác ở phía trên của cây. Tác hại của bệnh gỉ sắt là làm cho lá cây đậu tương giảm hoặc mất khả năng quang hợp, gây rụng lá hàng loạt dẫn đến giảm năng suất quả, tỷ lệ hạt lép cao. Từ khi cây đậu tương có 5-6 lá và nhất là khi bắt đầu ra hoa, bệnh xâm nhiễm mạnh nhất và sau đó phát triển kéo dài tới khi thu hoạch. Nấm xâm nhiễm cả và o quả làm ch o hạt không thể phát triển bình thường. Do đó, năng suất và phẩm chất hạt đậu tương bị giảm sút nghiêm trọng. Những ruộng bị bệnh nặng hầu như không cho thu hoạch. Bệnh gỉ sắt thường tập trung cao điểm vào tháng 3 và tháng 4 khi nhiệt độ đạt từ 20 - 280 C và cây đậu có từ 3 lá kép đến khi thu hoạch quả. Đặc điểm này liên quan tới sự tích luỹ và biến động hàm lượng protein và amino acid trong các giai đoạn sinh trưởng ở các tuổi cây khác nhau [6].
12 Hình 1.2. Hình ảnh nấm P. pachyrhizi gây bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng chụp dƣới kính hiển vi điện tử [118] Vòng đời và quá trình nhiễm bệnh : Ở loài nấm P. Pachyrhizi có hai dạng bào tử là bào tử hạ (urediniospore) và bào tử đông (telliospore) [37]. Bào tử hạ là dạng phổ biến được phát hiện thấy ở các mùa vụ , chúng phát tán, lây lan trên đồ ng ruộ ng . Giai đoạ n bà o tử hạ có thể lặ p lạ i nhiề u lầ n tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh . Khi gặp điều kiện không thuận lợi hoặc vào cuối giai đoạn sinh trưởng của cây, trên vết bệnh có thể hình thành ổ bào tử đông màu đen. Bào tử đông đơn bào, hình oval hoặc hình cầu có núm, vỏ dày, kích thước 24-35µm x 20-29µm. Bào tử đông đóng vai trò là nguồn bệnh bảo tồn cho vụ sau . Quá trình nhiễm bệnh bắt đầu khi bào từ hạ nảy mầm để hình thành một ống mầm phát triển trên bề mặt lá (đườ ng kính 5-400 µm) cho đế n khi sợ i á p (appressorium) hình thành . Ổ bào tử hạ thườ ng phá t triể n từ 5-8 ngày, tố i đa lên đế n 4 tuầ n sau khi lây nhiễ m , quá trình sinh bào tử có thể kéo dài đến 3 tuầ n. Từ khi lây nhiễ m cho đế n khi hình thành bào tử có thể kéo dài đến 15 tuầ n. Thậ m chí dướ i điề u kiệ n khô hạn, quá trình này còn diễn ra dài hơn .
13 1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tƣơng Bản chất của hiện tượng kháng là sự tương tác giữa cây trồng và vật gây hại trong môi trường sống. Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo mô hình tương tác gen đố i gen [49]. Theo đó , để xuấ t hiệ n tính kháng bệnh ở cây cần có gen trội hoặc bán trội ở cây (dominant resistance gene) và cả gen không gây hại cũng mang tính trội (dominat avirulence gene) ở vật ký sinh. Tuy nhiên cho đế n nay , cơ chế khá ng bệ nh gỉ sắ t và sự tương tá c giữ a mầ m bệ nh và cây chủ vẫ n cầ n nhiề u nghiên cứ u để là m sá ng tỏ . Theo giả thiế t , sau khi bị nhiễm bệnh gỉ sắt , cây đậ u tương sẽ có các phản ứng tự vệ. Hiệ n tượ ng tự vệ có thể do hệ thống SAR (Systemic acquired resistance) vớ i sự tham gia củ a nhiề u nhó m protein liên quan đế n mầ m bệ nh (Pathogenesis-related protein - protein PR ) hoặ c protein khá ng (Resistant protein - protein R) đả m nhậ n [44]. Cụm gen R đã đượ c phá t hiệ n ở nhiề u loà i như lúa [105], Arabidopsis [34], [78], ngô [60], và đậu tương [51], [54], [66]. Cho đến nay, có nhiều nhóm protein PR với các chức năng khác nhau đã được phát hiện [73]. Các protein này thường xuất hiện trong mô tế bào sau khi lây nhiễm bệnh từ vài phút đến vài giờ, chúng đều là các chất kháng khuẩn, kháng nấm và tham gia vào bảo vệ tế bào thực vật khỏi các tác động của mầm bệnh [10], [44]. Khi có sự tương tác giữa nấm và tế bào thực vật, các protein Avr (avirulence protein) được hình thành từ sợi nấm và từ giác mút sẽ được chuyển vào nguyên sinh chất của tế bào thực vật bằng các con đường khác nhau [44],[64], [73]. Protein Avr có nhiề u loạ i và là các protein nhỏ có trong giác mút củ a sợ i nấ m được tiết vào tế bào thực vật cùng với các protein khác qua các màng giác mút . Protein R trong nguyên sinh chất củ a cây chủ nhận biết protein Avr và hoạt hóa hệ thống tín hiệu bảo vệ của tế bào thực vật [39]. Ở cây lanh (Linum usitatissimum) kháng nấm gây bệnh gỉ sắt, protein AvrL567 của nấm gây bệnh được nhận biết bằng các protein kháng của cây
14 chủ như protein L4, protein L6 và protein L7, hoặ c các protein AvrM, AvrP4 của nấm được nhận biết bằng các protein M và P4 của cây chủ [46]. Ngoài ra, từ sợi nấm, protein Avr cũng có thể xâm nhập vào nguyên sinh chất và tương tác với protein R theo cá c cá ch khá c nhau như hình 1.3. Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm (Trần Thị Phƣơng Liên (2010), “Protein và tính chống chịu ở thực vật”). Tại Trung tâm phát triển Rau màu Châu Á (AVRDC), việc xác định tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương là một mục tiêu quan trọng với hơn 9000 dòng đậu tương đã được sàng lọc. Cả tính kháng làm giảm tốc độ phát triển, tính kháng chuyên biệt và tính chống chịu đều xuất hiện trên mầm đậu tương [79]. Đặc tính kháng bệnh gỉ sắt của đậu tương là không ổn định và khá phứ c tạp [79]. Chúng có thể do một hoặc một số gen trội quyết định và được di truyền cho thế hệ sau theo các quy luật di truyền cơ bản hoặ c có thể là di truyề n theo qui luậ t tương tá c đa gen . Ví dụ , trong 3 cặp lai (UPSL 13 x Brogg, UPSL 85 x Harelec, UPSL - 3 x Clacrk 63), các giống làm mẹ là những giống kháng cả bệnh gỉ sắt và bệnh virus gây vàng lá, các giống làm bố là các giống năng suất cao và mẫn cảm với bệnh. Sự phân ly ở F2 cho kết quả
15 có một quần thể tuân theo tỷ lệ 3:1 (3 kháng: 1 nhiễm), hai quần thể khác không theo tỷ lệ lưỡng gen. Một số thí nghiệm khác lại chỉ ra rằng các cây lai ở F1 đều có khả năng kháng bệnh, còn các cây lai ở F 2 phân ly theo tỷ lệ 9 kháng: 7 nhiễm. Điều này chứng tỏ rằng có 2 gen trội tác động qua lại cùng quyết định tính kháng bệnh . Do đó , có thể nói, việ c xá c định tính khá ng củ a cây đậ u tương vớ i bệ nh gỉ sắ t là khá phứ c tạ p và cầ n thêm nhiề u công trình nghiên cứ u để là m sá ng tỏ . 1.2.2.1. Tính kháng bệnh gỉ sắt chuyên biệt ở đậu tương Đế n nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy có năm gen chính liên quan đế n tí nh khá ng bệ nh gỉ sắ t ở đậ u tương bao gồm: gen Rpp1 [56], [57] [76]; gen Rpp2 [59]; gen Rpp3 [37]; gen Rpp4 [56]; gen Rpp5 [52]. Các phản ứng kháng qua trung gian ở các locus Rpp2, Rpp3, Rpp4 và locus Rpp5 làm hạn chế sự sinh trưởng, phát triển của bào tử nấm thông qua sự hình thành các thể tổn thương màu nâu đỏ [36], [37], [52], [56]. Trong khi đó , phản ứng kháng của gen Rpp1 là hình thành các phản ứng miễn dịch ở cây chủ [36]. Các phản ứng kháng bệnh của gen Rpp2 đã đượ c nghiên cứ u rộ ng rãi bằng kỹ thuậ t microarray [107]. Theo đó mứ c độ biể u hiệ n củ a cá c gen tăng mạ nh trong vò ng 12 tiế ng sau khi gây nhiễ m ở cả thự c vậ t khá ng bệ nh và nhiễ m bệ nh. Sau đó mứ c độ biể u hiệ n trở lạ i trạ ng thá i bình thườ ng sau kh oảng 72 giờ . Các phản ứng này được phát hiện ở cả các giống nhiễm và giống kháng . Ở ba dòng đậu tương Tainung-4, PI459024, PI459025 và một dòng G. soja (PI 339871) được ghi nhận là có thêm các gen kháng chuyên biệt khác [58]. Tính kháng chuyên biệt cũng đã được xác nhận ở các loài Glycine spp. hoang dại và một vài trong số đó đã được dùng làm cây ký chủ để xác định các kiểu gây bệnh gỉ sắt. Việc xác định các giống kháng bệnh đã được tiến hành từ nhiều năm nay ở nhiều nước trên thế giới, tuy nhiên số giống kháng được phát hiện chưa nhiề u [52].
16 Nhiều nhà khoa học đã tìm cách phân lập các gen kháng bệnh để nghiên cứu tính chất sinh hóa và chức năng của những protein tương ứng [58], [79], [106]. Trên thực tế, việ c phá t hiệ n cá c gen khá ng bệ nh và cá c hệ thố ng bả o vệ là rấ t phứ c tạ p do có sự tham gia củ a nhiề u gen khá c nhau . Một số nghiên cứu sàng lọc giống đã được tiến hành để phát hiện các giống đậu tương có khả năng kháng/chống chịu với nấm gây bệnh P. pachyrhizi [58], [79]. Các nghiên cứu về gen cho thấy năm gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 và Rpp5 đã được phát hiện và mô tả là có khả năng liên quan đến tính kháng đối với một số chủng nấm P. pachyrhizi. Tuy nhiên chưa có một giố ng đậu tương nào có phổ kháng rộng với tất cả các chủng nấm P. pachyrhizi và hiện nay phần lớn các giống đậu trên thị trường được trồng ở Mỹ đều khá mẫn cảm với bệnh gỉ sắt [102]. 1.2.2.2. Tính kháng một phần bệnh gỉ sắt ở đậu tương Các dòng mang tính kháng một phần hoặc các dòng chậm bị bệnh gỉ sắt đã được xác định và mô tả dựa trên thời gian ủ bệnh và số lượng cụm bào tử hạ có trong phầ n thương tổn [58]. Đánh giá khả năng kháng bệnh bằng sự theo dõi, quan sát, liệt kê một số dòng mang tính kháng một phần được xác định dựa trên số lượng nốt. Trở ngại chính trong phát triển các dòng đậ u tương mang tính kháng là làm thế nà o để đánh giá được các dòng này từ các quần thể phân ly hoặc từ các dòng có tính trưởng thành khác nhau. Ngoài những khác biệt sinh lý khi cây trưởng thành, các điều kiện môi trường cũng có thể gây ả nh hưở ng khi cây trưởng thành trong các khoảng thời gian khác nhau. 1.2.2.3. Tính chống chịu bệnh gỉ sắt ở đậu tương Tính chống chịu ở đây được hiể u là khả năng cây cho năng suất tương đối dưới áp lực của bệnh gỉ sắt. Để so sánh năng suất người ta so sánh một giống được bảo vệ bằng thuốc trừ nấm. Mặc dù cần có thêm nhiều số liệu và thời điểm kiể tra, tính chống chịu cần được đánh giá vào mỗi mùa vụ.
17 Ở Đài Loan và Thái Lan, nhiều dòng đã được chọn và sàng lọc thử nghiệm tính chống chịu bệnh gỉ sắt [88]. Dựa trên phần trăm gia tăng năng suất khi so sánh giữa các dòng, người ta đã xác định được các dòng mang tính chống chịu cao hoặ c có thể kháng một phần. Thiệt hại năng suất của các dòng chống chịu này thường ít hơn so với các dòng có năng suất cao khác. Xu hướng tương tự cũng xảy ra ở những dòng bị giảm sút ở chỉ tiêu trọng lượng 100 hạt. Các dòng mang khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt có diện tích lá bị bệnh nhỏ nhất hoặ c có tính kháng một phần dựa trên số lượng vết bệnh trên mắt lá. Gần đây, cùng với mứ c độ phần trăm tăng năng suất thì chỉ tiêu chống chịu stress đã được áp dụng trong đánh giá tính chống chịu bệnh gỉ sắt bằng cách sử dụng các ô ba chiều để chia các nguyên liệu khảo nghiệm ra thành bốn nhóm. Mặt phẳng X-Y (X: tính độc bệnh, Y: năng suất phần trăm) được chia thành bốn đoạn bằng cách vẽ các đường phần cắt tại điểm chính giữa của trục X và trục Y. Trục Z thể hiện mức độ chống chịu stress mà một dòng có được ở bất kỳ nhóm nào trong bốn nhóm. 1.3. Các phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tƣơng Trong phân tích tính đa dạng di truyền của thực vật người ta có thể tiến hành thự c hiệ n ở các cấ p độ và phương phá p khác nhau , từ các đặc điểm hình thái , sinh lý và hoá sinh đến đặc điểm của phân tử DNA , protein. Phân tí ch đa dạ ng di truyề n ở đậ u tương dựa trên mộ t số phương phá p như chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh và chỉ thị phân tử DNA. 1.3.1. Phƣơng phá p sƣ̉ dụ ng chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện dưới dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ... Mặc dù chỉ thị hình thái được sử dụng như một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong
18 chọn giống gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hưởng của các nhân tố di truyền như sự tương tác giữa các sản phẩm của gen. Các nhân tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng có tác động qua lại giữa kiểu gen và kiểu hình, gây ảnh hưởng không nhỏ đến các giai đoạn phát triển của thực vật. Biể u hiệ n khả năng khá ng và nhiễ m bệ nh về mặ t hình thá i ở thự c vậ t đượ c xá c định theo cá c tiêu chí nhấ t định . Đây là chỉ thị quan trọng để tìm kiế m và tạ o giố ng khá ng bệ nh . Ví dụ như bệnh gỉ sắt đượ c xá c định trên cơ sở đá nh giá vế t bệ nh trên lá , mứ c độ tạ o quầ ng , mức độ tạ o bà o tử , từ đó có thể phân biệ t đượ c cá c giố ng đậ u tương khá ng tố t , kháng trung bình và mẫn cảm với bệ nh. Hơn nữa, một số tính trạng trội được tạo ra theo ý muốn của con người thông qua đột biến. Các tác nhân này gây ra một số hiện tượng như lùn, bạch tạng... có hại cho cơ thể của thực vật. Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của các chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hoá sinh học, những khó khăn trên đang từng bước được giải quyết. 1.3.2. Phƣơng phá p sƣ̉ dụ ng chỉ thị hoá sinh học Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình như isozyme và các protein dự trữ (stograge protein). Các isozyme có thể được phân tách theo trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang. Nhờ vậy, bằng kỹ thuật điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ như isozyme amylase, esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thông tin như là một loại chỉ thị đồng trội.
19 Hình 1.4. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE (Phan Văn Chi (2006), “Proteomic: Khoa học về hệ Protein”) Phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và đơn giản hơn phân tích DNA. Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen , số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển của cá thể . Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền. Hiện nay, các nghiên cứu về hệ gen (genomics) và hệ protein (proteomics) thực vật đang được quan tâm và ngày càng phát triển mạnh [40]. Kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lượng phân tử (chiều thứ hai ) (hình 1.4). Kỹ thuật này ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và cơ thể [53], [55]. Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là cách tiếp Chiều 1 IEF Thanh gel IPG Cân bằng mẫu Chiều2SDS-PAGE - + Mẫu protein
20 cận proteomics thường được sử dụng nhất [27], [35], [48], [50], [55]. Tùy thuộc vào kích thước gel và dải gradient pH sử dụng , điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein (lên đế n 5000 điểm protein), và có thể phát hiện vệt protein với lượng <1ng có mặt trong mẫu cùng một lúc , đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của chúng ở các mẫu phân tích để tìm cá c chỉ thị liên quan đến bệnh [84]. 1.3.3. Các phƣơng pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA Chỉ thị phân tử DNA trong thời gian đầu chủ yếu là RFLP , dự a trên cơ sở mẫ u dò đặ c hiệ u . Sau khi phá t minh ra PCR , ngườ i ta phá t triể n tiế p cá c chỉ thị dựa trên phương pháp này như RAPD , AFLP, SSR, SNP, ... Bên cạnh đó, QTL (Quantitative Trait Loci) - bản đồ locus các tính trạng số lượng xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một số tính trạng số lượng cũng đang được các nhà khoa học quan tâm. Các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử ở đậu tương sử dụng chỉ thị AFLP đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp. Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tương đã và đang được một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [62]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật nói chung và đậu tương nói riêng còn rất hạn chế, đặc biệt là trên đối tượng đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt. Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu giống đậu tương nhập nội và giống đậu tương địa phương đã được đánh giá về khả năng chịu nóng, chịu hạn, kháng sâu bệnh. Việc chọn tạo giống chủ yếu dựa trên những phương pháp thủ công truyền thống trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, nông sinh học mà chưa đi sâu vào chọn lọc dựa trên những đặc điểm di truyền phân tử. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương là rất cần thiết.
21 1.3.3.1. Chỉ thị RAPD Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyề n , kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bở i Welsh và cộ ng sự [112]. RAPD đã đượ c sử dụ ng rộ ng rã i để nghiên cứu sự đang dạ ng di truyề n củ a cù ng mộ t loà i hoặ c sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau [15], [25]. Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm 10 nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được phân tá ch bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen của cá c đố i tượ ng khá c nhau hoặ c củ a hai loà i sẽ cho sự khác nhau về những phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tương nghiên cứu. Về nguyên tắ c , kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cách sử dụng nhữ ng mồ i ngắn có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các mồ i . Mồ i (primer) là nhữ ng đoạn oligonucleotide ngắn , mộ t mạ ch (khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lượng G+C cao (từ 60-70%) và không có đầu tự bổ sung. Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA củ a hệ gen. Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việ c nghiên cứ u đa dạ ng và lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạ y PCR ; (iii) Kiể m tra sả n phẩ n nhân bả n trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụ ng ; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyền và thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của các đối tương nghiên cứu. Các sinh vật cùng loài có kiểu gen hoàn toàn giống nhau thì các đoạn DNA đượ c khuếch đại sẽ có kích thước giống nhau , khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD. Với các sinh vật khác loài, khi
22 sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD, các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau. Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên với số lượng lớn. Ứng dụng của chỉ thị RAPD Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biế n trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến mộ t tính trạng hoặ c thiế t lậ p bả n đồ di truyề n [43], [70], [96], [110]. Trong chương trình cải thiện giống, nhà chọn giống thường quan tâm đến những tính trạng mà nó biểu hiện bên ngoài (phynotype). Các tính trạng đó có thể là tính kháng sâu bệnh, tính chống chịu phèn , mặn hoặ c stress… Nhưng nếu việc phân tích di truyền chỉ dựa trên kiểu hình thường kết quả dễ bị sai lệch, do kiểu hình là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường. Chính vì thế, nhà chọn giống cần phải biết tính trạng đó liên kết với kiểu gen như thế nào và phương pháp RAPD sẽ trợ giúp phát hiện được điều này. Sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học của giống cây có múi ở huyện Gò Quao , tỉnh Kiên Giang , Nguyễn Hữu Hiệp và nhóm nghiên cứu đã sử dụng các mồi ngẫ u nhiên , kết quả có 49 dấu phân tử được ghi nhận. Từ đó vẽ được giản đồ phả hệ của các giống cây này [5]. Barakat và cộ ng sự ứ ng dụ ng kỹ thuậ t RAPD đã phân tích và nhậ n dạ ng đượ c cá c chỉ thị liên quan đế n tính khá ng bệ nh đố m trắng ở lá ngô [32]. Trong khi đó , Paulo (2004) đã sử dụ ng 32 mồ i để xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô Brazil, kết quả thu được 225 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có 184 phân đoạn DNA thể hiện tính đa hình (chiếm 72,2%) [91]. Năm 2003, Jorge và cộ ng sự đã đánh giá sự tương đồng di truyền giữa 7 giống chè ở Hy Lạp nhờ kỹ thuật RAPD. Sử dụ ng 25 mồi ngẫu nhiên cá c tá c giả đã nhân bả n được 282 phân đoạn DNA, trong đó có 195 phân đoạn thể hiện tính đa hình [65]. Ngoài ra, Dey và cộng sự (2005) nghiên cứu tính đa dạng di truyền của
23 38 dòng lúa thơm và 2 dòng đối chứng bằng kỹ thuật RAPD , kết quả khuếch đại được 44 phân đoạ n DNA và có 41 phân đoạ n thể hiện tính đa hình [43]. 1.3.3.2. Chỉ thị SSR Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giả n ) do Litt và Luty (1989) phát hiện lần đầu tiên trên đối tượng người [71]. Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng, ở người trình tự lặp lại đơn là TG với tần số lặp lại là 10-60 lần, chúng phân bố rải rác trong hệ gen tạo nên có khoảng 50.000 bản sao. Bằng kỹ thuật PCR, người ta đã phát hiện ra trình tự SSR ở gen tổng hợp actin của người và xác định được 12 alen trên 37 kiểu gen được nghiên cứu và nhận thấy các SSR này là những yếu tố trội di truyền theo quy luật của Mendel. SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đó. Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn [20]. Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật. Phương thức lặp lại được phân thành 3 loại chính: lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau). Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là các trình tự DNA bảo thủ SSR; (iv) Nhân vùng gen tương ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của sản phẩm PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR.
24 Phản ứng PCR - SSR với mồi được thiết kế dựa trên hệ gen của từng loài, nên chỉ thị SSR cho kết quả đa hình cao hơn là các chỉ thị phân tử khác. Kỹ thuật này chỉ đòi hỏi một lượng nhỏ DNA mẫu nhưng lại cho phép phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể trong cùng một giống. Phản ứng không mất nhiều thời gian. Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị phân tử khác và cho kết quả nhanh và đáng tin cậy hơn chỉ thị RAPD. Chỉ thị SSR vớ i các locus đặc tr ưng, đa alen và cung cấp nhiều thông tin nên chúng hết sức có ích trong việc thay đổi trình tự hiếm [67]. Đây chính là những ưu điểm chính của kỹ thuật SSR. Nói chung, chỉ thị SSR tương đối đơn giản hơn so với chỉ thị RFLP hay AFLP. Vì vậy, chỉ thị này được quan tâm hơn trong ứng dụng vào chọn giống thực vật [95]. Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ngoài ra, việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu đòi hỏi phải tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA bộ gen chứa SSR [74]. Vì vậy, số lượng các mồi chưa được phát triển ở nhiều loài thực vật. Ứng dụng của kỹ thuật SSR Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR được áp dụng để nghiên cứu đa dạng trên cả đối t ượng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và đáng tin cậy. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên một số loài cây như lạc, mơ, lúa mì [32], [75] và đang phát triển ở các giống cây trồng khác như đậ u tương [111]. Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liên quan đến một số tính trạng đã được xác định như chọn giống nhờ chỉ thị (marker-assisted selection). Các chỉ thị SSR đã được dùng để chọn dòng kháng bệnh khảm do virus ở cây đậu tương [29], chọn các dòng lúa có năng suất cao và hàm lượng protein dự trữ cao hoặ c để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống cây trồng ở một số đối tượng như lúa, mía, đậu tương, cà
