Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú, cho các bạn làm luận văn tham khảo

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--
Nguyễn Hồng Nhung
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG
BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN
UNG THƯ VÚ
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội-2015

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--
Nguyễn Hồng Nhung
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG
BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN
UNG THƯ VÚ
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trịnh Hồng Thái
TS. Đỗ Minh Hà
Hà Nội-2015

3. LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối
với thầy, PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt
quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Thầy đã mở ra cho em những vấn đề
khoa học rất lý thú, hướng em vào nghiên cứu các lĩnh vực hết sức thiết thực và vô
cùng bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu. Em đã
học hỏi được rất nhiều ở Thầy phong cách làm việc, cũng như phương pháp nghiên
cứu khoa học.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn đến TS. Đỗ Minh Hà và thầy giáo, cô giáo
trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô
giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình giảng dạy dìu dắt
tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị đã tận tình giúp đỡ và chỉ
bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại Phòng Proteomics và
Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và
Protein, các bạn học viên cao học và các em sinh viên làm việc tại phòng, những
người đã làm cùng tôi, luôn ở bên tôi lúc thất bại hay những lúc thành công.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi của PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học KHTN,
sự giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, bệnh
viện K, Hà Nội trong việc cung cấp mẫu nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Luận văn được thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí củađề tài cấp
nhà nước (mã số KC.04.10/11-15). Tôi xin chân thành cảm ơn.
Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ người đã vất vả nuôi con khôn
lớn và dạy con những bài học làm người đầu tiên, con cảm ơn ông bà, cô
chú…những người thân của con, những người luôn dành tình cảm và những lời
động viên con.
Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè của tôi, những người luôn ủng hộ và
giúp đỡ tôi.
Hà Nội, tháng 8 năm 2015
Học viên
Nguyễn Hồng Nhung

4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid Deoxyribonucleic
APS Ammonium persulfate
ARN Acid Ribonucleic
ATP Adenosine Triphosphate
AcN Acetonitrile
Bp Base pair (cặp bazơ)
cs cộng sự
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
EtBr Ethidium Bromide
HCC Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma)
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid
chromatography)
MT/mt Mitochondria (ti thể)
mtADN ADN ti thể (mitochondrial DNA)
nADN ADN nhân (nuclear DNA)
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction)
Smac/DIABLO Chất hoạt hóa caspase thứ hai từ ti thể/ chất ức chế trực tiếp của
protein gắn trong quá trình apoptosis trong điều kiện pI thấp.
(Second mitochondria-derived activator of caspase/direct
inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)
TEA Triethylamine
TEAA Triethylammonium acetate
tARN ARN vận chuyển (transfer RNA)
rARN ARN ribosome (RNA ribosome)

5. DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1 Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu
Bảng 2 Thành phần hóa chất chạy HPLC
Bảng 3 Thành phần phản ứng PCR
Bảng 4 Thành phần phản ứng PCR thể tích 15 µl
Bảng 5 Công thức đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm
Bảng 6
Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lượng ADN chuẩn
400bp/100bp khác nhau
Bảng 7
Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số lượng mt/ACTB khác
nhau
Bảng 8
Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú
và bệnh nhân u xơ vú
Bảng 9
Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư
vú
Bảng 10
Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú
và bệnh nhân u xơ vú bằng phương pháp ImageJ
Bảng 11
Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư
vú phân tích bằng phương pháp ImageJ

6. DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1 Phân bố gen trên ADN ti thể
Hình 2 Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Hình 3 Chương trình chạy HPLC
Hình 4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB
Hình 5
Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô vú của bệnh nhân
ung thư vú (điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium
bromide)
Hình 6
Kết quả phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và
200_400bp
Hình 7
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn mt và ACTB trên gel
agarose 1,7%
Hình 8
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi ở các chu kì khác nhau
trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc
Hình 9
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở 28 chu kì của
các mẫu khác nhau
Hình 10
Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào tế bào
E.coli DH5α.
Hình 11 Hình ảnh điện di sau khi tách plasmid
Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB
Hình 13 Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt
Hình 14 Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB
Hình 15
Hình ảnh phân tích HPLC và Biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm
lượng ADN chuẩn 400bp/100bp
Hình 16 Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đường chuẩn tỉ số mt/ACTB.
Hình 17 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB ở các loại mẫu
Hình 18
Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo nhóm tuổi ở bệnh nhân ung
thư vú.
Hình 19 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo kích thước khối u ở bệnh

7. nhân ung thư vú
Hình 20 Hình ảnh bản gel khi phân tích bằng phầm mềm ImageJ
Hình 21
Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo loại mẫu phân tích bằng
phương pháp ImageJ

8. MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 - TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ TI THỂ 3
1.1.1. Cấu trúc và chức năng của ti thể 3
1.1.2. Những biến đổi ti thể và bệnh ung thư 6
1.2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 11
1.2.1. Phân loại ung thư vú 11
1.2.2. Các giai đoạn của ung thư vú 12
1.2.3 Các yếu tố nguy cơ 14
1.3. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ 15
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ 16
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19
2.1.2. Hóa chất 19
2.1.3. Dụng cụ 20
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 21
2.2.2. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích
định lượng: 22
2.2.3. Định lượng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ 26
2.2.4. Tính toán thống kê 28
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ 29
3.2. THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 30

9. 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO ADN TI THỂ 35
KẾT LUẬN 51
KIẾN NGHỊ 52
PHỤ LỤC 58

10. 1
MỞ ĐẦU
Ti thể là bào quan quan trọng trong tế bào nhân chuẩn có vai trò chính tạo ra
năng lượng thông qua hô hấp hiếu khí, là nơi hình thành và đích đến của các gốc
oxy tự do (ROS) tác nhân gây ung thư. Mỗi tế bào có nhiều bản sao của ti thể, có
thể tới hàng trăm bản sao, tuy nhiên số lượng ADN ti thể (mtADN) tương đối ổn
định trong các tế bào trong điều kiện sinh lý. Những thay đổi trong mtADN về cấu
trúc, hay số lượng bản sao mtADN có thể đóng vai trò trực tiếp là tác nhân gây ung
thư. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự thay đổi số lượng bản sao mtADN có liên
quan đến hình thành và tiến triển của nhiều loại ung thư như ung thư hạch bạch
huyết (Non-Hodgkin lymphoma), ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư thận, ung
thư tuyến tụy, ung thư đại trực tràng và ung thư vú,...
Ung thư vú là bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới, hiện nay
tỷ lệ mắc ung thư vú cũng tăng lên nhanh chóng, đặc biệt ở các nước Châu Á như
Việt Nam. Mặc dù đã có nhiều phương pháp chẩn đoán, tầm soát ung thư giúp phát
hiện sớm như chụp nhũ ảnh và nhiều phương pháp điều trị hiện đại đã giúp giảm
đáng kể tỉ lệ mắc bệnh và tử vong do ung thư vú, tuy nhiên, ung thư vú vẫn là loại
ung thư gây tử vong hàng đầu ở nữ giới.
Phương pháp HPLC là phương pháp định lượng cơ bản kinh điển trong phân
tích hóa sinh học. Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi,
cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ. Với sự pháp triển của khoa học hiện đại,
nhiều phần mềm đã được ra đời phục vụ mục đích bán định lượng dựa trên phân
tích hình ảnh các băng điện di như phần mềm ImageJ – NIH US, đây là phương
pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có thể áp dụng rộng rãi.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp HPLC và phân tích hình ảnh
bằng phần mềm ImageJ để thực hiện đề tài “Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao
ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú”
Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Kinh phí thực hiện từ đề tài cấp nhà

11. 2
nước, mã số KC.04.10/11-15 “Nghiên cứu phát hiện các bệnh đột biến gen ti thể ở
người Việt Nam bằng các kỹ thuật sinh học phân tử”.

12. 3
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ TI THỂ
Ti thể là bào quan chuyển hóa năng lượng của tế bào nhân chuẩn, trong đó
năng lượng từ thức ăn được bộ máy chuyển hóa của cơ thể và tế bào chuyển đổi
thành ATP thông qua nhiều quá trình phức tạp mà mắt xích cuối là quá trình
phosphoryl oxi hóa diễn ra ở trong ti thể. Ti thể có lớp màng kép, màng ngoài phân
tách các ti thể với bào tương. Màng bên trong được gấp cuộn để tạo thành các nếp
gấp hướng vào tâm, bên trong có chứa chất nền. Phức hệ 5 enzyme của hệ thống
phosphoryl oxi hóa được gắn vào trong màng trong ti thể. Ti thể chứa bộ gen của
riêng mình, được gọi là ADN ti thể (mtADN) và phân chia độc lập với ADN nhân.
Trong tế bào động vật có vú, mỗi tế bào thường chứa nhiều bản sao giống hệt nhau
của mtADN [7].
Ti thể được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn hiếu khí bị cộng sinh vào tế bào
nhân chuẩn (thuyết nội cộng sinh). Trong quá trình tiến hóa để trở thành nhà máy
năng lượng của tế bào nhân chuẩn, các vi khuẩn cộng sinh đã chuyển nhiều gen thiết
yếu của mình vào các nhiễm sắc thể nhân. Tuy nhiên, ti thể vẫn mang các dấu ấn của
các vi khuẩn tổ tiên. Ví dụ, ti thể sử dụng N-formylmethionyl-tARN (fMet-tARN) để
kích hoạt quá trình tổng hợp protein [28].
1.1.1. Cấu trúc và chức năng của ti thể
1.1.1.1. Cấu trúc của ti thể
ADN ti thể người là phân tử vòng sợi kép có kích thước 16.569 bp. Các chuỗi
của ADN mạch kép dựa trên thành phần nucleotide khác nhau được chia thành chuỗi
nặng chứa nhiều Guannine và chuỗi nhẹ chứa nhiều Cytosine. Hầu hết các thông tin
được mã hóa trên chuỗi nặng, với gen mã hóa cho 2 rARN, 14 tARN và 12 chuỗi
polypeptide. Chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tARN và một chuỗi polypeptide (Hình 1). Tất
cả 13 protein sản phẩm là thành phần của phức hợp enzyme trong hệ thống
phosphoryl oxy hóa: 7 chuỗi polypeptide, từ ND1 đến ND6 và ND4L là các tiểu đơn
vị của phức hợp I (NADH dehydrogenase- ubiquinone reductase); 1 chuỗi
cytochrome b là tiểu đơn vị của phức hợp III (ubiquinol-cytochrome c reductase); 3