25 chua hoặ c xây dựng bản đồ di truyền liên kết tính trạng ở cà chua và lúa và xác định giới tính thực vật trên đối tượng đu đủ. 1.3.3.3. Các chỉ thị RFLP và AFLP Các chỉ thị p hân tử như RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng đượ c sử dụ ng rộ ng rã i trong nghiên cứ u đa hình DNA. Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu. Kỹ thuật RFLP được tiến hành như sau: các endonuclease cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng loạt các phân đoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Số lượng các phân đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ gen. Sản phẩm của quá trình cắt sẽ được điện di, sau đó được chuyển nguyên vị và cố định trên màng lai. Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn sẽ được phát hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dò đã được đánh dấu (bằng phóng xạ hoặc bằng phương pháp hoá học) và các đoạn DNA của mẫu cần phân tích (được tạo ra từ cùng một locus theo nguyên tắc bổ sung). Trong khi đó , AFLP là một kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân các đoạn được cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn. Cũng như các chỉ thị phân tử khác, AFLP khám phá hiện tượng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn DNA được nhân. Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter), nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA được nhân lên. Chỉ thị AFLP ít phức tạp hơn RFLP, với ưu điểm là độ đa hình cao nhận dạng tới cá thể, thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [103].
26 1.3.3.4. Bản đồ QTL Bản đồ các locus kiể m soá t tính trạng số lượng QTL (Quantitative Trait Loci) xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng số lượng đang được quan tâm . Từ bản đồ QTL ta có thể xác định được những vùng trên NST có liên quan đến một tính trạng hay không . Các bước để lập bản đồ QTL như: (i) xác định cặp lai có tính trạng đối kháng nhau; (ii) lai và tạo quần thể cho lập bản đồ (300-600 cá thể); (iii) theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (iv) xử lý thống kê và lập bản đồ. Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí gen, hiệu quả và hoạt động của các locus liên quan trong mối tương tác giữa các sản phẩm của gen và tương tác QTL với môi trường , từ đó chọn lọc được các dòng với tính trạng mong muốn nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Selection). Năm 2002, các nghiên cứu lập bản đồ QTL liên kết với tính trạng qui định khố i lượ ng [61] hoặ c tính chịu hạn ở đậu xanh [103] đã đượ c mô tả . 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Trên thế giới , đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [32], [52], [77], [81]. Ở Đài Loan , bệnh gỉ sắt gây thiệt hại nghiêm trọng đế n cây đậu tương và làm hạ n chế năng suấ t đậu tương vụ xuân. Trung tâm Rau mà u Châu Á (AVRCD) của Đài Loan đã tiến hành so sánh 1080 giống, kết quả có 9 mẫu giống kháng bệnh trung bình, trong đó có 4 mẫu giống có nguồn gốc từ Trung Quốc, 3 giống có nguồn gốc từ Nhật Bản, 1 giống có nguồn gốc từ Triều Tiên. Giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các giống khác trong điều kiện đồng ruộng, số lượng vết bệnh ít hơn [6]. Ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ kế t hợ p Phòng thí nghiệm Nghiên cứu bệnh thực vật và AVRCD đã khởi động một dự án hợp tác nghiên cứu dịch tễ học của bệnh gỉ sắt đậu tương năm 1978. Dự án này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt được tiếp tục tiến hành cho đến năm1992. Ở Thái Lan, chương trình quốc gia của Thái Lan đã và
27 đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với các mụ c tiêu lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [88]. Ở Indonesia, phần lớn các giống đậu tương đều bị nhiễm bệnh cho nên bệnh gỉ sắt được xem là loại bệnh nghiêm trọng nhất trên cây đậu tương và đã lan rộng cả ở mùa mưa và mùa khô. Các hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải thiện tính kháng cây ký chủ, thử nghiệm thuốc trị nấm, quản lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các nghiên cứu về sự phát tán bào tử. Trong khi đó ở Úc, bệnh gỉ sắt đã được nghiên cứu sâu, tuy nhiên kinh phí bị giới hạn nên các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào việc sàng lọc các quần thể hồi giao bằng cách lai Glycine max và Glycine tomentella. Bằ ng kỹ thuậ t phân tử , những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền được tìm thấy ở đậu tương [45]. Verma và cộ ng sự (1996) đã công bố về những biến đổi alen của SSR ở mức độ cao trong sinh chất mầm đậu tương [109]. Theo ông, có 28 alen SSR được nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen đậu tương. Akkaya và cộng sự (1992) đã lập bản đồ 40 locus SSR ở đậu tương cùng với 118 chỉ thị RFLP và RAPD . Có 18 trong 29 nhóm liên kết chứa ít nhất một locus SSR được phân bố khá ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương [29]. Năm 1995, Maughan nghiên cứu trên 94 giống đậu tương đã xác định đ- ược 79 alen trên 5 locus [74]. Navel và cộng sự (2000) khi nghiên cứu 40 giống đậu tương trong tập đoàn đậu tương và 39 giống cao sản đã sử dụng 74 chỉ thị SSR và nhận được 379 alen trên 74 locus [85]. Ngoài ra, Abe và cộng sự (2003) đã phân tích 20 locus SSR của 131 giống đậu tương từ 14 nước Châu Á và nhận thấy rằng trung bình trên mỗi locus SSR có đến 11,2 alen [26]. Họ cũng đã nhận ra sự khác nhau về nguồn gốc di truyền giữa tập đoàn giống đậu tương ở Nhật Bản và Trung Quốc . Các phát hiện của của nhóm nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các giống đậ u tương của các nước Đông Nam Á và Trung Á phần lớn bắt nguồn từ Trung Quốc . Trong khi đó , Cregan và
28 cộng sự (1999) đã sử dụng đồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, AFLP và thiết lập được bản đồ gen với 20 nhóm gen liên kết ở đậu tương trên cơ sở ba quần thể lai của các trường đại học Iowa, Utah và Nebraska [42]. Để xá c định gen khá ng bệ nh gỉ sắ t trên cá c giố ng đậ u tương củ a Mỹ và Brazil, sử dụ ng phương phá p lậ p bả n đồ liên kế t chỉ thị phân tử (map-based cloning) các nhà khoa học đã phát hiện một số chỉ thị SSR liên kết gần với các gen từ Rpp1 đến Rpp5: Rpp1và Rpp4 thuộ c nhó m liên kế t G trên NST số 18; Rpp3 thuộ c nhó m liên kế t C2 trên NST số 6; Rpp3 thuộ c nhó m J trên NST số 16 và Rpp5 thuộ c nhó m N trên NST số 3 [52], [63], [77], [81], [82], [104]. Ở nước ta, kế t quả thí nghiệm củ a một số tác giả thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cho thấy các giống đậu tương trồng đều bị nhiễm bệnh với các mức độ khác nhau. Các giống ít bị nhiễm bệnh hay bị nhiễm muộn trên đồng ruộng hiện nay là M103, DT93, DT84, AK03, AK05, VX93, dòng 42. Các giống nhiễm bệnh nặng là V74 (DT74) và DH4. Trong nghiên cứ u về mố i quan hệ di truyề n củ a 19 giố ng đậ u tương Việ t Nam vớ i 25 cặ p mồ i bằ ng chỉ thị RAPD, tác giả Đinh Thị Phòng và cộng sự cho thấy có 17/25 mồ i có tính đa hình với giá trị PIC (Polymorphic Information Content -Hàm lượng thông tin đa hình) dao độ ng từ 0,11 đến 0,6, trong đó có 3 mồ i có tính đa hình cao (PIC>0,5). Ngoài ra, tác giả cũng cho rằng các giống có tính chống chịu vớ i điề u kiệ n bấ t lợ i củ a môi trườ ng như giố ng HL 92 (kháng bệnh xoăn lá và thố i quả ) và HL203 (chố ng chịu khá vớ i sâu bệ nh) đều nằm trong cùng nhóm phụ III và có hệ số sai khác di truyền 0,114. Hoặ c hai giố ng M 103 (chịu nóng) và giống DT84 (chịu lạnh và chịu úng ) đều nằm trong nhóm phụ II và có hệ số sai khác di truyền 0,082 [17]. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số thà nh tự u đáng kể : Trung tâm đậu đỗ Định Tường đã khảo sát 500 mẫu giống, trong đó giống G8587 có
29 sức kháng khá , các giống 7608-25-4, SJ4, SJ5, DT78, Pand, Provar có thể hiệ n mức độ kháng bệ nh . Phạm Văn Biên và cộng sự thuộc Viện kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam khi nghiên cứu về nguồn gen kháng gỉ sắt đã cho thấ y các giống Hoà An, MTD3, Prover, Cao quả địa hoa trắng, Đen Bắc Hà, Đen Cao Bằng, MTD4, Nhật 12, 13, 16, 17, 20 có tính kháng với bệnh gỉ sắt [1]. Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và cây thực phẩm đã nghiên cứu, lai tạo và kiểm định được một số giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt như: ĐT2000, CBU8325, DT95. Giống ĐT2000 được công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng cao đối với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống đậu tương đã có kết quả bước đầu khả quan [21], [22]. Như vậ y, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương nên chú ng có thể cung cấp nhữ ng dẫ n chứ ng chính xá c và tin cậ y trong nghiên cứu sinh học phân tử , di truyền học và lai tạo giống cây trồng. 1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tƣơng Nhằm phát triển tăng năng suấ t và chấ t lượ ng đậu tương một cách mạnh mẽ, hàng loạt các tổ chức , các mạng lưới nghiên cứu và cải tạo giống đậu tương trên thế giớ i đã đượ c thà nh lậ p như : Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế ở Hoa Kỳ (INTSOY - International Soybean Program), Viện Nông nghiệp nhiệt đới ở Nigeria (IMA - Institute of Tropical Agriculture), Trung tâm phát triển rau màu Châu Á (AVRDC - Asian Vegetable Research Devlopment Center) ở Đài Loan, Viện nghiên cứu lúa quốc tế ở Philippin (IRRI - International Rice Research Institute ). Trong đó , Trung tâm phát triển rau màu Châu Á là nơi nghiên cứu và đánh giá tập đoàn gen đậu tương sớm nhất thế giới . Trung tâm nà y đã thiết lập đượ c hệ thống đánh giá đậu tương và đã chọn lọc thành công 24 giống đậu tương có năng suất cao , có
30 khả năng chống bệnh gỉ sắt và thích ứng với điều kiện canh tá c và sinh thái ở nhiều quốc gia. Công tác nghiên cứu giống đậu tương trên thế giới hướng tới những mục đích: (i) Nhập nội giống sau đó chọn lọc, thử nghiệm với điều kiện của các vùng sinh thái; (ii) Khảo nghiệm các giống ở các vùng sinh thái khác nhau để tìm ra giố ng có khả năng thích ứng vớ i các vùng sinh thái đó ; (iii) Tạo tính trạng mới bằng lai hữu tính và dùng các tác nhân vật lý, hoá học nhằ m chọn lọc ra những dòng tốt nhất phục vụ cho sản xuất ; (iv) Xác định cá c địa bàn trồng đậu tương trên thế giới và các nước trồng đậu tương đạt năng suất và sản lượng cao. Với những mục đích trên, công tác này được tiến hành theo hai hướng chính: (1) Thu thập và nghiên cứ u nguồn gen đậu tương làm nguyên liệu cho lai tạo: Tại Trung Quố c và Hoa Kỳ , người ta đã thu thập được tập đoàn giống đậu tương lớn trên thế giới từ nhiều nước khác nhau như : Australia, Brazil, Đức, Nhật Bản , Ấn Độ , Thuỵ Điển, Nga… Tại Nhật Bản, từ năm 1960 một số giống đậu tương đã được lai tạo thành công, ví dụ như giống đậu tương Norin-59 có chất lượng hạt tốt, chống chịu được tuyến trùng, chống đổ, năng suất cao đã được lai tạo từ hai giống bố mẹ là Naugumitacodater và Tokokal. Ở Indonesia, các nhà nghiên cứu đã phân lập được một số giống có thời gian sinh trưởng ngắn từ 70-80 ngày như giống Kerinei, Rinani, MLg 254, B3334... Các giống này có thể trồng luân canh trên đất sau cây lúa trong điều kiện làm đất tối thiểu hoặc không làm đất vẫn đạt năng suất từ 1,5-1,7 tấn/ha. Ngoài ra , Rafalski và cá c tá c giả cũng đã chọn được các giống cứng cây , chống đổ tốt và chọn lọc thành công một số giống như Will đang được trồng phổ biến ở Indonesia [95]. (2) Thiết lập bản đồ gen đậu tương: Dự á n đậu tương lớn nhất tại Hoa Kỳ đã thố ng kê đượ c 72 bản đồ gen phân tử (molecular genetic maps) và bản đồ gen cổ điển (genetic classical maps) [117]. Các bản đồ gen này định vị
31 được 44.326 locus, 481 gen và nhiều QTL , một phần trong số đó đã được xác định liên kết với các tính trạng khác nhau. Các QTL có thể chia thành 4 nhóm chính liên quan đến chất lượng hạt và năng suất, bệnh và stress, cấu trúc thực vật... Kết quả giải trình tự gen đậu tương phát hiện thấy 210.991 chỉ thị SSR, tuy nhiên chỉ mới có 33.065 chỉ thị được nghiên cứu xác định trình tự mồ i để sử dụng . Nghiên cứu 19.000 mẫu giống đậu tương trong tập đoàn giống đã phát hiện thấy trên 60.000 SNP, nhưng chỉ có khoảng 1500 chỉ thị SNP đang được sử dụng trong các nghiên cứu. Dự án này còn thống kê được 94 loại mầm bệnh và 101 loại bệnh ở đậu tương [117]. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ gen trên cây đậu tương, việc tạo giống nhờ chuyển gen mong muốn như kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ...đã có một số thành tựu. Tuy nhiên, nguyên liệu đậu tương ban đầu vẫn phải chọn tạo từ thành quả nghiên cứu của tập đoàn giống có ưu thế. Vì vậy, việc nghiên cứu và đánh giá tính đa dạng di truyền với các mục đích chọn tạo nhất định vẫn luôn được quan tâm và coi trọng nhất. Việt Nam là quốc gia có nền sản xuất nông nghiệp lâu đời , cho nên cây đậu tương đã được trồng từ rất sớm . Hiện nay, ở nướ c ta cây đậu tương có vị trí rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, có nền kinh tế chưa phát triển. Ngoài việc cung cấp nguyên liệu chế biến làm thực phẩm cho con người , nguyên liệu cho xuất khẩu, cây đậu tương còn là nguồn cung cấp thức ăn cho chăn nuôi . Do đó , đậu tương cần được nghiên cứ u phá t triể n mạnh để tăng nguồn đạm cho con người, gia súc và trở thành mặ t hàng xuất khẩu chủ lực trong tương lai [3]. Cùng với xu hướng phát triển của thế giới, công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam cũng thu được kết quả tốt. Các giống được tạo ra phù hợp với nhu cầu tiêu dùng của nhân dân và điều kiện sinh trưởng từng vùng. Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã thu thập được trên 500 giống đậu tương, trong đó có cá c giống địa phương có khả năng chố ng chịu
32 nóng, chịu hạn và sâu bệ nh khá c nhau . Các giống nhập nội có hạt to, năng suất cao, chất lượng tốt thích ứng với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu của nước ta. Ngược lại, giống địa phương có năng suất thấp , chất lượng hạt trung bình nhưng có khả năng chịu nóng, chịu hạn. Các giống được tạo ra cũng phù hợp với mùa vụ gieo trồng từng vùng. Vùng miền núi và trung du bắc bộ, bộ giống thích hợp được nghiên cứu chọn tạo từ nhiều năm nay bao gồm: các giống vụ hè để trồng xen vụ (M103, Cúc Vàng,...) và các giống vụ đông như (VX93, V74...) [7]. Xét trong phạm vi toàn quốc, thì thời điểm nào trong năm chúng ta cũng có đậu tương thu hoạch. Đây là một ưu thế để tổ chức xây dựng công nghiệp chế biến sản phẩm đậu tương phát triển một cách cân đối. Có nhiều phương pháp chọn, tạo giống khác nhau: tuyển chọn giống thông qua tập đoàn nhập nội, lai hữu tính hoặc gây đột biến. Hiện tại, bộ giống đậu tương đưa ra sản xuất đại trà ở nước ta là rất phong phú, song giống đột phá về năng suất thì chưa có nhiều. Năm 2010, nước ta tăng diện tích trồ ng đậu tương toàn quốc lên khoảng 500.000-600.000ha, năng suất đạt trung bình 20-22 tạ/ha, sản lượng đạt 1,0-1,5 triệu tấn. Công tá c chọ n tạ o giố ng kế t hợ p vớ i cá c biệ n phá p kỹ thuậ t thâm canh tiên tiế n ở cá c địa phương nhấ t là trung du và miề n nú i đang ngà y cà ng đượ c quan tâm. Tuy nhiên, qua kiểm nghiệm thực tế cho thấy đậu tương là cây trồng bị nhiều sâu bệnh phá hoại. Cụ thể, có trên 70 loại sâu hại và 17 loại bệnh, trong đó có 12 - 14 loại sâu và từ 4 - 5 loại bệnh phổ biến nhất. Do đó, việc nghiên cứu phát triển các chỉ thị phân tử phục vụ cho chọn giống đậu tương là rất cần thiết.
33 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Vật liệu và phƣơng pháp thu thập lá bệnh Đề tà i đã s ử dụng 50 giống đậu tương , trong đó có 41 giố ng có nguồn gốc từ các địa phương Việt Nam do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ và Viện Di truyền Nông nghiệp thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Trường Đại học Cần Thơ cung cấp . Một số giống được thu thập từ các địa phương Cao Bằng, Hà Giang và Thái Nguyên, do các Trạm Khuyến nông cung cấp. Trong 9 giố ng nhậ p nộ i, có 4 giố ng khá ng bệ nh điể n hì nh dù ng là m đố i chứ ng do Việ n Bả o vệ Thự c vậ t cung cấ p . Ký hiệu và nguồn gốc các giống được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Danh sá ch cá c giố ng đậ u tƣơng nghiên cƣ́ u STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 1. PI200492 (Rpp1) PI200492 Nhậ t Bả n Kháng gỉ sắt 2. PI 230970 (Rpp2) PI230970 Nhậ t Bả n Chống bọ phấn, kháng gỉ sắt 3. PI 462312 (Rpp3) PI462312 Ấn Độ Kháng gỉ sắt 4. PI 459025 (Rpp4) PI459025 Trung Quố c Kháng gỉ sắt 5. ĐT2000 ĐT2000 Từ tập đoàn nhập nội của AVRDC, Đà i Loan Kháng gỉ sắt ở mức độ tốt 6. Cao Bằng U8325 CBU8325 Cao Bằng Kháng gỉ sắt, không chống chịu được bọ phấn 7. DT95 DT95 Giống đột biến từ AK04 Chống chịu được bệnh sương mai, gỉ sắt, vi khuẩn, đốm nâu. Chống đổ trung bình yếu.
34 STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 8. MTD65 MTD65 Miền tây Chịu nóng, chống chịu được vi khuẩn 9. Cúc nhật bóng Võ Nhai CNB Võ nhai, Thái Nguyên Có khả năng chịu lạnh, chịu nóng tốt, kháng sâu bệnh 10. Pa múng Trung Quốc PMTQ Nhập nội, trồng tại Hà Giang Chống chịu được bệnh phấn trắng, chống đổ, chịu lạnh, nóng tốt. 11. Hoàng Su Phì 2 HSP2 Hoàng Su Phì, Hà Giang Chịu lạnh, nóng tốt, chống chịu được bệnh phấn trắng 12. Hoàng Su Phì 1 HSP1 Hoàng Su Phì, Hà Giang Chịu lạnh, nóng tốt, chống chịu được bệnh phấn trắng 13. Zưmga Đắc Lắc ZG Đắc Lắc Chịu hạn tốt. 14. M103 M103 Giống quốc gia, chọn tạo từ phương pháp đột biến Có khả năng chịu nóng tốt 15. DT96 DT96 Con lai của DT84 Và DT90 Chống chịu được bệnh sương mai, gỉ sắt, vi khuẩn, đốm nâu. Chống đổ khá, chịu hạn khá, chịu lạnh, nóng tốt 16. Phúc Hòa Cao Bằng PHCB Phúc Hòa, Cao Bằng Chịu lạnh, nóng tốt, kháng gỉ sắt trung bình 17. Phúc Sen Cao Băng PS Phúc Sen Cao Bằng Chịu lạnh, nóng tốt, kháng trung bình 18. Phú Tâm PT Sóc Trăng Kháng gỉ sắt trung bình i 19. Nành sẻ ya Kon tum NS Kon Tum Kháng gỉ sắt trung bình, chịu nóng tốt
35 STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 20. Miên trạng 1 MT1 Miề n Tây, Nam Bộ Kháng gỉ sắt trung bình, chịu hạn, nóng tốt 21. Hậu Giang 2 HG2 Hậu Giang Kháng gỉ sắt trung bình 22. Việt Khái 2 VK2 Cà Mau Nhiễm gỉ sắt nhẹ 23. Cần Thơ 2 CT2 Cần Thơ Nhiễm gỉ sắt 24. Việt Khái 3 VK3 Cà Mau Nhiễm gỉ sắt 25. Cần Thơ 1 CT1 Cần Thơ Nhiễm gỉ săt 26. ĐT12 ĐT12 Từ tập đoàn nhập nội giống của Trung Quốc Có khả năng chống đổ tốt vì thân to, cây trung bình. 27. VX92 VX92 Từ tập đoàn nhập nội của Viện Nghiên cứu cây trồng Liên Bang Nga (VIR) Có khả năng chịu rét 28. VX93 VX93 Từ dòng K7002 (Viện cây trồng toàn liên bang Nga- VIR) có nguồn gốc từ Phillipin, giống quốc gia Chịu rét tốt 29. DT84 DT84 Từ Viện Di truyền nông nghiệp chọn tạo Chống đổ tốt, nhiễm nhẹ với sâu bệnh 30. V79 V79 Miền Nam Mẫn cảm với gỉ sắt 31. Cao Vàng CV Giống địa phương, có nguồn gốc từ Lục Ngạn, Bắc Giang Có khả năng chịu hạn tốt 32. Sơn La SL Giống địa phương Sơn La Mẫn cảm với gỉ sắt 33. Vàng Mường Khương VMK Giống địa phương của Lào Cai Khả năng chịu bệnh khá: sường mai, gỉ sắt, đốm nâu, vi khuẩn… Chống đổ yếu
36 STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 34. Hà Giang HG Hà Giang Chịu hạn tốt, nhiễm gỉ sắt nhẹ 35. Cao Bằng đen CBD Cao Bằng Nhiễm nhẹ gỉ sắt 36. Cao Bằng 7 CB7 Cao Bằng Nhiễm gỉ sắt 37. Quảng Hòa Cao Bằng QHCB Quảng Hòa, Cao Bằng Nhiễm gỉ sắt 38. Lơ Vạn Giã LVG Miền Nam Nhiễm gỉ sắt 39. Thường Tín Hà Tây TTHT Hà Tây Nhiễm gỉ sắt 40. Da bò bông tím DBBT Miền Tây, Nam Bộ Nhiễm gỉ sắt 41. Da trâu Bong trắng DTBT Miền Tây, Nam Bộ Nhiễm gỉ sắt 42. Miên trạng 2 MT2 Miền Tây, Nam Bộ Nhiễm gỉ sắt 43. Hậu Giang 1 HG1 Hậu Giang Nhiễm gỉ sắt 44. Hạt to liên nghĩa Đức Trọng HTDT Lâm Đồng Nhiễm gỉ sắt 45. Mandrak Đắclăk MD Đắc Lắc Nhiễm gỉ sắt 46. Duy Linh Lâm Đồng DL Lâm Đồng Nhiễm gỉ sắt 47. Minh Hải MH Minh Hải Nhiễm gỉ sắt 48. Ninh Dương Minh Hòa Khánh Hòa ND Khánh Hòa Nhiễm gỉ sắt 49. Chư sê Gia Lai CSGL Gia Lai Nhiễm gỉ sắt 50. Hồng Ngự HN Đồng Tháp Nhiễm gỉ sắt Nguồn bệnh gỉ sắt: nguồn bệnh để lây nhiễm là bào tử của lá nhiễm bệnh được thu thập ngoài đồng ruộng và nguồn nhiễm bệnh được chuẩn bị sẵn trong nhà lưới. Nguyên tắc thu thập lá bệnh: chọn lá còn xanh, bị bệnh trên 50% diện tích lá, vết bệnh nổi gờ cao, có ít bào tử; rửa lá sạch nhưng nhẹ
37 nhàng và hong cho đến khi ráo nước nhưng mặt lá vẫn còn ẩm; cho lá vào trong túi ni-lông hoặc giấy chống ẩm, đặt vào chỗ tối với khoảng thời gian 12 giờ ở nhiệt độ tối thích là 20 - 250 C để kích thích quá trình sinh bào tử. 2.1.2. Hóa chất Tris, EDTA (Ethylendiamine tetra acetic acid), glycine, CTAB (Cetylmethylammonium bromide), Taq DNA polymerase (hãng Bio - Lad),  - mecaptoethanol, phenol, chloroform: isoamyl alcohol (24:1), Natriacetate, ethanol (70%, 100%), RNase, dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), agarose, ethidium bromide (EtBr), AgNO3, các hóa chất điện di SDS-PAGE, điện di 2- DE như: Acrylamide, bis acrylamide, APS, TEMED, Urea, CHAPS, DTT, IAA, Bio-Lyte 3/10 ampholyte, thanh cố định gradient pH 3-10; thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x được mua từ hãng Bio -Rad (Hercules, CA, Mỹ) và các hoá chất thông dụ ng khác được mua của các hã ng Merck, Invitrogen, Amersham Pharmacia Biotech, New England Biolabs. 2.1.3. Máy móc và thiết bị - Máy quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia). - Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ). - Máy phân tích amino acid tự động - HPLC amino Quan SeriesII (Hewlett Parkard, Hoa Kỳ). - Máy PCR PTC - 100TM (MJ Research, Hoa Kỳ). - Máy soi DNA (Mini - transllumminator. Bio-Rad, Hoa Kỳ). - Máy li tâm lạnh Hettich (Đức). - Máy li tâm Avanti TM30 (Backman, Hoa Kỳ). - Máy ly tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, Đức). - Máy khuấy trộn (Voltex) (Minishaker, IKA, Đức). - Máy hút chân không SpeedVac 110A (Savant, Hoa Kỳ).
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau

Recommended

Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đ
Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đLuận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đ
Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Luận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc
Luận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền BắcLuận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc
Luận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền BắcDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Sự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giới
Sự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giớiSự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giới
Sự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giớiDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...
Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...
Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...
Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...
Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...Dịch Vụ Viết Thuê Khóa Luận Zalo/Telegram 0917193864
 
Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...
Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...
Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổi
Luận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổiLuận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổi
Luận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổiDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Luận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAY
Luận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAYLuận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAY
Luận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 

Recommended

Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đ
Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đLuận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đ
Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Luận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc
Luận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền BắcLuận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc
Luận văn: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền BắcDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Sự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giới
Sự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giớiSự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giới
Sự biến đổi của gen mã hóa enzym chuyển hóa Xenobiotics ở nam giớiDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...
Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...
Đột biến, biểu hiện gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi - Gửi miễ...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...
Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...
Luận án: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl ...Dịch Vụ Viết Thuê Khóa Luận Zalo/Telegram 0917193864
 
Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...
Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...
Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổi
Luận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổiLuận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổi
Luận án: Xác định đột biến gen EGFR trong điều trị bệnh ung thư phổiDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Luận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAY
Luận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAYLuận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAY
Luận án: Biến tính diatomit Phú Yên ứng dụng trong hấp phụ, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Tạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn cao
Tạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn caoTạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn cao
Tạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn caoDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lậpCăn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lậpDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAY
Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAY Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAY
Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAYDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đKháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi người
Luận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi ngườiLuận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi người
Luận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi ngườiDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 
Luận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâu
Luận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâuLuận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâu
Luận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâuDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...nataliej4
 
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đĐề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Sinh hoc dai cuong byt
Sinh hoc dai cuong bytSinh hoc dai cuong byt
Sinh hoc dai cuong bytTriều Dương
 
Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...
Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...
Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...Dịch Vụ Viết Thuê Khóa Luận Zalo/Telegram 0917193864
 
Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...
Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...
Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...Viết thuê trọn gói ZALO 0934573149
 
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đ
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đLuận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đ
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đDịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...Dịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn laoLuận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn laoDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...Thảo Nguyễn
 
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtz
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtzNâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtz
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtzThanh Hoa
 

More Related Content

What's hot

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...nataliej4
 
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...https://www.facebook.com/garmentspace
 

What's hot (15)

Tạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn cao
Tạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn caoTạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn cao
Tạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn cao
 
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lậpCăn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
 
Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAY
Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAY Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAY
Điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, HAY
 
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đKháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
 
Luận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi người
Luận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi ngườiLuận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi người
Luận án: Yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi người
 
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO - TẢI ...
 