13. 4
chuỗi: CO I, CO II và CO III là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp IV (cytochrome c
oxidase); ATPase 6 và 8 là tiểu đơn vị của phức hợp V (ATP synthetase) [2].
Hình 1- Phân bố gen trên ADN ti thể
mtADN được sắp xếp rất tiết kiệm, các gen không có intron, các trình tự mã
hóa tiếp giáp với nhau hoặc cách nhau bởi một vài nucleotide. Các phân tử rRNA và
tARN đều rất nhỏ. Một số gen mã hóa cho protein còn nằm gối lên nhau (ở người,
ATPase 6 và 8 gối nhau 46 nucleotide, ND4 và tiểu đơn vị ND4L gối nhau 7
nucleotide), trong một số trường hợp một phần của bộ ba kết thúc không mã hóa
trong mtADN mà được tạo ra sau phiên mã bởi quá trình thêm đuôi poly A của
mARN tương ứng. Ngoài ra còn có thay đổi trong việc sử dụng các bộ ba so với
ARN nhân. Ví dụ, UGA mã hóa cho tryptophan chứ không phải bộ ba kết thúc,
AUA, AUC và AUU được sử dụng như bộ 3 mở đầu, AGA và AGG không mã hóa
cho arginine mà là bộ 3 kết thúc [20].

14. 5
1.1.1.2. Chức năng chính của ti thể
Năng lượng và quá trình trao đổi chất
Chức năng quan trọng nhất và đặc trưng nhất của ti thể là sản xuất adenosine
triphosphate (ATP) thông qua quá trình phosphoryl oxy hóa, được thực hiện bởi một
loạt các phức hợp protein, được gọi chung là chuỗi hô hấp, được mã hóa bởi cả
nADN và mtADN. Chuỗi hô hấp hoàn chỉnh chứa ít nhất 87 polypeptide, 13 trong số
đó là mã hóa bởi mtADN. Do đó, phần lớn các tiểu phần của chuỗi hô hấp mã hóa
trong nhân và được đưa vào ti thể sau khi được dịch mã trong nhân và đưa ra bào
tương. Phosphoryl oxy hóa là một quá trình sinh hóa độc đáo được tạo ra từ sự phối
hợp chặt chẽ của các protein sản phẩm từ hai bộ gen riêng biệt (nhân và ti thể). Tuy
nhiên, quá trình này không phải là cách duy nhất để tạo ra năng lượng cho tế bào.
Đường phân cũng có thể tạo ra ATP và cung cấp cơ chế thay thế khi quá trình
phosphoryl oxy hóa trở nên kém hiệu quả do chuỗi hô hấp có khiếm khuyết. Khi các
electron được vận chuyển thông qua chuỗi hô hấp trong quá trình hô hấp của ti thể,
một số electron có thể trốn khỏi hoặc rò rỉ từ các phức hợp vận chuyển electron và
phản ứng với oxy phân tử hình thành các gốc superoxide (O*2
-
). Dòng chảy electron
này xảy ra chủ yếu tại khu phức hợp I và III [27]. Do vậy một đột biến mtADN nhất
định có thể gây ra sự thay đổi các thành phần vận chuyển điện tử và tạo ra các gốc
superoxide, sau đó chuyển đổi thành các dạng gốc oxy hóa tự do (ROS). Các đột biến
mtADN và sự gia tăng quá trình oxy hóa đã được quan sát thấy trong các loại tế bào
ung thư khác nhau ở nhiều nghiên cứu độc lập [9]. Tuy nhiên, liên hệ trực tiếp giữa
đột biến mtADN và sự gia tăng hình thành ROS trong các tế bào ung thư vẫn chưa
được chứng minh bằng thực nghiệm.
Ti thể đóng vai trò điều tiết các cơ chế trung gian quan trọng trong quá trình
chuyển hóa carbohydrate, axid amin và axid béo. Chu trình acid tricarboxylic trong
chất nền của ti thể là một ví dụ điển hình của một con đường sinh hóa đòi hỏi nhiều
cơ chế trung gian quan trọng [13]. Một phần chính của chu trình urê cũng xảy ra
trong ti thể, nơi xảy ra quá trình xử lý các axid amin trung gian có chứa nitơ. Axit béo
được chia nhỏ thành các đơn vị hai carbon bởi một loạt các β-oxy hóa và tiếp tục xử
lý để acetyl CoA trong chất nền của ti thể. Như vậy, chức năng chính của ti thể là tạo

15. 6
ATP qua quá trình phosphoryl oxy hóa không phải là thiết yếu, ti thể lại không thể
thiếu để các tế bào nhân chuẩn tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng
khác, điều này giải thích tại sao trong một số tế bào có mất đoạn mtADN, lượng ti thể
vẫn được duy trì mà không có các đoạn mtADN mã hóa các protein trong chuỗi hô
hấp [12].
Apoptosis và sự tồn tại của tế bào
Ti thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis, một quá trình
sinh học cơ bản của các tế bào chết theo chương trình có kiểm soát. Một số nDNA
mã hóa protein tham gia quá trình apoptosis bao gồm cytochrome c, yếu tố cảm ứng
apoptosis (AIF), endonuclease G, và Smac/DIABLO được dự trữ trong ti thể. Khi
những yếu tố protein này được giải phóng khỏi ti thể, chúng sẽ tạo ra một loạt phản
ứng các sinh hóa để kích hoạt những tín hiệu của thác apoptois. Đặc điểm nổi bật
của sự khơi mào apoptosis là sự hoạt hóa caspase (một họ protease) bởi cytochrome
c và apaf-1 với sự có mặt của ATP hoặc dATP [17]. Quá trình chuyển AIF từ ti thể
tới nhân để gây apoptosis độc lập với caspase [26]. Quá trình apoptosis đóng vai trò
quan trọng trong việc phát triển bệnh ung thư và đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân
chống ung thư. Tuy nhiên, vai trò chính xác của đột biến mtDNA trong phản ứng
chết theo chương trình của tế bào để đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân chống ung
thư vẫn chưa được xác định.
1.1.2. Những biến đổi ti thể và bệnh ung thư
Khiếm khuyết chức năng ti thể từ lâu đã được cho là đóng vai trò quan trọng
trong sự phát triển và tiến triển của ung thư. Hơn 70 năm trước, Warburg tiên phong
nghiên cứu sự biến đổi trong quá trình hô hấp của ti thể với bệnh ung thư và đề xuất
cơ chế để giải thích ảnh hưởng của ti thể trong quá trình gây ung thư. Ông đưa ra giả
thuyết rằng một sự kiện then chốt trong ung thư liên quan đến sự phát triển tổn
thương của bộ máy hô hấp, dẫn đến tăng sản xuất ATP trong quá trình đường phân
[34]. Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu cầu năng lượng bằng cách sản xuất
một phần lớn ATP thông qua quá trình đường phân chứ không phải thông qua sự
phosphoryl oxy hóa. Do hiệu suất của quá trình đường phân thấp, điều này có thể giải

16. 7
thích phần nào các tế bào ác tính có nhu cầu tiêu thụ glucose lớn để đáp ứng nhu cầu
năng lượng. Điều này trái ngược với các tế bào bình thường, ưu tiên sử dụng quá
trình phosphoryl oxy hóa tạo ATP với hiệu quả cao. Sự khác biệt về trao đổi năng
lương giữa các tế bào bình thường và ung thư là một cơ sở sinh hóa để phát triển
chiến lược điều trị để tiêu diệt tế bào ung thư có chọn lọc. Kể từ khi ấn phẩm đầu tiên
của Warburg ra đời hơn nửa thế kỷ trước, đến nay nhiều khiếm khuyết của ti thể liên
quan đến ung thư đã được xác định và mô tả. Những khiếm khuyết này bao gồm các
thay đổi trong biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp và các
enzym đường phân và đột biến mtADN [10].
Hầu hết các protein ti thể được mã hóa bởi ADN nhân (nADN) và đưa vào ti
thể. Mặc dù các quá trình nhân bản của mtADN là không đồng bộ với quá trình nhân
bản nADN, số lượng tổng thể của ti thể trong mỗi tế bào vẫn tương đối ổn định trong
các loại tế bào cụ thể trong quá trình tăng sinh, cho thấy rằng quá trình tạo ti thể quyết
định phần lớn bởi các tín hiệu ngoài ti thể. Sự sinh tổng hợp của ti thể có thể tiếp tục
ngay cả khi mất mtADN. Như vậy, việc nhân bản ti thể không cần sự có mặt của
mtADN và không chịu ảnh hưởng của các đột biến trong mtADN, dẫn đến việc duy
trì các khiếm khuyết của ti thể [5].
1.1.2.1. Đột biến gen ti thể và bệnh ung thư
Hầu hết các tế bào của động vật có vú có chứa hàng chục, hàng trăm ti thể,
mỗi ti thể lại có chứa 2-10 bản sao mtADN [25]. Trong một cá thể, tất cả các bản sao
mtADN thường giống hệt nhau (homoplasmy), nhưng đột biến có thể phát sinh, duy
trì và được khuếch đại, do đó các bản sao đột biến khác nhau cùng tồn tại với kiểu
mtADN ban đầu (heteroplasmy). Khi tế bào phân chia, bộ gen ti thể được phân bố
ngẫu nhiên cho các tế bào con và do đó, mặc dù chỉ bắt đầu từ một trường hợp
heteroplasmy nhất định, nhưng kết quả có thể tồn tại mức độ khác nhau của
heteroplasmy và thậm chí có thể homoplasmy mtADN trong dòng tế bào khác nhau [14].
Bộ gen ti thể được đi truyền theo dòng mẹ; một vài ti thể từ tinh trùng có thể
xâm nhập vào trứng trong quá trình thụ tinh sẽ bị loại bỏ bởi cơ chế phụ thuộc
ubiquitin. Trong quá trình tạo trứng, chỉ có số lượng nhỏ phân tử mtADN được