Luận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâu
Luận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâuLuận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâu
Luận án: Chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâu
 
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...
đáNh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm npv (nuclear polyhedro...
 
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
 
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
 
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...
Khảo Sát Tác Dụng Hạ Enzym Gan Của Các Loại Cao Chiết Dược Liệu Trên Gan Chuộ...
 
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đĐề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
 
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...
Luận án tiến sĩ hóa học phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tí...
 
Sinh hoc dai cuong byt
Sinh hoc dai cuong bytSinh hoc dai cuong byt
Sinh hoc dai cuong byt
 
Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...
Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...
Đề tài: Đánh giá hiệu quả Vinorelbine điều trị ung thư vú giai đoạn tái phát ...
 

Similar to Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau

Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...Viết thuê trọn gói ZALO 0934573149
 
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...Thảo Nguyễn
 
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtz
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtzNâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtz
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtzThanh Hoa
 
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...Viết thuê trọn gói ZALO 0934573149
 
Luận văn thạc sĩ
Luận văn thạc sĩ Luận văn thạc sĩ
Luận văn thạc sĩ ssuser499fca
 
Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.
Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.
Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.ssuser499fca
 

Similar to Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau (20)

Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...
Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...
Đề tài: Mối liên quan giữa các biến đổi nucleotid thường gặp của các gen CYP1...
 
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...
Luận văn: Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus Monodon) sử dụng...
 
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đ
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đLuận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đ
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Rosa và Grube, 9đ
 
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...
Luận văn: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1...
 
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn laoLuận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
 
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...
Nghiên cứu đa hình một số gen qui định sinh trưởng và khả năng sản xuất thịt ...
 
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtz
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtzNâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtz
Nâng cao hiệu quả huy động vốn tại ngân hàng tmcp bưu điện liên việtz
 
Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu
Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệuLuận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu
Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu
 
Đề tài: Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguy...
Đề tài: Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguy...Đề tài: Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguy...
Đề tài: Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguy...
 
Luận án: Xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh
Luận án: Xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinhLuận án: Xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh
Luận án: Xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh
 
Luận án: Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt
Luận án: Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệtLuận án: Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt
Luận án: Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt
 
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (...
 
Luận văn thạc sĩ
Luận văn thạc sĩ Luận văn thạc sĩ
Luận văn thạc sĩ
 
Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.
Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.
Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.
 
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAYLuận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
 
Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và định lượng nồng độ EBV-...
Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và định lượng nồng độ EBV-...Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và định lượng nồng độ EBV-...
Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và định lượng nồng độ EBV-...
 
Định lượng nồng độ EBV-DNA huyết tương trong ung thư Vòm Mũi Họng
Định lượng nồng độ EBV-DNA huyết tương trong ung thư Vòm Mũi HọngĐịnh lượng nồng độ EBV-DNA huyết tương trong ung thư Vòm Mũi Họng
Định lượng nồng độ EBV-DNA huyết tương trong ung thư Vòm Mũi Họng
 
Đề tài: Đánh giá hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi biểu mô...
Đề tài: Đánh giá hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi biểu mô...Đề tài: Đánh giá hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi biểu mô...
Đề tài: Đánh giá hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi biểu mô...
 
Luận án: Hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi, HAY
Luận án: Hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi, HAYLuận án: Hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi, HAY
Luận án: Hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi, HAY
 
Dược động học quần thể và PK/PD của kháng sinh carbapenem
Dược động học quần thể và PK/PD của kháng sinh carbapenemDược động học quần thể và PK/PD của kháng sinh carbapenem
Dược động học quần thể và PK/PD của kháng sinh carbapenem
 

More from https://www.facebook.com/garmentspace

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.dochttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...https://www.facebook.com/garmentspace
 

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
 

Recently uploaded

SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...ChuThNgnFEFPLHN
 
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoáCác điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoámyvh40253
 
Bài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptx
Bài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptxBài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptx
Bài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptxDungxPeach
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
GIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘI
GIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘIGIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘI
GIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘIĐiện Lạnh Bách Khoa Hà Nội
 
bài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docx
bài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docxbài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docx
bài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docxTrnHiYn5
 
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiệnBài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiệnpmtiendhti14a5hn
 
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...hoangtuansinh1
 
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.pptAccess: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.pptPhamThiThuThuy1
 
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng ĐồngGiới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng ĐồngYhoccongdong.com
 
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hànhbài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hànhdangdinhkien2k4
 
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docxTHAO316680
 
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdfCampbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdfTrnHoa46
 
xemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdf
xemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdfxemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdf
xemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdfXem Số Mệnh
 
powerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgs
powerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgspowerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgs
powerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgsNmmeomeo
 
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiTrắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiNgocNguyen591215
 
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...Nguyen Thanh Tu Collection
 
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhhkinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhhdtlnnm
 
Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................TrnHoa46
 
xemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdf
xemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdfxemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdf
xemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdfXem Số Mệnh
 

Recently uploaded (20)

SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
 
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoáCác điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
 
Bài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptx
Bài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptxBài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptx
Bài tập nhóm Kỹ Năng Gỉai Quyết Tranh Chấp Lao Động (1).pptx
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
GIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘI
GIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘIGIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘI
GIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘI
 
bài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docx
bài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docxbài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docx
bài thi bảo vệ nền tảng tư tưởng của Đảng.docx
 
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiệnBài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
 
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
 
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.pptAccess: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
 
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng ĐồngGiới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
 
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hànhbài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
 
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
 
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdfCampbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
 
xemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdf
xemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdfxemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdf
xemsomenh.com-Vòng Thái Tuế và Ý Nghĩa Các Sao Tại Cung Mệnh.pdf
 
powerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgs
powerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgspowerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgs
powerpoint mẫu họp phụ huynh cuối kì 2 học sinh lớp 7 bgs
 
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiTrắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
 
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
 
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhhkinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
 
Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................
 
xemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdf
xemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdfxemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdf
xemsomenh.com-Vòng Tràng Sinh - Cách An 12 Sao Và Ý Nghĩa Từng Sao.pdf
 

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VŨ THANH TRÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. TS. Trần Thị Phƣơng Liên Thái Nguyên - 2012
  • 2. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Tác giả Vũ Thanh Trà
  • 3. ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải và các cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS. Nguyễn Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh. Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). Tác giả luận án Vũ Thanh Trà
  • 4. iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan................................................................................................... i Lời cảm ơn ...................................................................................................... ii Mục lục............................................................................................................iii Danh mục các từ viết tắt.................................................................................. v Danh mục các bảng .........................................................................................vii Danh mục các hình..........................................................................................viii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4 1.1. Cây đậu tương và đặ c điể m hó a sinh củ a cây đậ u tương .........................................4 1.1.1. Cây đậu tương ..............................................................................................4 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương .........................................................5 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ..................................9 1.2.1. Bệ nh gỉ sắ t ở cây đậ u tương.........................................................................9 1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương...................................................13 1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương .........................17 1.3.1. Phương phá p sử dụ ng chỉ thị hình thái ........................................................17 1.3.2. Phương phá p sử dụ ng chỉ thị hoá sinh học .................................................18 1.3.3. Phương phá p sử dụ ng chỉ thị phân tử DNA ................................................20 1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ................................................26 1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương ..................................................29 Chƣơng 2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U ..................33 2.1. Vật liệu .........................................................................................................33 2.1.1. Vậ t liệ u và phương phá p thu thậ p lá bệ nh ...................................................33 2.1.2. Hóa chất........................................................................................................37 2.1.3. Máy móc và thiế t bị ......................................................................................37 2.1.4. Mồ i củ a phả n ứ ng RAPD và SSR................................................................38 2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................40 2.2.1. Phương phá p nhiễ m bệ nh nhân tạ o..............................................................40
  • 5. iv 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh...........................................................43 2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA........................................44 2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein ....................................................48 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................53 3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương nghiên cứu .......................................................................................................53 3.2. Phân tí ch đặ c điể̉ m hó a sinh hạ t củ a cá c giống đậu tương nghiên cứu.... 58 3.2.1. Kế t quả phân tích hà m lượng protein và lipid trong cá c hạ t củ a các giống đậu tương nghiên cứu .....................................................................58 3.2.2. Phân tích tính hà m lượ ng và thà nh phầ n amino acid trong hạt của mộ t số giố ng đậ u tương....................................................................................61 3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt ................................................................................64 3.3.1. Phân tí ch tính đa hình DNA củ a cá c giố ng đậ u tương bằ ng chỉ thị phân tử RAPD..............................................................................................................................64 3.3.2. Phân tí ch tính đa hình DNA của cá c giố ng đậ u tương bằng chỉ thị phân tử SSR ..................................................................................................70 3.4. Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương phản ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt ................................................................76 3.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE .........................................................77 3.4.2. Phân tích các protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều ......................79 3.4.3. Nghiên cứ u tính đa hình protein củ a cá c giống đậu tương bằ ng kỹ thuậ t điệ n di hai chiề u ......................................................................................90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................99 1. Kết luận .......................................................................................................99 2. Đề nghị ........................................................................................................100 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN........101 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................102
  • 6. v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µl Microliter 2DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều AFLP Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn được nhân bản APS Ammonium persulfate AUDPC Area Under Disease Progress Curve Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan bp Base pair - cặp bazơ CHAPS 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio] cm Centimeter CTAB Cetylmethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid - ADN dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid ESI-Q TRAP Elecspray ionization Q Trap- Phương phá p khố i phổ sử dụ ng tính năng bẫ y ion kế t hợ p nguồ n ion hó a bằ ng cá ch phun chù m điệ n tử EtBr Ethidium bromide HPLC High-performance liquid chromatography-Sắ c ký lỏ ng hiệ u năng cao IAA Indole-3-acetamide IEF Isoelectric Focusing – Phương phá p điệ n di theo điể m đẳng điện IMA Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria INTSOY International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế, Hoa Kỳ IPG Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định IRRI International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc tế, Philippin Kb Kilo base
  • 7. vi kDa Kilo Dalton mA MiliAmpe MAS Marker Assisted Selection -Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử ml Mililiter MS/MS Mass spectrometry/ Mass spectrometry - Khố i phổ liên tụ c NST Nhiễ m sắ c thể OD Optical Density- Mậ t độ quang họ c PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợ p polymerase PEG Polyethylene glycol PIC Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride PR protein Pathogenesis-related protein - Protein liên quan đến mầm gây bệnh. QTL Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng R gen Resistant gen – Gen kháng bệnh R protein Resistant protein - Protein khá ngbệnh RAPD Random amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction fragment length polymorphism - Đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế RNA Ribonucleic acid SAR Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống SDS Sodium dodecyl sulfate SDS- PAGE SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis - Điện di biến tính trên gel polyacrylamide có SDS SSR Simple Sequence Repeat - Trình tự lặp lại đơn giản TAE Tris acetate EDTA TCA Trichloracetic acid TEMED N,N,N‟,N‟ Tetramethylethylenediamine UPGMA Phương pháp phân nhóm V Volt – Vôn w/v Weight/volume - Khối lượng/thể tích
  • 8. vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sá ch các giống đậ u tương nghiên cứu....................................................33 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD ...........................................................38 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR .......................................................39 Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến ......................46 Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide ......................................................................49 Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt ..................................53 Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipid trong hạt của 50 giố ng đậ u tương ......................59 Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giố ng đậ u tương................................63 Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu.........................67 Bảng 3.5. Kế t quả phân tích sự đa dạ ng di truyề n bằ ng chỉ thị SSR....................................72 Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống ĐT 2000 đượ c nhậ n diệ n bằ ng phương phá p khố i phổ ...........................................................84 Bảng 3.7. Đa dạ ng mứ c độ biể u hiệ n củ a cá c protein giữ a mẫu thí nghiệ m và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh(ĐT12 và VMK)...................................92 Bảng 3.8. Nhậ n diệ n cá c protein có mứ c độ biể u hiệ n khá c nhau giữ a thí nghiệ m và đố i chứ ng ở hai giố ng nhiễm bệnh ĐT12 và VMK.........................93 Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và giống kháng (ĐT2000, CBU8325) .....................................................................96 Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm với và giống khá ng bệ nh gỉ sắt .................................................................97
  • 9. viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B)..............................................10 Hình 1.2. Hình ảnh nấm P. pachyrhizi gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương chụp dưới kính hiển vi điện tử .................................................................................12 Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm.........................................14 Hình 1.4. Sơ đồ phân tá ch protein bằ ng diệ n di 2-DE ....................................................19 Hình 2.1. Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm .......................................................................................................42 Hình 2.2. Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry............................43 Hình 3.1. Hình ảnh lá của các giống đậu tương ở 3 mức độ phản ứng với bệnh gỉ sắ t..................................................................................................57 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 ..............................................65 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18...............................................66 Hình 3.4. Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân nhóm UPGMA.................................................................................................69 Hình 3.5. Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C), Satt 005 (D) của 50 giống đậu tương......................................................................71 Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR ..................................74 Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá đậu tương VMK, CBU8325, ĐT12 và ĐT 2000 ............................................78 Hình 3.8. Hình ảnh điện di2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu tương giống ĐT2000 ở thời điểm6 (A) ngày và9 ngày (B)...............................79
  • 10. ix Hình 3.9. So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống ĐT12, ĐT2000, CBU8325 và VMK...............................................................81 Hình 3.10. Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký - khối phổ ...........................................................................................................83 Hình 3.11. Sơ đồ phân nhó m chức năng protein lá đậu tương giống ĐT2000............................................................................................................89 Hình 3.12. So sá nh đa dạ ng protein lá đậ u tượ ng đố i chứ ng và thí nghiệ m của 2 giố ngsau khi gây nhiễ m bệ nh9 ngày(ĐT12 và VMK) ..............................91 Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9 ngày của 2 giố ng nhiễm bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và 2 giố ng khá ng bệ nh gỉ sắt (ĐT2000 và CBU8325)............................................95
  • 11. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao , mang ý nghĩa trong cả i tạ o đấ t trồ ng , dễ canh tá c, đặ c biệ t có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau . Hạt đậu tương chứ a 30-55% protein, chứ a nhiề u loạ i amino acid không thay thế (lysine, leucine, tryptophan, methionine, cysteine…), 12-25% lipid và cá c vitamin (B1, B2, C, D, E, K…) cầ n thiế t cho cơ thể . Các sản phẩm từ đậu tương được sử dụ ng rộ ng rã i cho cá c mụ c đích khá c nhau như là m thứ c ăn , dầ u ăn, thự c phẩ m chứ c năng , nguyên liệ u cho y họ c và công nghiệ p…Bên cạ nh giá trị dinh dưỡ ng ca o, cây đậ u tương cò n có khả năng cố định đạ m nhờ vi khuẩ n Rhizobium số ng cộ ng sinh trên rễ cây tạ o thà nh cá c nố t sầ n. Vì thế, việ c trồ ng cây đậ u tương không chỉ mang lạ i hiệ u quả kinh tế cao mà cò n có tá c dụ ng cả i tạo đất. Do đó , cây đậ u tương đã đượ c quan tâm trồ ng và phá t triể n mạ nh ở nhiề u quố c gia trên thế giớ i . Ở Việt Nam, đậu tương là cây trồ ng chính đượ c ưu tiên khuyế n khích phá t triể n, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạ c. Việ t Nam từ ng là một nước “xuất khẩu” đậu tương vào những năm 1980 theo hạng mục tiểu ngạch , tuy nhiên cho đế n nay nướ c ta đã trở thà nh nướ c nhậ p khẩu đậ u tương vớ i số lượ ng lớ n hà ng triệ u tấ n khô dầ u đậ u tương hàng năm. Mặ c dù diệ n tích g ieo trồ ng có tăng hà ng năm nhưng năng suấ t thấ p và sả n lượ ng đạ t đượ c không ổ n định , khả năng chống chịu bệnh và các stress ké m. Sâu bệ nh nó i chung và bệ nh gỉ sắ t nó i riêng là nguyên nhân trự c tiế p ả nh hưở ng tớ i diệ n tích gieo trồ ng và là m giả m năng suấ t , chấ t lượ ng hạ t đậ u tương, gây tổ n thấ t lớ n về kinh tế . Bệ nh gỉ sắ t ở đậ u tương do loà i nấ m P. pachyrhizi gây ra và đang đượ c coi là mộ t trong nhữ ng mố i đe dọ a chính trên cây đậ u tương gây thiệ t hạ i đá ng kể , làm giảm từ 10-80% năng suấ t và chấ t lượ ng đậ u tương ở nhiề u
  • 12. 2 nướ c trên thế giớ i trong đó có Việ t Nam . Yêu cầ u đặ t ra hiệ n nay là cầ n phả i chuyể n giao cá c tiế n bộ khoa họ c kỹ thuậ t đặ c biệ t là tạ o ra nhữ n g giố ng cây có năng suất cao, có khả năng chống chịu bệnh để đưa vào sản xuất mở rộng diệ n tích gieo trồ ng và nâng cao chấ t lượ ng hạ t , đá p ứ ng đượ c nhu cầ u đậ u tương trong nướ c cũ ng như phụ c vụ xuấ t khẩ u . Do đó , nghiên cứ u chọn tạ o các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải pháp mang tính chiế n lượ c cho sự phá t triể n bề n vữ ng. Trong nhữ ng năm gầ n đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể , tuy nhiên hầ u hế t cá c nghiên cứ u nà y mớ i chỉ tậ p trung và o việ c giá m sá t quá trình phá t triể n bệ nh , nghiên cứ u dịch tễ họ c, đá nh giá sự thấ t thu năng suấ t hoặ c phân tích phả n ứ ng bệ nh mà chưa chú t rọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này . Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao. Xuấ t phá t từ nhữ ng lý do trê n chúng tôi lự a chọ n và thự c hiệ n đề tà i : “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Đánh giá đượ c khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ sắt nhằ m phá t hiệ n cá c giố ng khá ng và nhiễ m mớ i. 2.2. Xác định được sự đa dạng di truyền ở mứ c độ DNA củ a cá c giố ng đậ u tương nghiên cứ u.
  • 13. 3 2.3. So sá nh đa hình protein , lập đượ c sơ đồ điện di protein lá đậu tương , sơ bộ rú t ra đượ c né t đặ c trưng về protein giữ a giố ng khá ng và giố ng nhiễ m bệnh gỉ sắt. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương. - Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid trong hạt của các giống đậu tương nghiên cứu. - Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR. - Lập sơ đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein lá đậu tương bằng phương pháp điện di một chiều , hai chiều và nhậ n diệ n protein trên hệ sắ c ký -khối phổ. Đồng thời phân tích, so sá nh sự đa dạ ng thà nh phầ n protein lá củ a mộ t số giố ng đậu tương nhiễ m và khá ng bệnh gỉ sắt.
  • 14. 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1. Cây đậu tƣơng Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ đậu (Fabaceae). Chi Glycine có hai chi phụ là Glycine và Soja. Chi phụ Soja có hai loài là G.max (L.) Merrill và G. soja Sieb. et Zucc. Glycine soja là dạng mọc leo hoang dại, hạt nhỏ, cứng và sản lượng thấp nên không được sử dụng trong nông nghiệp. Glycine max không thấy mọc hoang dại. Về nguồn gốc, đậu tương có nguồn gốc từ Đông Á , có thể mọ c hoang dại từ thung lũng sông Dương Tử , các tỉnh phía Bắc và Đông Bắc Trung Quốc, hoặ c các vùng kế cận của Cộng hò a liên bang Nga , Triều Tiên và Nhật Bản. Hầu hết các giống đậu tương địa phương đang trồng tại nước ta hiệ n nay đều du nhập từ Trung Quốc [8]. Về đặc điểm hình thái, cây đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá mầm (lá tử diệp), lá nguyên (lá đơn) và lá kép, mỗi lá kép có từ 3 - 4, thậm chí đến 5 lá chét, mọc so le. Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm, có màu sắc tuỳ từng giống khác nhau: màu trắng, tím, tím nhạt. Tỷ lệ đậu quả 20 - 30% tuỳ từng vụ... Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu nâu. Tuỳ điều kiện canh tác mỗi cây con cho từ 20 - 400 quả. Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt... có giá trị dinh dưỡng cao. Hạt to, nhỏ tuỳ theo các giống khác nhau, khối lượng 1000 hạt thay đổi trung bình từ 100 - 200g. Màu sắc rốn hạt ở các giống khác nhau là một biểu hiện đặc trưng của giống [9]. Về đặc điểm di truyền, đậu tương Glycine max có bộ nhiễm sắc thể (NST) lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn , ít có khả năng thụ phấn chéo .