17. 8
khuếch đại và truyền tới thế hệ sau con [18]. Hiện tượng này giải thích tại sao một đột
biến có thể trở thành dạng homoplasmy sau một hoặc một vài thế hệ.
Tỷ lệ biến đổi của mtADN nhanh hơn rất nhiều so với bộ gen nhân. Một trong
những nguyên nhân là mtADN không được bảo vệ bởi protein (histone), thêm vào đó
ti thể là nhà máy năng lượng của tế bào, nơi xảy ra các quá trình photphoryl oxi hóa
và nhiều quá trình sinh hóa khác, các quá trình này tạo ra các gốc oxy hóa tự do ROS
nên mtADN rất dễ bị tổn thương. Mặt khác, ti thể lại không có các cơ chế sửa chữa
ADN như nhân, theo một số công bố mtADN đột biến đột biến cao hơn nADN 10-
100 lần [22].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các đột biến và thay đổi trong mtADN đóng
một vai trò quan trọng trong một số bệnh như bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber,
bệnh tiểu đường di truyền theo dòng mẹ, hội chứng Leigh [8]. Bên cạnh các bệnh của
ti thể là đột biến dòng mầm, các đột biến soma mtADN cũng được tìm thấy ở nhiều
bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thư. Với vai trò quan trọng của ti thể trong quá trình
chuyển hóa ATP, trong tạo ra các gốc oxy hóa tự do và trong việc điều hòa quá trình
apoptosis, đột biến ở mtADN có khả năng ảnh hưởng đến năng lượng tế bào, gây ra
tổn thương ADN trung gian qua ROS và làm thay đổi phản ứng của tế bào cảm ứng
apoptosis với các tác nhân chống ung thư. Ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng
minh ảnh hưởng của đột biến mtADN đối với sự phát triển, di truyền và tiến triển
của nhiều bệnh ung thư khác nhau. Hơn nữa, tần suất đột biến mtADN cao trong ung
thư và sự xuất hiện của chúng trong giai đoạn sớm của bệnh có thể là chỉ thị để phát
hiện sớm bệnh ung thư [19].
Ung thư đại trực tràng: Trong một nghiên cứu đã tiến hành trên mô thường
và mô u của 10 bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã phát hiện 7 trong số 10 bệnh
nhân có đột biến soma mtADN. Các đột biến được tìm thấy trên các gen 12S rRNA,
16S rRNA, ND1, ND4L, ND5, Cytochrome b, COXI, COXIIvà COXIII [23]. Phần lớn
các đột biến là đột biến điểm soma ở vùng D-Loop không mã hóa trong đó A  T và
G  C và các đột biến mất đoạn được phát hiện bằng cách kết hợp 2 phương pháp
phân tích sợi đôi tương đồng heteroduplex và phương pháp biến tính sợi đơn (SSCP)
[1]. Một số nghiên cứu khác đã cho thấy mức độ biểu hiện tăng của mARN mã hóa

18. 9
ND2 ở các mô u so với các mô lành ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, mARN của
ND1 và rARN mã hóa cho tiểu đơn vị 16S tăng trong mẫu u của bệnh nhân polip
tuyến gia đình so với mô lành ruột kết [6].
Ung thư buồng trứng: Liu và cs đã phân tích mtADN từ mô bình thường và
mô u được lấy từ 10 bệnh nhân ung thư buồng trứng. Giải trình tự hoàn chỉnh
mtADN của cặp mô và so sánh phân tích, đã xác định được các đột biến soma với tỉ
lệ cao (60%). Hầu hết các đột biến được xác định là T  C hoặc G  A. Các đột biến
soma chủ yếu trên 4 khu vực của mtADN: D-loop, 12S rRNA, 16S rRNA và
cytochrome b [16].
Ung thư vú: Nhiều nghiên cứu toàn diện về đột biến mtADN ở ung thư vú đã
được công bố gần đây. Trong một nghiên cứu của Tan và cs, đã sử dụng kết hợp
phương pháp điện di và giải trình tự ADN trực tiếp để đưa ra trình tự hoàn chỉnh bộ
gen ti thể có đột biến ở 19 bệnh nhân, trên mẫu u và mẫu mô thường và đã xác định
được ở mtADN của 14 bệnh nhân có đột biến soma (74%). Phần lớn các đột biến
nằm trong vùng D-loop (81,5%). Tuy nhiên, đột biến cũng được phát hiện trên gen
16S rRNA, ND2 và ATPase [29]. Trong một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp
sinh thiết khối u nguyên phát của 18 bệnh nhân, đột biến soma được phát hiện trong
phần lớn các bệnh nhân (61%) và hầu hết các đột biến xác định là ở vùng D-loop, còn
lại đột biến đã được tìm thấy trên các vùng gen ND1, ND4, ND5 và cytochrome b
[21]. Các nghiên cứu trước đó cũng cho thấy tồn tại đột biến điểm và mất đoạn
mtDNA ở bệnh nhân ung thư vú. Đột biến mất đoạn phổ biến nhất 4977 bp được tìm
thấy trong mô u ác tính và mô vú lành của các bệnh nhân có các bất thường vú [4].
Ngoài đột biến ở mtADN, biểu hiện cao của mARN cytochrome c oxidase II cũng
được phát hiện trong mô u ở một số bệnh nhân so với mô bình thường [24].
1.1.2.2 Biến đổi số lượng bản sao gen ti thể và bệnh ung thư
Như đã nêu ở trên, mỗi tế bào chứa hàng trăm, ngàn ti thể, trong mỗi ti thể lại
chứa 2-10 bản sao mtADN, tuy nhiên số lượng bản sao mtADN tương đối ổn định trong
diều kiện sinh lí. Nhiều nghiên cứu ở bệnh nhân ung thư nguyên phát đã chỉ ra rằng thay
đổi số lượng bản sao mtADN là một yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ti thể và có liên

19. 10
quan đến sự hình thành và phát triển ở nhiều loại ung thư. Biến đổi số lượng bản sao
mtADN liên quan đến bệnh ung thư đã được nghiên cứu rộng rãi bằng nhiều phương
pháp tiếp cận.
Năm 2004, Yin và cs đã nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN và ti
thể ở bệnh nhân ung thư biểu mô gan (HCC). Ở bệnh nhân HCC số lượng bản sao
mtADN giảm ở mô u so với mô lành tương ứng. Biểu hiện thụ thể kích hoạt
peroxisome proliferator γ coactivator-1 bị ức chế mạnh ở bệnh nhân, trong khi các
biểu hiện của các protein liên kết với mtADN sợi đơn lại tăng, cho thấy hoạt động
chức năng sinh học của ti thể bất thường ở bệnh nhân HCC. Đáng chú ý là 22%
bệnh nhân HCC mang một đột biến soma trong vùng D-loop của mtADN. Vùng gan
lành của bệnh nhân HCC có tiền sử uống rượu trong nhiều năm có số lượng bản sao
mtADN giảm và mức độ mất đoạn 4977 bp cao hơn so với bệnh nhân không uống
rượu. Kết quả cho thấy số lượng bản sao mtADN giảm, suy giảm chức năng ti thể
và đột biến soma trong mtADN là những sự kiện quan trọng trong quá trình sinh
ung thư HCC [38]. Bên cạnh đó trong một nghiên cứu năm 2006 của Yamada và cs
ở 31 bệnh nhân HCC đã chứng minh rằng hàm lượng mtADN thấp có liên quan mật
thiết với kích thước khối u và xơ gan. Bệnh nhân HCC có hàm lượng mtADN thấp
hơn thường có tiên lượng xấu hơn và thời gian sống ngắn hơn [36]. Đối với bệnh
nhân ung thư phổi NSCLC, tìm ra mối liên hệ giữa giảm số lượng bản sao mtADN
được gắn liền với sự phát triển của khối u. Tương tự, sự giảm hàm lượng mtADN
phổ biến hơn ở các bệnh nhân ung thư dạ dày [33]
Một số nghiên cứu khác cho thấy số lượng bản sao mtADN trong mô ung thư
cao hơn so với các mô lân cận. Năm 2006, Wang và cs cho thấy ở ung thư buồng
trứng, số lượng bản sao mtADN thấp ở giai đoạn đầu và cao hơn nhiều giai đoạn
sau, cho thấy mối tương quan giữa việc tăng số lượng bản sao mtADN tới tiến triển
của bệnh nhân ung thư buồng trứng [31].
Trong báo cáo năm 2008 của Lin và cs, việc giảm số lượng bản sao mtADN
trong các mô ung thư có thể làm giảm tổn thương của quá trình oxy hóa mtADN,
thúc đẩy quá trình phát triển và tạo điều kiện cho tế bào ung thư trở thành bất tử.
Mẫu ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) đã được thu thập từ 29 bệnh