  • 15. 5 Những nghiên cứu về hệ gen (genome) đậu tương cho thấy, bộ gen đậu tương có từ 1,29 x 109 đến 1,8 x 109 bp cho bộ đơn bội. Trong số đó có khoảng 40 - 65% trình tự lặp lại (những trình tự này có kích thước nhỏ hơn 0,3 - 0,4kb), các trình tự không lặp lại chiếm khoảng 35 - 60% (có chiều dài 1,1 - 1,4kb) được xếp xen kẽ với trình tự lặp lại [95]. Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm (từ 75 - 85 ngày); chín trung bình (từ 85 - 100 ngày) và chín muộn (từ 100 - 120 ngày). Thời gian sinh trưởng là yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh hay xen vụ. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và các mầm bệnh, các giống thường thích hợp với từng vụ khác nhau [3]. 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tƣơng 1.1.2.1. Thành phần protein trong hạt đậu tương Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 12-55%. Thực tế cho thấy, tuy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong hạt của loài thực vật này nhưng chúng vẫn lớn hơn hàm lượng protein của nhiề u loài thực vật khác [6]. Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp nguồn amino acid và nitơ hoặ c là cá c enzyme tham gia và o quá trình nảy mầm của hạt. Loại protein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin. Dựa vào hệ số lắng, người ta chia protein của hạt đậu thành 3 loại: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Những loại protein chính trong hạt đậu tương là: protein dự trữ (chiếm 70% tổng số protein), các enzyme, các chất ức chế protease và lectin. Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan trong nước (75,8%), globulin tan trong NaCl là 3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7%. Protein dự trữ trong hạt đậu tương bao gồm hai thành phần: conglyxinin (7,9S) và glyxinin (12,2S). Conglyxinin là vixilin của đậu tương,
  • 16. 6 có hệ số lắng là 7,9S, là protein dự trữ phổ biến trong hạt. Conglyxinin tách biệt ra trong các thể protein và được dự trữ trong suốt quá trình phát triển của hạt. Nó được thuỷ phân sau khi hạt nảy mầm để cung cấp nguồn carbon và nitơ cho hạt phát triển. -conglyxinin là một trong những cấu tử của conglyxinin, có khối lượng phân tử là 140 - 180 kDa. -conglyxinin gồm có nhiều tiểu phần khác nhau, trong đó có 3 tiểu phần chính là  (76 kDa), ‟ (72 kDa),  (53 kDa). Ngoài ra, còn có các tiểu phần nhỏ khác hiếm hơn đã được mô tả là ‟, ,  [94]. Thành phần thứ hai là glyxinin vớ i hệ số lắng 12,2S và là dạng legumin của đậy tương. Glyxinin là protein chứa nhiều nhất trong đậu tương. Glyxinin là một hexamer protein gồm 5 tiểu phần. Mỗi tiểu phần bao gồm một chuỗi polypeptide có tính acid (trọng lượng phân tử xấp xỉ 31 - 45 kDa) ký hiệu là A1a, A1b, A2, A3, A4 và chuỗi polypeptide có tính kiềm (khối lượng phân tử xấp xỉ 18 - 20 kDa) ký hiệu là B1b, B1a, B2, B3, B4, được nối với nhau bằng cầu nối disulfide [114]. Các giống đậu tương khác nhau cũng khác nhau về thành phần các chuỗi polypeptide cấu tạo nên glyxinin. Glyxinin của các giống khác nhau đã được chứng minh là khác nhau về thành phần amino acid, trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện (isoelectric point-pI). Tỷ lệ giữa glyxinin và -conglyxinin là 1,6: 1,0 (biến thiên từ tỉ lệ 3,0: 1,0 đến 1,0: 1,0 tuỳ giống). Glyxinin là nguồn dự trữ carbon và nitơ và được tích trữ trong quá trình hình thành phôi. Protein của cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng được coi là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, bởi vì chúng chứa tất cả các amino acid không thay thế và cần thiết cho cơ thể. Hơn nữa protein của cây họ đậu còn có hàm lượng lysine rất cao so với protein từ các loại ngũ cốc khác. Tuy vậy, hàm lượng các amino acid chứa gốc SH như methionine, cysteine vẫn còn thấp [3].
  • 17. 7 1.1.2.2. Lipid, vitamin và một số chất khác trong hạ t đậ u tương Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hoà tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, benzen, toluen, ete, dầu hoả... Lipid còn là thành phần quan trọng của màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể . Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô. Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E (200 mg/100g lipid). Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như carbohydrade , muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh trưởng [3]. Nói chung, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao. Giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipid, trong đó hàm lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quyết định, làm cho hạt đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người và làm thức ăn cho gia súc. Hạt đậu tương có thể chế biến ra 600 sản phẩm khác nhau. Bên cạnh đó, đậu tương còn được dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có màu đen. 1.1.2.3. Protein lá và hệ protein lá đậ u tương Protein là các đại phân tử có ở trong tất cả các loại tế bào và các bào quan. Protein lá đậ u tương rất đa dạng , có hàng nghìn loại với kích thước phân tử khác nhau , từ những peptide nhỏ đến những phân tử với khối lượng lớ n. Protein có nhiề u vai trò khác nhau về chức năng sinh học, nhưng chủ yế u đó ng vai trò quan trọ ng trong quá trình quang hợ p giú p tổ ng hợ p chấ t dinh dưỡ ng từ nguồ n năng lượ ng á nh sá ng mặ t trờ i. Hệ protein (Proteome) là phần bổ trợ của hệ gen (Genome), hệ protein lá đậu tương bao gồm tất cả các protein có mặt trong tế bào lá ở một thời điểm nhất định . Trong lá có cá c protein liên quan đế n chu trình quang hợ p ,
  • 18. 8 các protein tham gia vào phản ứng quang hóa, các protein dự trữ, các enzyme, các chất đề kháng , chấ t oxi hó a ... Ở các mô khác nhau, các giai đoạn khác nhau hệ protein lại có sự khác nhau . Vì hệ protein lá rất phong phú , đa dạng và không ổn định như hệ gen củ a cây đậ u tương cho nên nghiên cứu hệ protein lá không hề đơn giả n và đòi hỏi sự kết hợp của rất nhiều công nghệ và kỹ thuật [68], [86], [100]. Chức năng chính của lá thực vật là thu nhận năng lượ ng á nh sá ng , chuyển hóa chúng và dữ trữ dưới dạng các liên kết hóa học . Do đó, có một số lượng lớn các protein của lá đậu tương là các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất và chuyể n hó a năng lượng. Các protein lá đậu tương có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử như tiểu phần trung tâm phản ứng PSI, protein phức hệ liên quan oxi PSII, carbonic anhydrase, ferrodoxin. Các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi và chuyển hóa carbon như Rubisco, malate dehydrogenase, sedoheptulose-1,7-biphosphatase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triosephosphate isomerase, phosphoglycerate kinase. Rubisco là enzyme chính có vai trò rất quan trọng trong quá trình cố định carbon. Ngoài ra, protein lá đậu tương có thể là các protein dự trữ như vegetative storage protein, stem 28 kDa protein, cyclophilin hoặc các protein có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress như ascorbate peroxidase, catalase. 1.1.2.4. Mộ t số nghiên cứ u về hệ protein lá đậu tương Gầ n đây, các nghiên cứu về protein thực vật sử dụng phương pháp điện di 2 chiề u (Two dimension electrophoresis-2DE) đã được công bố [33], [58], [74], [86], [92]. Một số nghiên cứ u tập trung vào các protein của các bào quan như lục lạp [47], [72], ty thể [33], một số lại tập trung vào các mô thực vật như lá ngô [92], lá đào [101]. Các nghiên cứu trên rễ đậ u tương [116] hoặ c
  • 19. 9 trên hạt đậ u tương đã thu được một số kết quả đáng kể [58], [83], [86], tuy nghiên các nghiên cứu về protein ở lá đậu tương vẫn đang ở mức sơ khai . Trong nghiên cứ u củ a Sarma và cộ ng sự , các tác giả đã thành công trong việc phân tá ch hà ng trăm cá c protein củ a cá c mô như lá, hạt và rễ đậu tương khi sử dụng phương pháp tách chiết protein và điện di 2 chiề u [100]. Trong khi đó , Krishnan và cộ ng sự đã nghiên cứ u hệ protein lá đậ u tương bằ ng phương phá p điệ n di 2 chiề u và khố i phổ , các tác giả đ ã phát hiện được 28 loại phosphoprotein trong lá [68]. Tương tự trong nghiên cứ u củ a Xu và cộng sự , bằ ng phương phá p điệ n di và khố i phổ cá c tá c giả đã phân tá ch đượ c 119 điể m protein trong đó đã nhậ n diệ n đượ c 71 protein ở lá đậ u tương [113]. Đây là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn , bằ ng việ c á p dụ ng cá c kỹ thuậ t proteomics (kỹ thuật nghiên cứu , phân lậ p, tách chiết, phân tá ch và nhậ n diệ n cấ u trú c , chứ c năng củ a hệ protein ) các tá c giả đã gợ i ý các ứng dụng trong việc xác định cá c protein khá ng bệ nh. Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế. Đặc biệt trong vấn đề phân tích, nhận dạng và so sánh các protein lá đậu tương còn ít được công bố [113]. Từ thực tiễn đó, trong khuôn khổ luận án này chúng tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và so sánh protein của lá đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồ ng đậu tương. Hầ u hế t cácnước nhiệt đới và cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương. Bệnh gỉ sắt(soybean rust) được phát hiện đầu tiên vào năm1902 ở Nhật Bả n sau đó lan nhanh sang hầu hết các nước châu Á , châu Phi, Nam Mỹ [80] và Mỹ
  • 20. 10 [102]. Các phát hiện về bệnh gỉ sắt ở Hawaii năm 1994 [67], Zimbabwe năm 1998 [69], Nigeria năm 1999 [28], Nam Mỹ năm 2001 [93], và Argentina năm 2002 [99] cho thấy nấm P. pachyrhizi vẫn đang lan tràn sang các vùng địa lý mới và ảnh hưởng nghiêm trọng đến mùa màng. Bệnh gỉ sắt được coi là mối đe dọa chính đối với năng suất đậu tương tại Mỹ [102]. Ở Brazil, bệnh này gây thiệt hại 1,2 tỷ đô la chỉ riêng trong năm 2003 [115]. Tại các nước bệnh đã trở thành dịch, năng suất đậu tương có thể giảm từ 10% đến 80% [90]. Về mầ m bệ nh, bệnh gỉ sắt ở đậu tương do hai loài nấm là P. pachyrhizi và P. meibomiae gây ra. Loài nấm gỉ sắt ở Châu Á P. pachyrhizi Sydow là loài gây hại nhất cho đậu tương và có độc tính cao hơn loài P. meibomiae (hình 1.2). Nấm gỉ sắt là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới cũ ng như ở Việt Nam. Nấm gỉ sắt là loại nấm ký sinh phá huỷ lớp tế bào bao bọc làm cho cây bị thoát hơi nước mạnh, các bộ phận cung cấp nước không thể tiếp tế đủ số nước bị mất đi, dẫn đến mất cân bằng giữa lượng nước hút vào và lượng nước thoát hơi, kết quả cây đậu tương bị héo. A B Hình 1.1. Mặt sau lá đậu tƣơng bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bà o tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) [118]
  • 21. 11 Dấ u hiệ u và triệ u chứ ng bệ nh : Nấm gỉ sắt phát triển trên tế bào và có mặt ở hầu hết các vụ cây trồng , nhưng bệnh chỉ phát sinh và phá hại nặng nhất trong vụ đậu tương xuân . Bệnh gây hại nặng nhất ở lá , nhưng cũng có thể ở trên thân, cành và quả. Biểu hiện sớm nhất của bệnh là những chấm màu trong ở phiến lá , cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu , đạt tới kích thướ c từ 2-5mm với hình đa dạng , có góc cạnh (Hình 1.1A). Các vết bệnh có thể phát triển rộng và liên kết với nhau thành từng mảng , làm cho phiến lá bị rách nát . Ở mặt dưới phiến lá , nơi có vết bệnh , xuất hiện lớp bột màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm. Khi bị nấ m tấ n công, trong mỗ i đố m lá bị tổn thương có nhiều vết nứt , hoặ c cá c ổ bà o tử hạ (uredinia) màu nâu đỏ bên trong chứ a cá c bà o tử hạ (urediniospore) hình oval, màu sẫm, bề mặ t có nhiề u gai nhỏ (hình 1.1B và 1.2). Các thể bào tử sẽ được giải phóng từ các lỗ nhỏ hoặc vết nứt trên mặt lá. Bệnh gỉ sắt phát sinh ở các lá già gần mặt đất, sau lan lên các bộ phận khác ở phía trên của cây. Tác hại của bệnh gỉ sắt là làm cho lá cây đậu tương giảm hoặc mất khả năng quang hợp, gây rụng lá hàng loạt dẫn đến giảm năng suất quả, tỷ lệ hạt lép cao. Từ khi cây đậu tương có 5-6 lá và nhất là khi bắt đầu ra hoa, bệnh xâm nhiễm mạnh nhất và sau đó phát triển kéo dài tới khi thu hoạch. Nấm xâm nhiễm cả và o quả làm ch o hạt không thể phát triển bình thường. Do đó, năng suất và phẩm chất hạt đậu tương bị giảm sút nghiêm trọng. Những ruộng bị bệnh nặng hầu như không cho thu hoạch. Bệnh gỉ sắt thường tập trung cao điểm vào tháng 3 và tháng 4 khi nhiệt độ đạt từ 20 - 280 C và cây đậu có từ 3 lá kép đến khi thu hoạch quả. Đặc điểm này liên quan tới sự tích luỹ và biến động hàm lượng protein và amino acid trong các giai đoạn sinh trưởng ở các tuổi cây khác nhau [6].
  • 22. 12 Hình 1.2. Hình ảnh nấm P. pachyrhizi gây bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng chụp dƣới kính hiển vi điện tử [118] Vòng đời và quá trình nhiễm bệnh : Ở loài nấm P. Pachyrhizi có hai dạng bào tử là bào tử hạ (urediniospore) và bào tử đông (telliospore) [37]. Bào tử hạ là dạng phổ biến được phát hiện thấy ở các mùa vụ , chúng phát tán, lây lan trên đồ ng ruộ ng . Giai đoạ n bà o tử hạ có thể lặ p lạ i nhiề u lầ n tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh . Khi gặp điều kiện không thuận lợi hoặc vào cuối giai đoạn sinh trưởng của cây, trên vết bệnh có thể hình thành ổ bào tử đông màu đen. Bào tử đông đơn bào, hình oval hoặc hình cầu có núm, vỏ dày, kích thước 24-35µm x 20-29µm. Bào tử đông đóng vai trò là nguồn bệnh bảo tồn cho vụ sau . Quá trình nhiễm bệnh bắt đầu khi bào từ hạ nảy mầm để hình thành một ống mầm phát triển trên bề mặt lá (đườ ng kính 5-400 µm) cho đế n khi sợ i á p (appressorium) hình thành . Ổ bào tử hạ thườ ng phá t triể n từ 5-8 ngày, tố i đa lên đế n 4 tuầ n sau khi lây nhiễ m , quá trình sinh bào tử có thể kéo dài đến 3 tuầ n. Từ khi lây nhiễ m cho đế n khi hình thành bào tử có thể kéo dài đến 15 tuầ n. Thậ m chí dướ i điề u kiệ n khô hạn, quá trình này còn diễn ra dài hơn .
  • 23. 13 1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tƣơng Bản chất của hiện tượng kháng là sự tương tác giữa cây trồng và vật gây hại trong môi trường sống. Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo mô hình tương tác gen đố i gen [49]. Theo đó , để xuấ t hiệ n tính kháng bệnh ở cây cần có gen trội hoặc bán trội ở cây (dominant resistance gene) và cả gen không gây hại cũng mang tính trội (dominat avirulence gene) ở vật ký sinh. Tuy nhiên cho đế n nay , cơ chế khá ng bệ nh gỉ sắ t và sự tương tá c giữ a mầ m bệ nh và cây chủ vẫ n cầ n nhiề u nghiên cứ u để là m sá ng tỏ . Theo giả thiế t , sau khi bị nhiễm bệnh gỉ sắt , cây đậ u tương sẽ có các phản ứng tự vệ. Hiệ n tượ ng tự vệ có thể do hệ thống SAR (Systemic acquired resistance) vớ i sự tham gia củ a nhiề u nhó m protein liên quan đế n mầ m bệ nh (Pathogenesis-related protein - protein PR ) hoặ c protein khá ng (Resistant protein - protein R) đả m nhậ n [44]. Cụm gen R đã đượ c phá t hiệ n ở nhiề u loà i như lúa [105], Arabidopsis [34], [78], ngô [60], và đậu tương [51], [54], [66]. Cho đến nay, có nhiều nhóm protein PR với các chức năng khác nhau đã được phát hiện [73]. Các protein này thường xuất hiện trong mô tế bào sau khi lây nhiễm bệnh từ vài phút đến vài giờ, chúng đều là các chất kháng khuẩn, kháng nấm và tham gia vào bảo vệ tế bào thực vật khỏi các tác động của mầm bệnh [10], [44]. Khi có sự tương tác giữa nấm và tế bào thực vật, các protein Avr (avirulence protein) được hình thành từ sợi nấm và từ giác mút sẽ được chuyển vào nguyên sinh chất của tế bào thực vật bằng các con đường khác nhau [44],[64], [73]. Protein Avr có nhiề u loạ i và là các protein nhỏ có trong giác mút củ a sợ i nấ m được tiết vào tế bào thực vật cùng với các protein khác qua các màng giác mút . Protein R trong nguyên sinh chất củ a cây chủ nhận biết protein Avr và hoạt hóa hệ thống tín hiệu bảo vệ của tế bào thực vật [39]. Ở cây lanh (Linum usitatissimum) kháng nấm gây bệnh gỉ sắt, protein AvrL567 của nấm gây bệnh được nhận biết bằng các protein kháng của cây
  • 24. 14 chủ như protein L4, protein L6 và protein L7, hoặ c các protein AvrM, AvrP4 của nấm được nhận biết bằng các protein M và P4 của cây chủ [46]. Ngoài ra, từ sợi nấm, protein Avr cũng có thể xâm nhập vào nguyên sinh chất và tương tác với protein R theo cá c cá ch khá c nhau như hình 1.3. Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm (Trần Thị Phƣơng Liên (2010), “Protein và tính chống chịu ở thực vật”). Tại Trung tâm phát triển Rau màu Châu Á (AVRDC), việc xác định tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương là một mục tiêu quan trọng với hơn 9000 dòng đậu tương đã được sàng lọc. Cả tính kháng làm giảm tốc độ phát triển, tính kháng chuyên biệt và tính chống chịu đều xuất hiện trên mầm đậu tương [79]. Đặc tính kháng bệnh gỉ sắt của đậu tương là không ổn định và khá phứ c tạp [79]. Chúng có thể do một hoặc một số gen trội quyết định và được di truyền cho thế hệ sau theo các quy luật di truyền cơ bản hoặ c có thể là di truyề n theo qui luậ t tương tá c đa gen . Ví dụ , trong 3 cặp lai (UPSL 13 x Brogg, UPSL 85 x Harelec, UPSL - 3 x Clacrk 63), các giống làm mẹ là những giống kháng cả bệnh gỉ sắt và bệnh virus gây vàng lá, các giống làm bố là các giống năng suất cao và mẫn cảm với bệnh. Sự phân ly ở F2 cho kết quả
  • 25. 15 có một quần thể tuân theo tỷ lệ 3:1 (3 kháng: 1 nhiễm), hai quần thể khác không theo tỷ lệ lưỡng gen. Một số thí nghiệm khác lại chỉ ra rằng các cây lai ở F1 đều có khả năng kháng bệnh, còn các cây lai ở F 2 phân ly theo tỷ lệ 9 kháng: 7 nhiễm. Điều này chứng tỏ rằng có 2 gen trội tác động qua lại cùng quyết định tính kháng bệnh . Do đó , có thể nói, việ c xá c định tính khá ng củ a cây đậ u tương vớ i bệ nh gỉ sắ t là khá phứ c tạ p và cầ n thêm nhiề u công trình nghiên cứ u để là m sá ng tỏ . 1.2.2.1. Tính kháng bệnh gỉ sắt chuyên biệt ở đậu tương Đế n nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy có năm gen chính liên quan đế n tí nh khá ng bệ nh gỉ sắ t ở đậ u tương bao gồm: gen Rpp1 [56], [57] [76]; gen Rpp2 [59]; gen Rpp3 [37]; gen Rpp4 [56]; gen Rpp5 [52]. Các phản ứng kháng qua trung gian ở các locus Rpp2, Rpp3, Rpp4 và locus Rpp5 làm hạn chế sự sinh trưởng, phát triển của bào tử nấm thông qua sự hình thành các thể tổn thương màu nâu đỏ [36], [37], [52], [56]. Trong khi đó , phản ứng kháng của gen Rpp1 là hình thành các phản ứng miễn dịch ở cây chủ [36]. Các phản ứng kháng bệnh của gen Rpp2 đã đượ c nghiên cứ u rộ ng rãi bằng kỹ thuậ t microarray [107]. Theo đó mứ c độ biể u hiệ n củ a cá c gen tăng mạ nh trong vò ng 12 tiế ng sau khi gây nhiễ m ở cả thự c vậ t khá ng bệ nh và nhiễ m bệ nh. Sau đó mứ c độ biể u hiệ n trở lạ i trạ ng thá i bình thườ ng sau kh oảng 72 giờ . Các phản ứng này được phát hiện ở cả các giống nhiễm và giống kháng . Ở ba dòng đậu tương Tainung-4, PI459024, PI459025 và một dòng G. soja (PI 339871) được ghi nhận là có thêm các gen kháng chuyên biệt khác [58]. Tính kháng chuyên biệt cũng đã được xác nhận ở các loài Glycine spp. hoang dại và một vài trong số đó đã được dùng làm cây ký chủ để xác định các kiểu gây bệnh gỉ sắt. Việc xác định các giống kháng bệnh đã được tiến hành từ nhiều năm nay ở nhiều nước trên thế giới, tuy nhiên số giống kháng được phát hiện chưa nhiề u [52].
  • 26. 16 Nhiều nhà khoa học đã tìm cách phân lập các gen kháng bệnh để nghiên cứu tính chất sinh hóa và chức năng của những protein tương ứng [58], [79], [106]. Trên thực tế, việ c phá t hiệ n cá c gen khá ng bệ nh và cá c hệ thố ng bả o vệ là rấ t phứ c tạ p do có sự tham gia củ a nhiề u gen khá c nhau . Một số nghiên cứu sàng lọc giống đã được tiến hành để phát hiện các giống đậu tương có khả năng kháng/chống chịu với nấm gây bệnh P. pachyrhizi [58], [79]. Các nghiên cứu về gen cho thấy năm gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 và Rpp5 đã được phát hiện và mô tả là có khả năng liên quan đến tính kháng đối với một số chủng nấm P. pachyrhizi. Tuy nhiên chưa có một giố ng đậu tương nào có phổ kháng rộng với tất cả các chủng nấm P. pachyrhizi và hiện nay phần lớn các giống đậu trên thị trường được trồng ở Mỹ đều khá mẫn cảm với bệnh gỉ sắt [102]. 1.2.2.2. Tính kháng một phần bệnh gỉ sắt ở đậu tương Các dòng mang tính kháng một phần hoặc các dòng chậm bị bệnh gỉ sắt đã được xác định và mô tả dựa trên thời gian ủ bệnh và số lượng cụm bào tử hạ có trong phầ n thương tổn [58]. Đánh giá khả năng kháng bệnh bằng sự theo dõi, quan sát, liệt kê một số dòng mang tính kháng một phần được xác định dựa trên số lượng nốt. Trở ngại chính trong phát triển các dòng đậ u tương mang tính kháng là làm thế nà o để đánh giá được các dòng này từ các quần thể phân ly hoặc từ các dòng có tính trưởng thành khác nhau. Ngoài những khác biệt sinh lý khi cây trưởng thành, các điều kiện môi trường cũng có thể gây ả nh hưở ng khi cây trưởng thành trong các khoảng thời gian khác nhau. 1.2.2.3. Tính chống chịu bệnh gỉ sắt ở đậu tương Tính chống chịu ở đây được hiể u là khả năng cây cho năng suất tương đối dưới áp lực của bệnh gỉ sắt. Để so sánh năng suất người ta so sánh một giống được bảo vệ bằng thuốc trừ nấm. Mặc dù cần có thêm nhiều số liệu và thời điểm kiể tra, tính chống chịu cần được đánh giá vào mỗi mùa vụ.
  • 27. 17 Ở Đài Loan và Thái Lan, nhiều dòng đã được chọn và sàng lọc thử nghiệm tính chống chịu bệnh gỉ sắt [88]. Dựa trên phần trăm gia tăng năng suất khi so sánh giữa các dòng, người ta đã xác định được các dòng mang tính chống chịu cao hoặ c có thể kháng một phần. Thiệt hại năng suất của các dòng chống chịu này thường ít hơn so với các dòng có năng suất cao khác. Xu hướng tương tự cũng xảy ra ở những dòng bị giảm sút ở chỉ tiêu trọng lượng 100 hạt. Các dòng mang khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt có diện tích lá bị bệnh nhỏ nhất hoặ c có tính kháng một phần dựa trên số lượng vết bệnh trên mắt lá. Gần đây, cùng với mứ c độ phần trăm tăng năng suất thì chỉ tiêu chống chịu stress đã được áp dụng trong đánh giá tính chống chịu bệnh gỉ sắt bằng cách sử dụng các ô ba chiều để chia các nguyên liệu khảo nghiệm ra thành bốn nhóm. Mặt phẳng X-Y (X: tính độc bệnh, Y: năng suất phần trăm) được chia thành bốn đoạn bằng cách vẽ các đường phần cắt tại điểm chính giữa của trục X và trục Y. Trục Z thể hiện mức độ chống chịu stress mà một dòng có được ở bất kỳ nhóm nào trong bốn nhóm. 1.3. Các phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tƣơng Trong phân tích tính đa dạng di truyền của thực vật người ta có thể tiến hành thự c hiệ n ở các cấ p độ và phương phá p khác nhau , từ các đặc điểm hình thái , sinh lý và hoá sinh đến đặc điểm của phân tử DNA , protein. Phân tí ch đa dạ ng di truyề n ở đậ u tương dựa trên mộ t số phương phá p như chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh và chỉ thị phân tử DNA. 1.3.1. Phƣơng phá p sƣ̉ dụ ng chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện dưới dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ... Mặc dù chỉ thị hình thái được sử dụng như một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong
  • 28. 18 chọn giống gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hưởng của các nhân tố di truyền như sự tương tác giữa các sản phẩm của gen. Các nhân tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng có tác động qua lại giữa kiểu gen và kiểu hình, gây ảnh hưởng không nhỏ đến các giai đoạn phát triển của thực vật. Biể u hiệ n khả năng khá ng và nhiễ m bệ nh về mặ t hình thá i ở thự c vậ t đượ c xá c định theo cá c tiêu chí nhấ t định . Đây là chỉ thị quan trọng để tìm kiế m và tạ o giố ng khá ng bệ nh . Ví dụ như bệnh gỉ sắt đượ c xá c định trên cơ sở đá nh giá vế t bệ nh trên lá , mứ c độ tạ o quầ ng , mức độ tạ o bà o tử , từ đó có thể phân biệ t đượ c cá c giố ng đậ u tương khá ng tố t , kháng trung bình và mẫn cảm với bệ nh. Hơn nữa, một số tính trạng trội được tạo ra theo ý muốn của con người thông qua đột biến. Các tác nhân này gây ra một số hiện tượng như lùn, bạch tạng... có hại cho cơ thể của thực vật. Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của các chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hoá sinh học, những khó khăn trên đang từng bước được giải quyết. 1.3.2. Phƣơng phá p sƣ̉ dụ ng chỉ thị hoá sinh học Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình như isozyme và các protein dự trữ (stograge protein). Các isozyme có thể được phân tách theo trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang. Nhờ vậy, bằng kỹ thuật điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ như isozyme amylase, esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thông tin như là một loại chỉ thị đồng trội.
  • 29. 19 Hình 1.4. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE (Phan Văn Chi (2006), “Proteomic: Khoa học về hệ Protein”) Phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và đơn giản hơn phân tích DNA. Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen , số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển của cá thể . Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền. Hiện nay, các nghiên cứu về hệ gen (genomics) và hệ protein (proteomics) thực vật đang được quan tâm và ngày càng phát triển mạnh [40]. Kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lượng phân tử (chiều thứ hai ) (hình 1.4). Kỹ thuật này ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và cơ thể [53], [55]. Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là cách tiếp Chiều 1 IEF Thanh gel IPG Cân bằng mẫu Chiều2SDS-PAGE - + Mẫu protein
  • 30. 20 cận proteomics thường được sử dụng nhất [27], [35], [48], [50], [55]. Tùy thuộc vào kích thước gel và dải gradient pH sử dụng , điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein (lên đế n 5000 điểm protein), và có thể phát hiện vệt protein với lượng <1ng có mặt trong mẫu cùng một lúc , đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của chúng ở các mẫu phân tích để tìm cá c chỉ thị liên quan đến bệnh [84]. 1.3.3. Các phƣơng pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA Chỉ thị phân tử DNA trong thời gian đầu chủ yếu là RFLP , dự a trên cơ sở mẫ u dò đặ c hiệ u . Sau khi phá t minh ra PCR , ngườ i ta phá t triể n tiế p cá c chỉ thị dựa trên phương pháp này như RAPD , AFLP, SSR, SNP, ... Bên cạnh đó, QTL (Quantitative Trait Loci) - bản đồ locus các tính trạng số lượng xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một số tính trạng số lượng cũng đang được các nhà khoa học quan tâm. Các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử ở đậu tương sử dụng chỉ thị AFLP đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp. Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tương đã và đang được một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [62]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật nói chung và đậu tương nói riêng còn rất hạn chế, đặc biệt là trên đối tượng đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt. Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu giống đậu tương nhập nội và giống đậu tương địa phương đã được đánh giá về khả năng chịu nóng, chịu hạn, kháng sâu bệnh. Việc chọn tạo giống chủ yếu dựa trên những phương pháp thủ công truyền thống trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, nông sinh học mà chưa đi sâu vào chọn lọc dựa trên những đặc điểm di truyền phân tử. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương là rất cần thiết.
  • 31. 21 1.3.3.1. Chỉ thị RAPD Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyề n , kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bở i Welsh và cộ ng sự [112]. RAPD đã đượ c sử dụ ng rộ ng rã i để nghiên cứu sự đang dạ ng di truyề n củ a cù ng mộ t loà i hoặ c sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau [15], [25]. Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm 10 nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được phân tá ch bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen của cá c đố i tượ ng khá c nhau hoặ c củ a hai loà i sẽ cho sự khác nhau về những phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tương nghiên cứu. Về nguyên tắ c , kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cách sử dụng nhữ ng mồ i ngắn có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các mồ i . Mồ i (primer) là nhữ ng đoạn oligonucleotide ngắn , mộ t mạ ch (khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lượng G+C cao (từ 60-70%) và không có đầu tự bổ sung. Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA củ a hệ gen. Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việ c nghiên cứ u đa dạ ng và lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạ y PCR ; (iii) Kiể m tra sả n phẩ n nhân bả n trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụ ng ; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyền và thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của các đối tương nghiên cứu. Các sinh vật cùng loài có kiểu gen hoàn toàn giống nhau thì các đoạn DNA đượ c khuếch đại sẽ có kích thước giống nhau , khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD. Với các sinh vật khác loài, khi
  • 32. 22 sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD, các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau. Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên với số lượng lớn. Ứng dụng của chỉ thị RAPD Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biế n trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến mộ t tính trạng hoặ c thiế t lậ p bả n đồ di truyề n [43], [70], [96], [110]. Trong chương trình cải thiện giống, nhà chọn giống thường quan tâm đến những tính trạng mà nó biểu hiện bên ngoài (phynotype). Các tính trạng đó có thể là tính kháng sâu bệnh, tính chống chịu phèn , mặn hoặ c stress… Nhưng nếu việc phân tích di truyền chỉ dựa trên kiểu hình thường kết quả dễ bị sai lệch, do kiểu hình là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường. Chính vì thế, nhà chọn giống cần phải biết tính trạng đó liên kết với kiểu gen như thế nào và phương pháp RAPD sẽ trợ giúp phát hiện được điều này. Sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học của giống cây có múi ở huyện Gò Quao , tỉnh Kiên Giang , Nguyễn Hữu Hiệp và nhóm nghiên cứu đã sử dụng các mồi ngẫ u nhiên , kết quả có 49 dấu phân tử được ghi nhận. Từ đó vẽ được giản đồ phả hệ của các giống cây này [5]. Barakat và cộ ng sự ứ ng dụ ng kỹ thuậ t RAPD đã phân tích và nhậ n dạ ng đượ c cá c chỉ thị liên quan đế n tính khá ng bệ nh đố m trắng ở lá ngô [32]. Trong khi đó , Paulo (2004) đã sử dụ ng 32 mồ i để xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô Brazil, kết quả thu được 225 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có 184 phân đoạn DNA thể hiện tính đa hình (chiếm 72,2%) [91]. Năm 2003, Jorge và cộ ng sự đã đánh giá sự tương đồng di truyền giữa 7 giống chè ở Hy Lạp nhờ kỹ thuật RAPD. Sử dụ ng 25 mồi ngẫu nhiên cá c tá c giả đã nhân bả n được 282 phân đoạn DNA, trong đó có 195 phân đoạn thể hiện tính đa hình [65]. Ngoài ra, Dey và cộng sự (2005) nghiên cứu tính đa dạng di truyền của
  • 33. 23 38 dòng lúa thơm và 2 dòng đối chứng bằng kỹ thuật RAPD , kết quả khuếch đại được 44 phân đoạ n DNA và có 41 phân đoạ n thể hiện tính đa hình [43]. 1.3.3.2. Chỉ thị SSR Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giả n ) do Litt và Luty (1989) phát hiện lần đầu tiên trên đối tượng người [71]. Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng, ở người trình tự lặp lại đơn là TG với tần số lặp lại là 10-60 lần, chúng phân bố rải rác trong hệ gen tạo nên có khoảng 50.000 bản sao. Bằng kỹ thuật PCR, người ta đã phát hiện ra trình tự SSR ở gen tổng hợp actin của người và xác định được 12 alen trên 37 kiểu gen được nghiên cứu và nhận thấy các SSR này là những yếu tố trội di truyền theo quy luật của Mendel. SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đó. Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn [20]. Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật. Phương thức lặp lại được phân thành 3 loại chính: lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau). Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là các trình tự DNA bảo thủ SSR; (iv) Nhân vùng gen tương ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của sản phẩm PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR.
  • 34. 24 Phản ứng PCR - SSR với mồi được thiết kế dựa trên hệ gen của từng loài, nên chỉ thị SSR cho kết quả đa hình cao hơn là các chỉ thị phân tử khác. Kỹ thuật này chỉ đòi hỏi một lượng nhỏ DNA mẫu nhưng lại cho phép phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể trong cùng một giống. Phản ứng không mất nhiều thời gian. Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị phân tử khác và cho kết quả nhanh và đáng tin cậy hơn chỉ thị RAPD. Chỉ thị SSR vớ i các locus đặc tr ưng, đa alen và cung cấp nhiều thông tin nên chúng hết sức có ích trong việc thay đổi trình tự hiếm [67]. Đây chính là những ưu điểm chính của kỹ thuật SSR. Nói chung, chỉ thị SSR tương đối đơn giản hơn so với chỉ thị RFLP hay AFLP. Vì vậy, chỉ thị này được quan tâm hơn trong ứng dụng vào chọn giống thực vật [95]. Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ngoài ra, việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu đòi hỏi phải tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA bộ gen chứa SSR [74]. Vì vậy, số lượng các mồi chưa được phát triển ở nhiều loài thực vật. Ứng dụng của kỹ thuật SSR Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR được áp dụng để nghiên cứu đa dạng trên cả đối t ượng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và đáng tin cậy. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên một số loài cây như lạc, mơ, lúa mì [32], [75] và đang phát triển ở các giống cây trồng khác như đậ u tương [111]. Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liên quan đến một số tính trạng đã được xác định như chọn giống nhờ chỉ thị (marker-assisted selection). Các chỉ thị SSR đã được dùng để chọn dòng kháng bệnh khảm do virus ở cây đậu tương [29], chọn các dòng lúa có năng suất cao và hàm lượng protein dự trữ cao hoặ c để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống cây trồng ở một số đối tượng như lúa, mía, đậu tương, cà
  • 35. 25 chua hoặ c xây dựng bản đồ di truyền liên kết tính trạng ở cà chua và lúa và xác định giới tính thực vật trên đối tượng đu đủ. 1.3.3.3. Các chỉ thị RFLP và AFLP Các chỉ thị p hân tử như RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng đượ c sử dụ ng rộ ng rã i trong nghiên cứ u đa hình DNA. Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu. Kỹ thuật RFLP được tiến hành như sau: các endonuclease cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng loạt các phân đoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Số lượng các phân đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ gen. Sản phẩm của quá trình cắt sẽ được điện di, sau đó được chuyển nguyên vị và cố định trên màng lai. Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn sẽ được phát hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dò đã được đánh dấu (bằng phóng xạ hoặc bằng phương pháp hoá học) và các đoạn DNA của mẫu cần phân tích (được tạo ra từ cùng một locus theo nguyên tắc bổ sung). Trong khi đó , AFLP là một kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân các đoạn được cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn. Cũng như các chỉ thị phân tử khác, AFLP khám phá hiện tượng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn DNA được nhân. Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter), nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA được nhân lên. Chỉ thị AFLP ít phức tạp hơn RFLP, với ưu điểm là độ đa hình cao nhận dạng tới cá thể, thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [103].
  • 36. 26 1.3.3.4. Bản đồ QTL Bản đồ các locus kiể m soá t tính trạng số lượng QTL (Quantitative Trait Loci) xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng số lượng đang được quan tâm . Từ bản đồ QTL ta có thể xác định được những vùng trên NST có liên quan đến một tính trạng hay không . Các bước để lập bản đồ QTL như: (i) xác định cặp lai có tính trạng đối kháng nhau; (ii) lai và tạo quần thể cho lập bản đồ (300-600 cá thể); (iii) theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (iv) xử lý thống kê và lập bản đồ. Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí gen, hiệu quả và hoạt động của các locus liên quan trong mối tương tác giữa các sản phẩm của gen và tương tác QTL với môi trường , từ đó chọn lọc được các dòng với tính trạng mong muốn nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Selection). Năm 2002, các nghiên cứu lập bản đồ QTL liên kết với tính trạng qui định khố i lượ ng [61] hoặ c tính chịu hạn ở đậu xanh [103] đã đượ c mô tả . 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Trên thế giới , đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [32], [52], [77], [81]. Ở Đài Loan , bệnh gỉ sắt gây thiệt hại nghiêm trọng đế n cây đậu tương và làm hạ n chế năng suấ t đậu tương vụ xuân. Trung tâm Rau mà u Châu Á (AVRCD) của Đài Loan đã tiến hành so sánh 1080 giống, kết quả có 9 mẫu giống kháng bệnh trung bình, trong đó có 4 mẫu giống có nguồn gốc từ Trung Quốc, 3 giống có nguồn gốc từ Nhật Bản, 1 giống có nguồn gốc từ Triều Tiên. Giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các giống khác trong điều kiện đồng ruộng, số lượng vết bệnh ít hơn [6]. Ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ kế t hợ p Phòng thí nghiệm Nghiên cứu bệnh thực vật và AVRCD đã khởi động một dự án hợp tác nghiên cứu dịch tễ học của bệnh gỉ sắt đậu tương năm 1978. Dự án này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt được tiếp tục tiến hành cho đến năm1992. Ở Thái Lan, chương trình quốc gia của Thái Lan đã và