20. 11
nhân ở giai đoạn III sau khi hóa trị hỗ trợ trị liệu và phẫu thuật cắt bỏ. Số lượng bản
sao mtADN tương đối và các tổn thương oxy hóa mtADN của mỗi mô ung thư được
xác định bằng phương pháp PCR định lượng. Kết quả cho thấy số lượng bản sao
mtADN ít và quá trình ôxy hoá mtADN mức độ thấp có tương quan với sự tiến triển
của khối u. Hơn nữa, số lượng bản sao mtADN và tổn thương của quá trình oxy hóa
mtADN thấp hơn ở những bện nhân NSCLC sau khi hóa trị. Phát hiện này cho thấy
sự suy giảm hàm lượng mtADN có thể dẫn đến giảm mật độ của ti thể trong tế bào
ung thư, dẫn đến giảm sản xuất ROS nội sinh và giảm ROS gây tổn thương ADN để
tế bào ung thư trở thành bất tử [15].
1.2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ
Ung thư vú là loại ung thư phổ biến thứ hai trên thế giới và là bệnh ung thư
thường gặp nhất ở phụ nữ với ước tính 1,67 triệu trường hợp ung thư mới được chẩn
đoán vào năm 2012 (25% của tất cả các trường hợp mắc bệnh ung thư). Nó là loại
ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ cả ở các nước kém phát triển (883.000 trường hợp) và
các nước phát triển (794.000). Tỉ lệ mắc bệnh rất khác nhau giữa các khu vực trên thế
giới, dao động từ 27 trên 100.000 ở khu vực Trung Phi và Đông Nam Á và 96 ở khu
vực Tây Âu. Ung thư vú rất hiếm gặp ở nam giới nhưng lại rất phổ biến ở phụ nữ. Tỷ
lệ mới mắc ung thư vú ở nam ít hơn 100 lần so với nữ [40].
Theo hồ sơ từ tổ chức Globocan về tình hình ung thư thế giới, ung thư vú là
nguyên nhân tử vong đứng thứ năm do ung thư nói chung (522.000 trường hợp tử
vong) và là loại ung thư hàng đầu gây tử vong ở phụ nữ ở khu vực kém phát triển
(324.000 người chết, 14,3% trên tổng số) và thứ hai ở khu vực phát triển hơn
(198.000 người chết, 15,4%) sau ung thư phổi [44].
1.2.1. Phân loại ung thư vú
Có nhiều loại ung thư vú phát sinh từ các dạng tế bào khác nhau, nhưng phổ
biến nhất là hai loại: Ung thư biểu mô ống và ung thư biểu mô tuyến, được dặt tên
theo dạng tế bào mà chúng bắt nguồn [41].

21. 12
 Ung thư biểu mô ống: Ung thư xuất phát từ tế bào biểu mô ống dẫn sữa, là
dạng ung thư vú thường gặp nhất ở nữ giới, chiếm khoảng 85 - 90%. Ung thư biểu
mô ống có nhiều dạng phát triển khác nhau:
- Ung thư biểu mô nội ống (ung thư tại chỗ): Ung thư thời kì đầu, chỉ giới
hạn bên trong của hệ thống ống, không di căn.
- Ung thư biểu mô ống xâm lấn: Dạng phổ biến nhất của ung thư vú, chiếm
80% các trường hợp ung thư vú. Nó bắt đầu từ các tế bào lót nằm trong
đường ống dẫn sữa của vú, phá vỡ thành ống và bắt đầu di căn đến các nơi
khác của cơ thể.
 Ung thư biểu mô tuyến: Ung thư xuất phát từ tế bào biểu mô tuyến sữa,
chiếm khoảng 8%. Nó thường xảy ra ở phụ nữ ngoài 40 và 50 tuổi:
- Ung thư biểu mô tuyến tại chỗ: Chỉ giới hạn trong hệ thống tuyến.
- Ung thư biểu mô tuyến xâm lấn: Thường làm dầy lên phần vòng cung của
vú.
Ngoài ra có một số loại ít gặp hơn như:
 Ung thư biểu mô tuyến hình ống: chiếm khoảng 2%, là dạng ung thư biểu mô
tế bào dạng ống có cấu trúc hình ống khi nhìn dưới kính hiển vi.
 Ung thư biểu mô tiết niêm dịch: chiếm khoảng 1-2%. Sự khác biệt chính đặc
trưng của dạng ung thư này là sản xuất ra dịch nhầy và rất khó tìm thấy tế bào.
 Ung thư vú dạng viêm: chiếm khoảng 1-3% các trường hợp ung thư vú, có
biểu hiện rất rõ, gây tắc các mạch bạch huyết dưới da.
 Bệnh Paget núm vú: Trông giống như bị phát ban da hoặc da thô ráp ở phần
đầu vú và có thể ngứa. Khi có triệu chứng ngứa và đóng vảy (nếu bị trầy xước) có thể
là dấu hiệu ung thư, có thể dưới bề mặt của da bị phá vỡ, ung thư sau đó sẽ xâm lấn
các vùng khác của vú.
1.2.2. Các giai đoạn của ung thư vú
Phương pháp phân giai đoạn bệnh ung thư dựa vào kích thước khối u, hạch
lympho và di căn (TNM, Tumor - Lymph Node - Metastasis) được đề xuất bởi
Clifton Mountain và đã được Liên Ủy ban ung thư Hoa Kỳ (AJCC) và Hiệp hội

22. 13
chống ung thư quốc tế (UICC) thông qua năm 1974. Theo cách phân giai đoạn này,
các giai đoạn T, N, M của ung thư vú được xác định như sau [42]:
 Theo yếu tố T - Tumor (u nguyên phát)
- Tx: Không thể xác định được khối u
- Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ (bao gồm DICS, LICS hoặc bệnh Paget
núm vú không có ung thư liên quan)
- T0: Không thấy được sự rõ ràng của khối u
- T1 (bao gồm T1a , T1b, T1c): kích thước khối u nhỏ hơn hoặc bằng 2cm
- T2: Kích thước khối u lớn hơn 2cm nhưng nhỏ hơn 5cm.
- T3: Khối u có kích thước lớn hơn 5cm.
- T4: Khối u có kích thước bất kỳ lan đến da và thành ngực.
 Theo yếu tố N - lymph Node (Hạch)
- Nx: Không xác định được vùng hạch bạch huyết gần đó.
- N0: Ung thư không lây lan đến các hạch bạch huyết gần đó.
- N1: Ung thư đã lan rộng đến các hạch lympho vùng nách.
- N2: Ung thư đã lan rộng 4 - 9 hạch bạch huyết dưới cánh tay hoặc đã mở
rộng đến các hạch bạch huyết trong vú.
- N3: Di căn tới hạch lympho bên trong tuyến sữa ở cùng một bên.
 Theo yếu tố M - Metastasis (mức độ di căn)
- Mx: Không đánh giá được sự di căn.
- M0: Không có di căn xa.
- M1: Có sự di căn đến các cơ quan khác, phổ biến nhất là xương, phổi,
não và gan.

23. 14
1.2.3 Các yếu tố nguy cơ
Nguyên nhân gây ra bệnh ung thư vú hiện giờ vẫn chưa được xác định rõ,
nhưng người ta đã tìm ra các mối liên quan của một số yếu tố nguy cơ đối với bệnh
ung thư vú [43].
 Giới tính: Nữ giới có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao hơn 100 lần so với
nam giới và nguy cơ mắc bệnh cũng tăng theo tuổi.
 Các yếu tố di truyền: Khoảng từ 5% đến 10% trường hợp ung thư vú được
cho là liên quan đến những thay đổi di truyền (đột biến) trong một số gen nhất định,
phổ biến nhất là của các gen BRCA1 và BRCA2. Gen nằm trên nhiễm sắc thể số 17,
đột biến gen này liên quan tới 55%-85% trường hợp mắc ung thư vú. Bệnh nhân mắc
hội chứng Li-Fraumeni với đột biến gen p53, hội chứng Conden đột biến gene
PTEN… cũng là yếu tố làm tăng nguy cơ ung thư vú [32].
 Tiền sử gia đình: Những phụ nữ có thân nhân cận huyết từ cả gia đình nội
ngoại mắc ung thư vú có nguy cơ mắc bệnh này cao hơn. Đặc biệt những người có
mẹ, chị em gái, hay con gái bị ung thư vú sẽ có nguy cơ tăng gấp đôi. Tuy nhiên, hầu
hết phụ nữ bị ung thư vú (trên 85%) lại không có lịch sử gia đình về bệnh này.
 Ung thư vú cũng có nguy cơ tái phát bệnh, một người đã từng bị ung thư ở
một vú có thể bị tái phát ở vú đó hoặc mắc ung thư ở vú còn lại. Đặc biệt, ung thư
biểu mô thuỳ tại chỗ có nguy cơ phát triển ung thư cao hơn 7-11 lần ở vú bên kia so
với các trường hợp ung thư vú khác. Những phụ nữ có u vú lành tính hay người có
mô tuyến dầy đặc cũng có nguy có mắc ung thư vú cao hơn những người khác.
 Ung thư vú liên quan mật thiết đến sự thay đổi hormon trong cơ thể người
phụ nữ. Sự thay đổi hormon mạnh mẽ ở một số giai đoạn đặc biệt ở phụ nữ và các
liệu pháp hormon làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vú. Người ta nhận thấy mối
liên hệ giữa ung thư vú với các hormon estrogen và progesterone. Ở những phụ nữ
bắt đầu có kinh sớm (trước tuổi 12) hoặc những người mãn kinh muộn (sau tuổi 55),
thời gian có kinh kéo dài tức là có sự thay đổi nhiều hơn đối với 2 hormon này và họ
có nguy cơ mắc cao hơn. Liệu pháp thay thế hormon kết hợp hai hormon estrogen và
progesterone được sử dụng sau thời kì mãn kinh giúp giảm các triệu chứng của mãn