  • 37. 27 đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với các mụ c tiêu lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [88]. Ở Indonesia, phần lớn các giống đậu tương đều bị nhiễm bệnh cho nên bệnh gỉ sắt được xem là loại bệnh nghiêm trọng nhất trên cây đậu tương và đã lan rộng cả ở mùa mưa và mùa khô. Các hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải thiện tính kháng cây ký chủ, thử nghiệm thuốc trị nấm, quản lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các nghiên cứu về sự phát tán bào tử. Trong khi đó ở Úc, bệnh gỉ sắt đã được nghiên cứu sâu, tuy nhiên kinh phí bị giới hạn nên các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào việc sàng lọc các quần thể hồi giao bằng cách lai Glycine max và Glycine tomentella. Bằ ng kỹ thuậ t phân tử , những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền được tìm thấy ở đậu tương [45]. Verma và cộ ng sự (1996) đã công bố về những biến đổi alen của SSR ở mức độ cao trong sinh chất mầm đậu tương [109]. Theo ông, có 28 alen SSR được nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen đậu tương. Akkaya và cộng sự (1992) đã lập bản đồ 40 locus SSR ở đậu tương cùng với 118 chỉ thị RFLP và RAPD . Có 18 trong 29 nhóm liên kết chứa ít nhất một locus SSR được phân bố khá ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương [29]. Năm 1995, Maughan nghiên cứu trên 94 giống đậu tương đã xác định đ- ược 79 alen trên 5 locus [74]. Navel và cộng sự (2000) khi nghiên cứu 40 giống đậu tương trong tập đoàn đậu tương và 39 giống cao sản đã sử dụng 74 chỉ thị SSR và nhận được 379 alen trên 74 locus [85]. Ngoài ra, Abe và cộng sự (2003) đã phân tích 20 locus SSR của 131 giống đậu tương từ 14 nước Châu Á và nhận thấy rằng trung bình trên mỗi locus SSR có đến 11,2 alen [26]. Họ cũng đã nhận ra sự khác nhau về nguồn gốc di truyền giữa tập đoàn giống đậu tương ở Nhật Bản và Trung Quốc . Các phát hiện của của nhóm nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các giống đậ u tương của các nước Đông Nam Á và Trung Á phần lớn bắt nguồn từ Trung Quốc . Trong khi đó , Cregan và
  • 38. 28 cộng sự (1999) đã sử dụng đồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, AFLP và thiết lập được bản đồ gen với 20 nhóm gen liên kết ở đậu tương trên cơ sở ba quần thể lai của các trường đại học Iowa, Utah và Nebraska [42]. Để xá c định gen khá ng bệ nh gỉ sắ t trên cá c giố ng đậ u tương củ a Mỹ và Brazil, sử dụ ng phương phá p lậ p bả n đồ liên kế t chỉ thị phân tử (map-based cloning) các nhà khoa học đã phát hiện một số chỉ thị SSR liên kết gần với các gen từ Rpp1 đến Rpp5: Rpp1và Rpp4 thuộ c nhó m liên kế t G trên NST số 18; Rpp3 thuộ c nhó m liên kế t C2 trên NST số 6; Rpp3 thuộ c nhó m J trên NST số 16 và Rpp5 thuộ c nhó m N trên NST số 3 [52], [63], [77], [81], [82], [104]. Ở nước ta, kế t quả thí nghiệm củ a một số tác giả thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cho thấy các giống đậu tương trồng đều bị nhiễm bệnh với các mức độ khác nhau. Các giống ít bị nhiễm bệnh hay bị nhiễm muộn trên đồng ruộng hiện nay là M103, DT93, DT84, AK03, AK05, VX93, dòng 42. Các giống nhiễm bệnh nặng là V74 (DT74) và DH4. Trong nghiên cứ u về mố i quan hệ di truyề n củ a 19 giố ng đậ u tương Việ t Nam vớ i 25 cặ p mồ i bằ ng chỉ thị RAPD, tác giả Đinh Thị Phòng và cộng sự cho thấy có 17/25 mồ i có tính đa hình với giá trị PIC (Polymorphic Information Content -Hàm lượng thông tin đa hình) dao độ ng từ 0,11 đến 0,6, trong đó có 3 mồ i có tính đa hình cao (PIC>0,5). Ngoài ra, tác giả cũng cho rằng các giống có tính chống chịu vớ i điề u kiệ n bấ t lợ i củ a môi trườ ng như giố ng HL 92 (kháng bệnh xoăn lá và thố i quả ) và HL203 (chố ng chịu khá vớ i sâu bệ nh) đều nằm trong cùng nhóm phụ III và có hệ số sai khác di truyền 0,114. Hoặ c hai giố ng M 103 (chịu nóng) và giống DT84 (chịu lạnh và chịu úng ) đều nằm trong nhóm phụ II và có hệ số sai khác di truyền 0,082 [17]. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số thà nh tự u đáng kể : Trung tâm đậu đỗ Định Tường đã khảo sát 500 mẫu giống, trong đó giống G8587 có
  • 39. 29 sức kháng khá , các giống 7608-25-4, SJ4, SJ5, DT78, Pand, Provar có thể hiệ n mức độ kháng bệ nh . Phạm Văn Biên và cộng sự thuộc Viện kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam khi nghiên cứu về nguồn gen kháng gỉ sắt đã cho thấ y các giống Hoà An, MTD3, Prover, Cao quả địa hoa trắng, Đen Bắc Hà, Đen Cao Bằng, MTD4, Nhật 12, 13, 16, 17, 20 có tính kháng với bệnh gỉ sắt [1]. Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và cây thực phẩm đã nghiên cứu, lai tạo và kiểm định được một số giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt như: ĐT2000, CBU8325, DT95. Giống ĐT2000 được công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng cao đối với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống đậu tương đã có kết quả bước đầu khả quan [21], [22]. Như vậ y, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương nên chú ng có thể cung cấp nhữ ng dẫ n chứ ng chính xá c và tin cậ y trong nghiên cứu sinh học phân tử , di truyền học và lai tạo giống cây trồng. 1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tƣơng Nhằm phát triển tăng năng suấ t và chấ t lượ ng đậu tương một cách mạnh mẽ, hàng loạt các tổ chức , các mạng lưới nghiên cứu và cải tạo giống đậu tương trên thế giớ i đã đượ c thà nh lậ p như : Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế ở Hoa Kỳ (INTSOY - International Soybean Program), Viện Nông nghiệp nhiệt đới ở Nigeria (IMA - Institute of Tropical Agriculture), Trung tâm phát triển rau màu Châu Á (AVRDC - Asian Vegetable Research Devlopment Center) ở Đài Loan, Viện nghiên cứu lúa quốc tế ở Philippin (IRRI - International Rice Research Institute ). Trong đó , Trung tâm phát triển rau màu Châu Á là nơi nghiên cứu và đánh giá tập đoàn gen đậu tương sớm nhất thế giới . Trung tâm nà y đã thiết lập đượ c hệ thống đánh giá đậu tương và đã chọn lọc thành công 24 giống đậu tương có năng suất cao , có
  • 40. 30 khả năng chống bệnh gỉ sắt và thích ứng với điều kiện canh tá c và sinh thái ở nhiều quốc gia. Công tác nghiên cứu giống đậu tương trên thế giới hướng tới những mục đích: (i) Nhập nội giống sau đó chọn lọc, thử nghiệm với điều kiện của các vùng sinh thái; (ii) Khảo nghiệm các giống ở các vùng sinh thái khác nhau để tìm ra giố ng có khả năng thích ứng vớ i các vùng sinh thái đó ; (iii) Tạo tính trạng mới bằng lai hữu tính và dùng các tác nhân vật lý, hoá học nhằ m chọn lọc ra những dòng tốt nhất phục vụ cho sản xuất ; (iv) Xác định cá c địa bàn trồng đậu tương trên thế giới và các nước trồng đậu tương đạt năng suất và sản lượng cao. Với những mục đích trên, công tác này được tiến hành theo hai hướng chính: (1) Thu thập và nghiên cứ u nguồn gen đậu tương làm nguyên liệu cho lai tạo: Tại Trung Quố c và Hoa Kỳ , người ta đã thu thập được tập đoàn giống đậu tương lớn trên thế giới từ nhiều nước khác nhau như : Australia, Brazil, Đức, Nhật Bản , Ấn Độ , Thuỵ Điển, Nga… Tại Nhật Bản, từ năm 1960 một số giống đậu tương đã được lai tạo thành công, ví dụ như giống đậu tương Norin-59 có chất lượng hạt tốt, chống chịu được tuyến trùng, chống đổ, năng suất cao đã được lai tạo từ hai giống bố mẹ là Naugumitacodater và Tokokal. Ở Indonesia, các nhà nghiên cứu đã phân lập được một số giống có thời gian sinh trưởng ngắn từ 70-80 ngày như giống Kerinei, Rinani, MLg 254, B3334... Các giống này có thể trồng luân canh trên đất sau cây lúa trong điều kiện làm đất tối thiểu hoặc không làm đất vẫn đạt năng suất từ 1,5-1,7 tấn/ha. Ngoài ra , Rafalski và cá c tá c giả cũng đã chọn được các giống cứng cây , chống đổ tốt và chọn lọc thành công một số giống như Will đang được trồng phổ biến ở Indonesia [95]. (2) Thiết lập bản đồ gen đậu tương: Dự á n đậu tương lớn nhất tại Hoa Kỳ đã thố ng kê đượ c 72 bản đồ gen phân tử (molecular genetic maps) và bản đồ gen cổ điển (genetic classical maps) [117]. Các bản đồ gen này định vị
  • 41. 31 được 44.326 locus, 481 gen và nhiều QTL , một phần trong số đó đã được xác định liên kết với các tính trạng khác nhau. Các QTL có thể chia thành 4 nhóm chính liên quan đến chất lượng hạt và năng suất, bệnh và stress, cấu trúc thực vật... Kết quả giải trình tự gen đậu tương phát hiện thấy 210.991 chỉ thị SSR, tuy nhiên chỉ mới có 33.065 chỉ thị được nghiên cứu xác định trình tự mồ i để sử dụng . Nghiên cứu 19.000 mẫu giống đậu tương trong tập đoàn giống đã phát hiện thấy trên 60.000 SNP, nhưng chỉ có khoảng 1500 chỉ thị SNP đang được sử dụng trong các nghiên cứu. Dự án này còn thống kê được 94 loại mầm bệnh và 101 loại bệnh ở đậu tương [117]. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ gen trên cây đậu tương, việc tạo giống nhờ chuyển gen mong muốn như kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ...đã có một số thành tựu. Tuy nhiên, nguyên liệu đậu tương ban đầu vẫn phải chọn tạo từ thành quả nghiên cứu của tập đoàn giống có ưu thế. Vì vậy, việc nghiên cứu và đánh giá tính đa dạng di truyền với các mục đích chọn tạo nhất định vẫn luôn được quan tâm và coi trọng nhất. Việt Nam là quốc gia có nền sản xuất nông nghiệp lâu đời , cho nên cây đậu tương đã được trồng từ rất sớm . Hiện nay, ở nướ c ta cây đậu tương có vị trí rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, có nền kinh tế chưa phát triển. Ngoài việc cung cấp nguyên liệu chế biến làm thực phẩm cho con người , nguyên liệu cho xuất khẩu, cây đậu tương còn là nguồn cung cấp thức ăn cho chăn nuôi . Do đó , đậu tương cần được nghiên cứ u phá t triể n mạnh để tăng nguồn đạm cho con người, gia súc và trở thành mặ t hàng xuất khẩu chủ lực trong tương lai [3]. Cùng với xu hướng phát triển của thế giới, công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam cũng thu được kết quả tốt. Các giống được tạo ra phù hợp với nhu cầu tiêu dùng của nhân dân và điều kiện sinh trưởng từng vùng. Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã thu thập được trên 500 giống đậu tương, trong đó có cá c giống địa phương có khả năng chố ng chịu
  • 42. 32 nóng, chịu hạn và sâu bệ nh khá c nhau . Các giống nhập nội có hạt to, năng suất cao, chất lượng tốt thích ứng với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu của nước ta. Ngược lại, giống địa phương có năng suất thấp , chất lượng hạt trung bình nhưng có khả năng chịu nóng, chịu hạn. Các giống được tạo ra cũng phù hợp với mùa vụ gieo trồng từng vùng. Vùng miền núi và trung du bắc bộ, bộ giống thích hợp được nghiên cứu chọn tạo từ nhiều năm nay bao gồm: các giống vụ hè để trồng xen vụ (M103, Cúc Vàng,...) và các giống vụ đông như (VX93, V74...) [7]. Xét trong phạm vi toàn quốc, thì thời điểm nào trong năm chúng ta cũng có đậu tương thu hoạch. Đây là một ưu thế để tổ chức xây dựng công nghiệp chế biến sản phẩm đậu tương phát triển một cách cân đối. Có nhiều phương pháp chọn, tạo giống khác nhau: tuyển chọn giống thông qua tập đoàn nhập nội, lai hữu tính hoặc gây đột biến. Hiện tại, bộ giống đậu tương đưa ra sản xuất đại trà ở nước ta là rất phong phú, song giống đột phá về năng suất thì chưa có nhiều. Năm 2010, nước ta tăng diện tích trồ ng đậu tương toàn quốc lên khoảng 500.000-600.000ha, năng suất đạt trung bình 20-22 tạ/ha, sản lượng đạt 1,0-1,5 triệu tấn. Công tá c chọ n tạ o giố ng kế t hợ p vớ i cá c biệ n phá p kỹ thuậ t thâm canh tiên tiế n ở cá c địa phương nhấ t là trung du và miề n nú i đang ngà y cà ng đượ c quan tâm. Tuy nhiên, qua kiểm nghiệm thực tế cho thấy đậu tương là cây trồng bị nhiều sâu bệnh phá hoại. Cụ thể, có trên 70 loại sâu hại và 17 loại bệnh, trong đó có 12 - 14 loại sâu và từ 4 - 5 loại bệnh phổ biến nhất. Do đó, việc nghiên cứu phát triển các chỉ thị phân tử phục vụ cho chọn giống đậu tương là rất cần thiết.
  • 43. 33 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Vật liệu và phƣơng pháp thu thập lá bệnh Đề tà i đã s ử dụng 50 giống đậu tương , trong đó có 41 giố ng có nguồn gốc từ các địa phương Việt Nam do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ và Viện Di truyền Nông nghiệp thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Trường Đại học Cần Thơ cung cấp . Một số giống được thu thập từ các địa phương Cao Bằng, Hà Giang và Thái Nguyên, do các Trạm Khuyến nông cung cấp. Trong 9 giố ng nhậ p nộ i, có 4 giố ng khá ng bệ nh điể n hì nh dù ng là m đố i chứ ng do Việ n Bả o vệ Thự c vậ t cung cấ p . Ký hiệu và nguồn gốc các giống được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Danh sá ch cá c giố ng đậ u tƣơng nghiên cƣ́ u STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 1. PI200492 (Rpp1) PI200492 Nhậ t Bả n Kháng gỉ sắt 2. PI 230970 (Rpp2) PI230970 Nhậ t Bả n Chống bọ phấn, kháng gỉ sắt 3. PI 462312 (Rpp3) PI462312 Ấn Độ Kháng gỉ sắt 4. PI 459025 (Rpp4) PI459025 Trung Quố c Kháng gỉ sắt 5. ĐT2000 ĐT2000 Từ tập đoàn nhập nội của AVRDC, Đà i Loan Kháng gỉ sắt ở mức độ tốt 6. Cao Bằng U8325 CBU8325 Cao Bằng Kháng gỉ sắt, không chống chịu được bọ phấn 7. DT95 DT95 Giống đột biến từ AK04 Chống chịu được bệnh sương mai, gỉ sắt, vi khuẩn, đốm nâu. Chống đổ trung bình yếu.
  • 44. 34 STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 8. MTD65 MTD65 Miền tây Chịu nóng, chống chịu được vi khuẩn 9. Cúc nhật bóng Võ Nhai CNB Võ nhai, Thái Nguyên Có khả năng chịu lạnh, chịu nóng tốt, kháng sâu bệnh 10. Pa múng Trung Quốc PMTQ Nhập nội, trồng tại Hà Giang Chống chịu được bệnh phấn trắng, chống đổ, chịu lạnh, nóng tốt. 11. Hoàng Su Phì 2 HSP2 Hoàng Su Phì, Hà Giang Chịu lạnh, nóng tốt, chống chịu được bệnh phấn trắng 12. Hoàng Su Phì 1 HSP1 Hoàng Su Phì, Hà Giang Chịu lạnh, nóng tốt, chống chịu được bệnh phấn trắng 13. Zưmga Đắc Lắc ZG Đắc Lắc Chịu hạn tốt. 14. M103 M103 Giống quốc gia, chọn tạo từ phương pháp đột biến Có khả năng chịu nóng tốt 15. DT96 DT96 Con lai của DT84 Và DT90 Chống chịu được bệnh sương mai, gỉ sắt, vi khuẩn, đốm nâu. Chống đổ khá, chịu hạn khá, chịu lạnh, nóng tốt 16. Phúc Hòa Cao Bằng PHCB Phúc Hòa, Cao Bằng Chịu lạnh, nóng tốt, kháng gỉ sắt trung bình 17. Phúc Sen Cao Băng PS Phúc Sen Cao Bằng Chịu lạnh, nóng tốt, kháng trung bình 18. Phú Tâm PT Sóc Trăng Kháng gỉ sắt trung bình i 19. Nành sẻ ya Kon tum NS Kon Tum Kháng gỉ sắt trung bình, chịu nóng tốt
  • 45. 35 STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 20. Miên trạng 1 MT1 Miề n Tây, Nam Bộ Kháng gỉ sắt trung bình, chịu hạn, nóng tốt 21. Hậu Giang 2 HG2 Hậu Giang Kháng gỉ sắt trung bình 22. Việt Khái 2 VK2 Cà Mau Nhiễm gỉ sắt nhẹ 23. Cần Thơ 2 CT2 Cần Thơ Nhiễm gỉ sắt 24. Việt Khái 3 VK3 Cà Mau Nhiễm gỉ sắt 25. Cần Thơ 1 CT1 Cần Thơ Nhiễm gỉ săt 26. ĐT12 ĐT12 Từ tập đoàn nhập nội giống của Trung Quốc Có khả năng chống đổ tốt vì thân to, cây trung bình. 27. VX92 VX92 Từ tập đoàn nhập nội của Viện Nghiên cứu cây trồng Liên Bang Nga (VIR) Có khả năng chịu rét 28. VX93 VX93 Từ dòng K7002 (Viện cây trồng toàn liên bang Nga- VIR) có nguồn gốc từ Phillipin, giống quốc gia Chịu rét tốt 29. DT84 DT84 Từ Viện Di truyền nông nghiệp chọn tạo Chống đổ tốt, nhiễm nhẹ với sâu bệnh 30. V79 V79 Miền Nam Mẫn cảm với gỉ sắt 31. Cao Vàng CV Giống địa phương, có nguồn gốc từ Lục Ngạn, Bắc Giang Có khả năng chịu hạn tốt 32. Sơn La SL Giống địa phương Sơn La Mẫn cảm với gỉ sắt 33. Vàng Mường Khương VMK Giống địa phương của Lào Cai Khả năng chịu bệnh khá: sường mai, gỉ sắt, đốm nâu, vi khuẩn… Chống đổ yếu
  • 46. 36 STT Tên giố ng Ký hiệu Nguồn gốc Lý lịch giống về khả năng chống chịu 34. Hà Giang HG Hà Giang Chịu hạn tốt, nhiễm gỉ sắt nhẹ 35. Cao Bằng đen CBD Cao Bằng Nhiễm nhẹ gỉ sắt 36. Cao Bằng 7 CB7 Cao Bằng Nhiễm gỉ sắt 37. Quảng Hòa Cao Bằng QHCB Quảng Hòa, Cao Bằng Nhiễm gỉ sắt 38. Lơ Vạn Giã LVG Miền Nam Nhiễm gỉ sắt 39. Thường Tín Hà Tây TTHT Hà Tây Nhiễm gỉ sắt 40. Da bò bông tím DBBT Miền Tây, Nam Bộ Nhiễm gỉ sắt 41. Da trâu Bong trắng DTBT Miền Tây, Nam Bộ Nhiễm gỉ sắt 42. Miên trạng 2 MT2 Miền Tây, Nam Bộ Nhiễm gỉ sắt 43. Hậu Giang 1 HG1 Hậu Giang Nhiễm gỉ sắt 44. Hạt to liên nghĩa Đức Trọng HTDT Lâm Đồng Nhiễm gỉ sắt 45. Mandrak Đắclăk MD Đắc Lắc Nhiễm gỉ sắt 46. Duy Linh Lâm Đồng DL Lâm Đồng Nhiễm gỉ sắt 47. Minh Hải MH Minh Hải Nhiễm gỉ sắt 48. Ninh Dương Minh Hòa Khánh Hòa ND Khánh Hòa Nhiễm gỉ sắt 49. Chư sê Gia Lai CSGL Gia Lai Nhiễm gỉ sắt 50. Hồng Ngự HN Đồng Tháp Nhiễm gỉ sắt Nguồn bệnh gỉ sắt: nguồn bệnh để lây nhiễm là bào tử của lá nhiễm bệnh được thu thập ngoài đồng ruộng và nguồn nhiễm bệnh được chuẩn bị sẵn trong nhà lưới. Nguyên tắc thu thập lá bệnh: chọn lá còn xanh, bị bệnh trên 50% diện tích lá, vết bệnh nổi gờ cao, có ít bào tử; rửa lá sạch nhưng nhẹ
  • 47. 37 nhàng và hong cho đến khi ráo nước nhưng mặt lá vẫn còn ẩm; cho lá vào trong túi ni-lông hoặc giấy chống ẩm, đặt vào chỗ tối với khoảng thời gian 12 giờ ở nhiệt độ tối thích là 20 - 250 C để kích thích quá trình sinh bào tử. 2.1.2. Hóa chất Tris, EDTA (Ethylendiamine tetra acetic acid), glycine, CTAB (Cetylmethylammonium bromide), Taq DNA polymerase (hãng Bio - Lad),  - mecaptoethanol, phenol, chloroform: isoamyl alcohol (24:1), Natriacetate, ethanol (70%, 100%), RNase, dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), agarose, ethidium bromide (EtBr), AgNO3, các hóa chất điện di SDS-PAGE, điện di 2- DE như: Acrylamide, bis acrylamide, APS, TEMED, Urea, CHAPS, DTT, IAA, Bio-Lyte 3/10 ampholyte, thanh cố định gradient pH 3-10; thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x được mua từ hãng Bio -Rad (Hercules, CA, Mỹ) và các hoá chất thông dụ ng khác được mua của các hã ng Merck, Invitrogen, Amersham Pharmacia Biotech, New England Biolabs. 2.1.3. Máy móc và thiết bị - Máy quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia). - Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ). - Máy phân tích amino acid tự động - HPLC amino Quan SeriesII (Hewlett Parkard, Hoa Kỳ). - Máy PCR PTC - 100TM (MJ Research, Hoa Kỳ). - Máy soi DNA (Mini - transllumminator. Bio-Rad, Hoa Kỳ). - Máy li tâm lạnh Hettich (Đức). - Máy li tâm Avanti TM30 (Backman, Hoa Kỳ). - Máy ly tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, Đức). - Máy khuấy trộn (Voltex) (Minishaker, IKA, Đức). - Máy hút chân không SpeedVac 110A (Savant, Hoa Kỳ).