24. 15
kinh và giúp ngăn ngừa loãng xương và giảm nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung nhưng
lại có nguy cơ mắc ung thư vú tăng. Những người có con muộn hoặc không có con và
người sử dụng thuốc tránh thai cũng có nguy cơ này. Một số nghiên cứu còn chỉ ra
rằng nếu cho con bú từ 1,5 đến 2 năm có thể làm giảm nguy cơ mắc ung thư vú.
 Ngoài ra còn có nhiều yếu tố khác: Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến mật
độ tuyến vú như tuổi tác, tình trạng mãn kinh, một số loại thuốc (bao gồm liệu pháp
hormone mãn kinh), mang thai và di truyền. Những người đã từng tiếp xúc với phóng
xạ, hay từng trải qua xạ trị, người thừa cân hoặc béo phì, vận động ít, sử dụng rượu
thường xuyên hay sử dụng nhiều chất béo…cũng góp phần làm tăng nguy cơ ung thư vú.
1.3. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ
Năm 2007, Yu và cs đã phân tích số lượng bản sao mtADN ở 59 mẫu mô u
và mô lân cận u bằng phương pháp PCR định lượng. Kết quả cho thấy rằng mức độ
của mtADN giảm đáng kể trong các mô u so với mô lân cận u liền kề. Số lượng bản
sao mtADN giảm có liên quan với nhóm tuổi từ 50 trở lên. Ngoài ra, trong khối u
mang đột biến ở vùng D-loop, có số lượng bản sao mtADN thấp hơn đáng kể. Việc
giảm số lượng bản sao mtADN có thể tham gia vào quá trình hình thành và tiến
triển ở ung thư vú và có nhiều tiểm năng được sử dụng như một công cụ để chẩn
đoán tiên lượng. Đột biến soma ở vùng D-loop có lẽ là một trong những yếu tố góp
phần quan trọng dẫn đến giảm số lượng bản sao mtADN trong các khối u vú [39].
Năm 2009, Xia và cs tiến hành nghiên cứu mẫu máu ngoại vi được thu thập
từ 60 bệnh nhân ung thư vú và 51 đối chứng là người bình thường khỏe mạnh có độ
tuổi tương ứng. ADN được tách chiết từ máu ngoại vi, được định lượng mtADN và
nDNA bằng phương pháp PCR định lượng đa mồi (multiplex real-time PCR) để
khuếch đại trình tự của gen ATP8 và gen glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase. Lượng mtADN được xem xét tương ứng với giai đoạn của khối u,
tình trạng kinh nguyệt, tuổi, tình trạng hạch bạch huyết, các biểu hiện của thụ thể
estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR) và protein / neu-2 của bệnh nhân ung thu
vú. Họ đã thu được kết quả lượng mtADN ở bệnh nhân ung thư vú giai đoạn I thấp

25. 16
hơn đáng kể so với các giai đoạn khác. Số lượng bản sao mtADN giảm được tìm
thấy trong nhóm bệnh nhân ung thư trong giai đoạn mãn kinh. Không có sự khác
biệt về số lượng bản sao mtADN liên quan đến tuổi, số hạch, ER, PR, Her-2 / neu.
Trong nghiên cứu này, số lượng bản sao mtADN giảm trong máu ngoại vi của bệnh
nhân ung thư vú được gắn liền với giai đoạn I. Việc sử dụng mtADN có thể có giá
trị chẩn đoán và nghiên cứu sâu hơn, có tiềm năng trở thành một chỉ thị để phát
hiện sớm ung thư vú [35].
Năm 2013, Thyagarajan và cs đã nghiên cứu mối liên quan giữa số lượng
bản sao mtADN trong máu ngoại vi và nguy cơ ung thư vú ở 184 bệnh nhân ung thư
vú và 529 mẫu đối chứng. Số lượng bản sao mtADN được xác định bằng phương
pháp PCR định lượng. Các phân tích đã cho thấy rằng có mối liên hệ giữa số lượng
bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú. Nguy cơ cao đối với những bệnh nhân ung
thư vú nguyên phát mắc dưới 3 năm có số lượng bản sao mtADN trong máu ngoại
vi cao. Không có mối liên quan giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư
vú ở phụ nữ đã cung cấp mẫu máu trên 3 năm trước khi chẩn đoán ung thư vú.
Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung
thư vú phụ thuộc vào thời gian lấy máu và chẩn đoán ung thư vú [30].
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về biến đổi số lượng bản sao
ADN ti thể, nhưng ở Việt Nam đây là một hướng nghiên cứu rất mới. Cho đến nay,
chúng tôi vẫn chưa tìm thấy một công bố chính thức về nghiên cứu biến đổi số lượng
bản sao mtADN đối với bệnh ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng ở Việt Nam.
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ
Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN đang là một hướng nghiên cứu
chỉ thị ung thư khả quan và có nhiều hứa hẹn. Các phương pháp nghiên cứu được sử
dụng nhiều để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN hiện nay gồm:
Phương pháp PCR định lượng
Đây là phương pháp được phát triển dựa trên phương pháp PCR, được sử
dụng để khuếch đại và định lượng một đoạn ADN đích. Trong đó kết quả khuếch
đại được hiển thị ngay sau mỗi chu kì phản ứng. Đo đó cho phép xác định số lượng

26. 17
bản ADN đích được khuếch đại với độ nhạy và độ chính xác cao. kỹ thuật này được
sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN hiện nay.
PCR định lượng sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng
lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu
huỳnh quang. PCR định lượng cho phép xác định số bản sao mtADN ban đầu có
trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai kỹ thuật hay được sử dụng:
 Kỹ thuật sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực
rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát được ánh
sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
 Kỹ thuật sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang. Khi có
mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của đầu dò
lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ
ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích.
 Phương pháp PCR định lượng cho phép định lượng đột biến mtADN với mức
độ không đồng nhất thấp dưới 1% [37].
Phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và DHPLC (sắc ký lỏng
hiệu năng cao biến tính)
HPLC là một kỹ thuật trong hóa học phân tích được sử dụng để tách các
thành phần trong hỗn hợp, xác định từng thành phần và định lượng các thành phần.
Đây là một kĩ thuật cơ bản, kinh điển trong phân tích sinh học, đặc biệt trong phân
tích các hợp chất hóa sinh học. Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng
dụng rộng rãi, cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ. Tuy độ nhạy và chính xác
không được bằng phương pháp PCR định lượng nhưng cũng cho các kết quả định
lượng đáng tin cậy. Bên cạnh đó ứng dụng của HPLC rất đa dạng, có thể sử dụng
phân tích protein, ADN hay các hợp chất hóa học.
Phương pháp RPLC-HPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký
lỏng pha đảo để phân tách ADN có kích thước khác nhau. Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định
của mtADN để xác định đột biến.
Phương pháp DHPLC được phát triển từ phương pháp HPLC, sử dụng cột
sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép

27. 18
(heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex). Các mạch ADN được phân tách ở
nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN
dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có
thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định
của mtADN để xác định đột biến. Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột
biến mtADN thấp tới 1% [11].
Phương pháp định lượng bằng phần mềm phân tích hình ảnh bản gel điện di
Sự phát triển mạnh mẽ của các hệ thống phần mềm, các ứng dụng tin học đã
có nhiều đóng góp to lớn trong các ngành khoa học nói chung và ngành sinh học nói
riêng. Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có
thể áp dụng rộng rãi.
Sau khi tham khảo các ưu, nhược điểm của các kỹ thuật trên và dựa trên điều
kiện của phòng thí nghiệm cho phép chúng tôi ứng dụng kỹ thuật HPLC và phần
mềm ImageJ để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư
vú. Việc kết hợp phương pháp kinh điển với độ chính xác cao trong sinh học thực
nghiệm là HPLC với phương pháp ứng dụng phần mềm phân tích hình ảnh sẽ cho
kết quả khách quan và toàn diện hơn để khảo sát sự biến đổi số lượng bản sao
mtADN đối với bệnh nhân ung thư nói chung và bệnh nhân ung thư vú nói riêng,
qua đó đánh giá được vai trò và mức độ liên quan của biến đổi đó đối với bệnh.

28. 19
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là mô vú tại vị trí khối u và mô vú lân cận ở rìa vị trí u của
bệnh nhân ung thư vú. Mẫu mô vú sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào
và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K cung cấp (danh sách bệnh nhân được trình bày ở
phần phụ lục 1).
Mẫu đối chứng là mẫu máu và mô của người u xơ vú (danh sách bệnh nhân
được trình bày ở phần phụ lục 2). Mẫu mô được cho vào ống eppendorf vận chuyển
về trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu -80O
C. Mẫu máu được đựng trong ống
đựng máu chuyên dụng có chứa chất chống đông.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê trong bảng 1
Bảng 1. Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu
Tên hóa chất Nhà sản xuất
Hóa chất tách ADN tổng số mô từ mô
(QIA amp DNA mini kit)
QIAGEN (Đức)
Hóa chất tách ADN tổng số từ máu
(GeneJET Whole Blood Genomic DNA
Mini KIT)
Thermo Scientific (Mỹ)
Hóa chất thôi gel QIAGEN (Đức)
Cặp mồi gen ti thể mt và cặp mồi gen
β-actin (ACTB)
IDT (Mỹ)
Maxima Hot Start PCR MasterMix (2x) Thermo Scientific (Mỹ)
Agarose Invitrogen (Mỹ)
APS, Acrylamide, Bis-Acrylamide Pharmacia, Thụy Điển
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific (Mỹ)

29. 20
NoLimits DNA Fragment 100bp,
200bp, 400bp
Thermo Scientific (Mỹ)
Acetonitrile, HPLC gradient grade Merk (Đức)
Acid acetic Sigma (Mỹ)
Triethylamin Sigma (Mỹ)
Các hóa chất khác như isopropanol, ethanol, agarose, bạc nitrate,… đều đạt độ
sạch phân tích dùng trong sinh học phân tử.
2.1.3. Dụng cụ
- Bể ổn nhiêt (Julabo, Đức)
- Tủ an toàn sinh học (Nuaire, Mỹ)
- Buồng điện di Mini-Protean 3 cell (Bio-rad, Mỹ)
- Buồng điện di agarose (Bio-rad, Mỹ)
- Speed Vac (Thermo Electron, Mỹ)
- Máy nhân gen PCR 9700 system (Applied Biosystems, Mỹ)
- Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)
- Máy đo NanoDrop 2000c (Thermo Scientific)
- Máy lắc ổn nhiệt (IKA, Đức )
- Tủ ấm (Memer, Đức )
- Tủ lạnh -20C và -80C (Nuaire, Mỹ)
- Hệ thống lọc nước loại vi khuẩn (Pyrex, Mỹ )
- Hệ thống máy microHPLC (Shimadzu, Nhật)
- Cột Hotsep PLRP-S (GTSepTech, Nauy )
- Máy scan, chụp ảnh gel cùng với phần mềm phân tích hình ảnh.
- Máy tính trang bị các phần mềm tin sinh học kết nối đến các cơ sở dữ liệu
trực tuyến, phần mềm thiết kế mồi Primer-BLAST.
- Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Proteomics và Sinh học
Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein.

30. 21
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau (Hình 2)
Hình 2- Sơ đồ quy trình thí nghiệm
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô
- Mẫu mô u và mẫu mô mô lân cận được lấy ra từ tủ -80C, sau đó mẫu được
rã đông và chia nhỏ và tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết
ADN từ mô QIA amp DNA minikit (Qiagen) theo quy trình của nhà sản xuất.
2.2.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu
- Mẫu máu (bệnh nhân, người bình thường) được lấy ra từ tủ -80C, rã đông,
lấy 200 μl cho vào ống eppendorf và tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit
tách chiết ADN từ máu- GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini
KIT theo quy trình của nhà sản xuất (Thermo Scientific, Mỹ).
2.2.1.3. Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di agarose
- Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ
ADN bằng máy NanoDrop.

31. 22
- Mẫu ADN sau khi được tách chiết được bảo quản ở -20o
C để sử dụng cho
các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích
định lượng
2.2.2.1. Phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp
- Phân tích HPLC với ADN chuẩn 100 bp, 200bp và 400 bp để lựa chọn kích
thước sản phẩm cần thiết kế cho phản ứng PCR đa mồi.
- Nước sử dụng trong phân tích HPLC là nước khử ion.
- Thành phần các hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC (bảng 2)
Bảng 2: Thành phần hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC
Hóa chất Thành phần
TEAA 1M Triethylamin 1M +acid acetic 1M
Đệm A TEAA 0,1M + EDTA 0,1mM, pH 7,0
Đệm B
TEAA 0,1M + acetonitrile 50% + EDTA
0,1mM, pH 7,8
Dung dịch bảo quản Acetonitrile 50%
- Chương trình Phân tích HPLC được thực hiện theo các bước sau (Hình 3)
Hình 3- Chương trình phân tích HPLC
- Loại cột: HotSep PLRP-S: S-167-1010, 5µ- 1000Å,
- Kích thước cột: đường kính 1.0 mm, dài 10 cm.
- Tốc độ dòng 20 µl/ phút.
- Nhiệt độ buồng cột: 50o
C
- Đo ở bước sóng 260nm.

32. 23
2.2.2.2. Thiết kế các cặp primer
Để định lượng số bản sao mtADN chúng tôi thiết kế hai cặp primer cho phản
ứng PCR đa mồi để tạo sản phẩm cho các phương pháp định lượng sau đó. Với mục
đích định lượng số bản sao của mtADN, chúng tôi chọn gen giữ nhà trong nhân là
gen β-actin (ACTB) và đoạn gen đặc trưng cho tính bảo thủ của mtADN được lựa
chọn là ở vùng gen ND1– mã hóa cho 1 tiểu phần của Ubiquinon trong phức hệ 1
của chuỗi hô hấp của ti thể. Ngoài ra, để quá trình phân tích và định lượng bằng
HPLC được tiến hành thuận lợi, các đoạn ADN (sản phẩm PCR định lượng) phải
được lựa chọn sao cho có sự khác biệt nhất định về kích thước.
Các cặp primer được thiết kế dựa trên các trình tự gen được tham khảo trên
cơ sở dữ liệu NCBI (gen β-actin: NG_007992.1; mtDNA: NC_012920.1) và phần
mềm thiết kế Primer-BLAST (NCBI).
Khuếch đại đoạn gen mt và gen ACTB bằng phương pháp PCR
- Đoạn gen mt và ACTB được khuếch đại bằng phương pháp PCR với thể tích
12,5 µl nhằm kiểm tra cặp mồi có nhân sản phẩm đúng kích thước không.
- Phản ứng PCR với từng cặp primer mt và ACTB gồm các thành phần trong
bảng 3.
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích Nồng độ
cuối cùngPhản ứng 12,5 µl Phản ứng 100 µl
Master mix Maxima 2X 6,25µl 50 µl 1X
Primer F (10-5
M) 0,25µl 2 µl 0,2 µM
Primer R (10-5
M) 0,25 µl 2 µl 0,2 µM
ADN khuôn Tùy nồng độ ADN tổng số của mẫu 1 ng
H2O siêu sạch
Bổ sung đủ 12,5
µl
Bổ sung đủ 100
µl

33. 24
Chu trình nhiệt được thiết lập như sau (Hình 2.2.2.3)
Hình 4- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB
Khuếch đại đoạn gen ti thể mt và đoạn gen nhân ACTB bằng phương pháp
PCR đa mồi
- Khuếch đại bằng phản ứng PCR đoạn gen mt và ACTB với thể tích 15 µl
gồm các thành phần như trong bảng 4.
Bảng 4. Thành phần phản ứng PCR (thể tích 15 µl)
Thành phần Thể tích
Nồng độ cuối
cùng
Master mix Maxima 2X 7,5µl 1X
Primer mt-F (10-5
M) 0,3 µl 0,2 µM
Primer mt-R (10-5
M) 0,3 µl 0,2 µM
Primer ACTB-F (10-5
M) 0.3 µl 0,2 µM
Primer ACTB-R (10-5
M) 0.3 µl 0,2 µM
ADN khuôn
Tùy nồng độ ADN tổng số
của mẫu
2 ng
H2O siêu sạch Bổ sung đủ 15 µl
Chu trình nhiệt được thiết lập như ở hình 4 ở trên.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di
Trong đệm TBE (pH 7,5 - 8.3), các phân tử acid nucleic tích điện âm nên
dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuyển động từ cực âm
sang cực dương. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích

34. 25
thước phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có
khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thường sử dụng là agarose
và polyacrylamide. Tùy vào kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử
dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.
Kích thước sản phẩm PCR đoạn gen mt là 433 bp và đoạn gen ACTB là 107
bp, nên có thể phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.7%.
2.2.2.3. Nhân dòng đoạn gen mt và ACTB và giải trình tự ADN
Các đoạn ADN tinh sạch được nhân dòng để giải trình tự nhằm xác định trình tự
của các đoạn gen.
- Tiến hành tạo đầu bằng và biến nạp đoạn mt và ACTB bằng kit CloneJET
PCR Cloning Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (vectơ được sử dụng là pJET 1.2
có kích thước 2974bp. Vị trí đa điểm của vector được thiết kế nằm trong gen mã
hóa cho một protein gây độc cho vi khuẩn).
- Vectơ được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
- Các tế bào sau biến nạp thành công sẽ mọc trên môi trường LB đặc có chứa
ampicillin.
- Các khuẩn lạc sau khi được kiểm tra đúng bằng PCR sẽ được nuôi với thể
tích lớn 5ml trong môi trường LB có chứa ampicillin ở 37o
C trong 14-16h lắc 200
vòng /phút.
- Sau đó các tế bào được thu và tách plasmid bằng QIAprep Spin Miniprep Kit
(Qiagen).
- Kiểm tra plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ ADN
bằng máy đo quang phổ Nanodrop.
- Plasmid thu được sẽ được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi mt, ACTB và
pJET, nếu đúng sẽ cho đoạn gen có kích thước tương ứng với các cặp mồi và với
mồi PJet sẽ cho đoạn gen lớn hơn 120bp so với kích thước của các đoạn gen tương
ứng.
- Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,7%.
- Mẫu plasmid sau khi tinh sạch sẽ được giải trình tự ADN.

35. 26
2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Plasmid sau khi dược khuếch đại với thể tích lớn 100 µl sẽ được tinh sạch
bằng kit thôi gel QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Đức)
- Kiểm tra ADN tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1.5 % và đo nồng độ
ADN bằng máy NanoDrop.
Mẫu ADN sau khi tinh sạch được bảo quản ở -20o
C để sử dụng cho các thí
nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Định lượng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ
2.2.3.1. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi mt_ACTB để phục vụ
mục đích định lượng:
Theo lý thuyết PCR, số bản sao đoạn gen sẽ tăng theo chu kỳ, tuy nhiên với
số chu kỳ lớn hơn 40 thì sản phẩm đạt đến tình trạng bão hòa. Điều này được giải
thích với các nguyên nhân chủ yếu như: nồng độ bản sao DNA tăng khiến cho
lượng dNTP không đủ cung cấp; hoạt tính enzyme polymerase giảm sau nhiều chu
trình thay đổi nhiệt độ. Vì vậy, việc xác định các chu kỳ mà tại đó sản phẩm PCR
vẫn đang thay đổi tuyến tính mang tính quyết định tới độ chính xác của kết quả định
lượng sau này. Đặc biệt là đối với phản ứng PCR đa mồi còn có cả sự cạnh tranh
dNTP, enzyme polymerase và không loại trừ khả năng bắt cặp giữa các cặp mồi.
Chính vì vậy, dựa vào các kết quả PCR đơn và đa mồi phía trên, chúng tôi
tiến hành tìm các chu kỳ cho PCR đa mồi mà ở đó lượng sản phẩm vẫn đang biến
đổi tuyến tính. Tiến hành PCR ở các chu kì khác nhau 20, 25, 30, 35 chu kì để chọn
được chu kì PCR phù hợp (nằm trong khoảng tuyến tính).
2.2.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB bằng điện di
Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 10% (bảng 2.2.4.2).
Điện di bằng đệm TBE 1X (pH 7,5 - 8,3) ở 175 V trong 40 phút. Sau đó được
nhuộm bạc và quan sát dưới ánh sáng trắng.

36. 27
Bảng 5. Công thức đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm
2.2.3.3 Kỹ thuật nhuộm bạc
Bản gel sau điện di trên gel polyacrylamid được nhuộm bạc dựa trên phương
pháp của Bassam (1991) [3] gồm các bước sau:
- Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% lắc bằng máy lắc trong 20 phút.
- Rửa bằng nước cất ba lần, mỗi lần 5 phút.
- Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat trong 20 - 30 phút, lắc đều, tránh ánh sáng.
- Rửa nước khoảng 30 giây - 1 phút.
- Hiện băng bằng dung dịch develop (30g/L Na2CO3, 0,056% formaldehyde,
400 µg/L natri thiosulfate) trong 3- 5 phút.
- Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 1 – 2 phút.
- Bảo quản gel bằng nước cất, quan sát kết quả bằng ánh sáng trắng.
2.2.3.4. Định lượng số bản sao ADN ti thể bằng HPLC
- Các mẫu sau khi PCR được li tâm với tốc độ 13000v/phút ở 5o
C trong 15
phút để chuẩn bị phân tích bằng HPLC.
- Nước sử dụng trong quá trình chạy HPLC là nước khử ion.
- Thành phần các hóa chất chạy HPLC ở bảng 2
- Mẫu chạy HPLC gồm 9 µl sản phẩm PCR đã li tâm, bổ sung 1 µl TEAA 1M
ph7.
- Mỗi lần phân tích HPLC, cài chương trình cho bộ phận bơm mẫu tự động
hút 3 µl mẫu.
- Các mẫu được phân tích theo chương trình như Hình 3
Thành phần Gel 10% bản 7cm
Monoacrylamide 20% 1,65ml
TBE 1X 3.3ml
APS 37,5µl
TEMED 3µl

37. 28
- Dựng đường chuẩn với các đoạn ACTB và mt tinh sạch.
- Tiến hành phân tích HPLC các mẫu PCR.
- Sau khi thực hiện xong ta sẽ có hình các đỉnh sắc ký, đựa vào phần phân tích
của phần mềm LC solution kết nối với hệ thống HPLC ta sẽ tính được diện tích
của các đỉnh sắc ký.
- Số lượng bản sao ADN ti thể (giá trị tương đối) có thể tính toán dựa theo
công thức:
n= k. a/b
Trong đó: k: tỉ số nồng độ các cặp mồi ACTB/mt
a: diện tích đỉnh của sản phẩm mt
b: diện tích đỉnh của sản phẩm ACTB
2.2.3.5. Định lượng số bản sao ADN ti thể bằng phần mềm phân tích hình
ảnh gel điện di:
- ImageJ là phần mềm miễn phí, mã nguồn mở được sử dụng cho phân tích
hình ảnh gel điện di. Phần mềm cho phép phân tích lượng ADN của các băng điện
di thông qua việc xác định mật độ điểm ảnh (densitometry) của các vùng được lựa
chọn phân tích của các mẫu.
- 2 µl các mẫu PCR được chạy điện di trên gel polyacrylamide 10%, 175V
trong 40 phút và nhuộm bạc.
- Bản gel sẽ được scan để lấy hình ảnh sử dụng phân tích.
2.2.4. Tính toán thống kê
Số liệu xử lí và phân tích thống kê bằng Microsoft Excel và phần mềm SPSS.
So sánh tỷ số mt/ACTB giữa các mẫu mô khác nhau và phân tích mối liên
quan với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú bằng kiểm định test
Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis.

38. 29
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết thành công ADN
tổng số từ 46 mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú và 20 mẫu máu và mô
của bệnh nhân u xơ vú. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 0,8% (Hình 5).
Hình 5- Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ các mẫu nghiên cứu (điện di trên
gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)
Các giếng 1-6: ADN tách ở bệnh nhân u xơ; các giếng 7-12: ADN tách ở bệnh nhân ung
thư vú. 2 giếng liên tiếp 1-2, 3-4, 5-6; theo thứ tự là mẫu máu và mô của bệnh nhân u xơ:
7-8, 9-10,11-12 theo thứ tự là mẫu mô lân cận u và mô u của cùng bệnh nhân.
Kết quả điện di cho thấy ADN tổng số tách chiết thu được khá sạch, chất lượng
tương đối tốt, các băng thu được khá sắc nét và ít bị đứt gẫy. Do đó, ADN tách chiết
đảm bảo chất lượng để làm khuôn cho phản ứng tiếp theo.
Độ sáng của các băng là khác nhau khá nhiều, có băng rất đậm như giếng 2, có
băng mờ như giếng 3, chứng tỏ hàm lượng ADN có trong sản phẩm tách chiết của các
mẫu khác nhau là khác nhau.
Đối với mẫu máu và mẫu mô u xơ lấy từ cùng một bệnh nhân có thể thấy rằng
lượng ADN tách từ mẫu mô u xơ nhiều hơn ADN tách từ mẫu máu.

39. 30
Đối với mẫu mô lân cận u và mẫu mô u lấy từ cùng một bệnh nhân, có thể thấy
rằng lượng ADN tách từ mẫu mô u nhiều hơn ADN tách từ mẫu mô lân cận u, dù lượng
mẫu ban đầu dùng để tách là tương đương. Điều này có thể do ở mẫu bệnh, phần khối u
có sự tăng sinh của tế bào nhiều hơn nên có lượng vật chất di truyền lớn hơn, do đó, cùng
một khối lượng mô đem tách ADN lại thu được lượng ADN ở mẫu bệnh nhiều hơn.
3.2. THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI
3.2.1. Kết quả phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp
Chúng tôi tiến hành phân tích HPLC với các cặp ADN chuẩn 100_400bp và
200_400 bp để đánh giá sự phân tách của cột và thu được kết quả ở Hình 6
Hình 6 - Kết quả phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và 200_400bp
A- ADN chuẩn 100_400bp; B- ADN chuẩn 200_400bp
Qua kết quả trên cho thấy ADN chuẩn 100_400bp phân tách đỉnh rõ ràng,
ADN chuẩn 200_400bp có tách đỉnh nhưng bị chung nhau phần chân. Để dễ dàng
cho việc phân tích định lượng thì phân tích ADN chuẩn 100bp_400bp sẽ cho kết
quả chính xác hơn.
Do đó chúng tôi thiết kế các cặp primer cho sản phẩm là các đoạn ADN có
kích thước khoảng 100bp và 400bp.

40. 31
3.2.2. Kết quả thiết kế các cặp primer
Sử dụng phần mềm Primer-BLAST và các trình tự tham khảo NCBI, kết hợp
với kết quả phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100bp, 200bp và 400bp ở trên,
chúng tôi đã thiết kế hai cặp primer cho sản phẩm đoạn gen mt là 433 bp và đoạn
gen ACTB là 107 bp có các trình tự như sau:
- Primer mt (kích thước sản phẩm 433 bp)
 Mồi xuôi mt-F: 5’- GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC - 3’
 Mồi ngược mt-R: 5’- GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG- 3’
- Primer ACTB (kích thước sản phẩm 107 bp)
 Mồi xuôi ACTB-F: 5’- ACG GCA GAA GAG AGA ACC A - 3’
 Mồi ngược ACTB-R: 5’- GAG AAG ATG ACC CAG GTG AGT - 3’
Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen ti thể mt-ND1
kích thước tương đương 433bp (mt) và đoạn gen nhân β-actin 107bp (ACTB). Sản
phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,7% (Hình 7)
Tiếp tục tiến hành PCR đa mồi hai đoạn mt và ACTB chúng tôi đã thu được
sản phẩm PCR có hai băng tương ứng. Sản phẩm được kiểm tra trên gel 1.7%
(giếng 4 Hình 7)
Hình 7- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn mt và ACTB trên gel agarose 1,7%
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp; giếng 2: sản phẩm PCR đoạn gen ACTB kích thước
khoảng 107 bp
Giếng 3: sản phẩm PCR đoạn gen mt kích thước khoảng 433bp;
Giếng 4: sản phẩm PCR đa mồi gen ACTB và mt.

41. 32
Từ kết quả PCR đa mồi, hai băng mt và ACTB thu được sáng và rõ ràng, chúng
tôi quyết định sử dụng cặp băng trên để tiến hành quá trình định lượng mtADN.
3.2.3. Kết quả nhân dòng và giải trình tự
Tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung
ampicillin để qua đêm ở tủ ấm 37o
C. Những tế bào biến nạp thành công (có chứa
plasmid) sẽ phát triển và mọc thành khuẩn lạc, những tế bào không chứa plasmid sẽ
chết và không phát triển. (Hình 10)
Hình 10- Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α.
Đĩa 1 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen mt, đĩa 2 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen ACTB
Các đĩa đều mọc khuẩn lạc, chứng tỏ biến nạp đã thành công, các khuẩn lạc
tròn rõ ràng, không có dấu hiệu nhiễm.
3.2.3.1. Kết quả tách plasmid
Sau khi kiểm tra khuẩn lạc có chứa đoạn gen mong muốn bằng phương pháp
PCR với cặp mồi ACTB và mt, các tế bào khuẩn lạc đó được muôi cấy với thể tích
5ml để tách plasmid bằng kit QIA prep Miniprep kit. Plamid được điện di trên gel
agarose 0,8% (Hình 11)
Qua hình ảnh điện di ta thấy các băng plasmid tương đối sáng, khá gọn
chứng tỏ hàm lượng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các
thí nghiệm tiếp theo.

42. 33
Hình 11- Hình ảnh điện di sau khi tách plasmid.
Giếng 1 ADN chuẩn 1kb, Giếng 2 plasmid mt, giếng 3 plasmid ACTB
3.2.3.2. Kết quả PCR kiểm tra plasmid tinh sạch
Sau khi tinh sạch, các plasmid được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi ACTB,
mt và PJet. Các cặp mồi ACTB và mt sẽ nhân được các đoạn gen tương ứng khoảng
107bp và 433bp, còn cặp mồi PJet ngoài nhân đoạn gen ACTB và mt mà plasmid
đó chứa còn nhân thêm một đoạn 120bp của vectơ PJet 1.5, đo đó các plasmid chứa
đoạn gen ACTB và mt sẽ có kích thước tương ứng khoảng 227bp và 553 bp. Sản
phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1.7% (Hình 12)
Hình 12- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB.
Giếng 1 ADN chuẩn 100 bp; giếng 2,3 lần lượt là sản phẩm PCR plasmid ACTB với cặp mồi
ACTB và PJet; giếng 4, 5 lần lượt là sản phẩm PCR plasmid mt với cặp mồi ACTB và PJet.

43. 34
Kết quả điện di cho các băng tương ứng với dự đoán, như vậy các plasmid
tinh sạch chứa đúng đoạn gen mong muốn đã biến nạp.
Plasmid tinh sạch được đo nồng độ ADN và chuẩn bị cho việc giải trình tự.
3.2.3.3. Kết quả giải trình tự
Sử dụng phần mềm BioEdit, phần mềm Sequence Scanner 1.0 để phân tích
kết quả giải trình tự. Sau đó sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự thu
được với trình tự ADN chuẩn của ti thể (hình 13) và gen β_actin (hình 14) đã được
công bố trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi đã xác định được kích thước và trình
tự đoạn gen mt và ACTB đúng với đoạn trình tự tham khảo và có kích thước tương
ứng là 433 và 107 bp.
Hình 13- Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt

44. 35
Hình 14- Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB
Các trình tự trên phù hợp với trình tham khảo, như vậy chúng tôi đã thiết kế
được đúng các cặp mồi và nhân được đoạn gen quan tâm nhằm phục vụ mục đích
định lượng số lượng bản sao mtADN.
3.2.4. Tinh sạch ADN
Sử dụng khuôn là các plasmid mang đoạn gen ACTB và mt đã được tinh
sạch, các đoạn gen ACTB và mt được nhân lên bằng PCR với thể tích 100 µl. ADN
được tinh sạch, đo nồng độ ADN bằng máy nanodrop, điều chỉnh để có nồng độ
ADN 50 ng/µl phục vụ cho việc xây dựng đường chuẩn phân tích HPLC.
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO ADN TI THỂ
3.3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi
Tiến hành PCR đa mồi ở các chu kì thứ 25, 28, 30, 35, kiểm tra sản phẩm
bằng gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc (Hình 8).

45. 36
Hình 8- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi ở các chu kì khác nhau trên gel
polyacrylamide 10%, nhuộm bạc.
Giếng 1,2,3,4 và giếng 5,6,7,8:lần lượt là sản phẩm PCR đa mồi gen mt_ACTB ở các chu
kì 20,25,30 và 35 chu kì của hai bệnh nhân ung thư khác nhau.
Qua quan sát các sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở các chu kì trên ta thấy,
ở 20 chu kì chỉ thấy sản phẩm của băng mt, băng ACTB gần như không xuất hiện. ở
30 và 35 chu kì thì sản phẩm gần như đã bão hòa tương đương nhau (không có sự
cách biệt rõ ràng). Trong khoảng 25-30 chu kì, sự thay đổi lượng sản phẩm tăng rõ
ràng, vì vậy, chu kì ở giữa là chu kì 28 được lựa chọn để tiến hành các phản ứng
PCR đa mồi sử dụng trong định lượng.
3.3.2. Kết quả PCR đa mồi
Các mẫu nghiên cứu được tiến hành PCR đa mồi ở chu kì thứ 28 để chuẩn bị
cho các khâu định lượng bằng HPLC và phần mềm ImageJ, sản phẩm được điện di
trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc (Hình 9)

46. 37
Hình 9- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở 28 chu kì của các mẫu
khác nhau.
Giếng 1,2 và 3,4 lần lượt là sản phẩm của mẫu máu và mô bệnh nhân u xơ, giếng 5: thang
chuẩn ADN 100bp; giếng 6, 7 và 8, 9 lần lượt là sản phẩm của mẫu mô lân cận u và mô u
của bệnh nhân ung thư vú.
Các mẫu đều có cả hai băng ở chu kì 28, phù hợp để tiến hành các phân tích
tiếp theo định lượng bằng HPLC và ImageJ.
3.3.3. Kết quả phân tích HPLC
3.3.3.1. Xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn với ADN chuẩn 100bp và 400bp
Các mẫu ADN chuẩn 100bp và 400bp được sử dụng để dựng đường chuẩn.
Các mẫu được phân tích với tỉ số ADN chuẩn 400bp/100bp theo hàm lượng ADN
khác nhau. Các mẫu được chạy 2 lần và thu được kết quả phân tích HPLC theo tỷ số
diện tích đỉnh trung bình (Bảng 6)

47. 38
Bảng 6- Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lượng ADN chuẩn
400bp/100bp khác nhau
Tỉ số hàm lượng
ADN 400bp/100bp
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1
Tỷ số diện tích đỉnh
ADN 400bp/100bp
0,096 0,302 0,488 0,683 0,891 0.985
Tỉ số hàm lượng
ADN 400bp/100bp
2 3 4 5 6
Tỷ số diện tích đỉnh
ADN 400bp/100bp
2,037 3,062 4,153 5,113 6,102
A B
Hình 15- Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm lượng ADN
chuẩn 400bp/100bp
A- Hình ảnh phân tích HPLC với tỉ số hàm lượng ADN 400bp/100bp 0.1; 0,3; 0,7; 1; 3; 6
B- Biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm lượng ADN mt/ACTB
Từ kết quả xây dựng đường chuẩn với ADN chuẩn 100bp và 400 bp cho thấy
đã thu được 1 đường thẳng tuyến tính về sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích đỉnh
400b/100bp vào tỷ số hàm lượng ADN chuẩn tương ứng. Hệ số tương quan tuyến
tính cao (R2
= 0,9998). Như vậy, với tỷ số hàm lượng ADN 400bp/100bp biến đổi

48. 39
từ 0,1 đến 6,0 là phù hợp cho phân tích định lượng ADN ti thể. Điều này chứng tỏ,
phương pháp HPLC đủ nhạy để sử dụng định lượng ADN với lượng mẫu nhỏ và
nồng độ ADN tương đối thấp, thu được kết quả có độ chính xác cao.
Đường chuẩn với băng mt/ACTB tinh sạch
Các mẫu ADN tinh sạch ACTB và mt được sử dụng để dựng đường chuẩn.
Các mẫu được phân tích với tỉ số mt/ACTB theo hàm lượng ADN lần lượt là 1; 0,5;
0,25; 0,125 và 0,0625. Các mẫu được phân tích 3 lần và thu được kết quả phân tích
HPLC theo tỷ số diện tích đỉnh trung bình (Bảng 7)
Bảng 7 - Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lượng mt/ACTB khác nhau
Tỉ số hàm lượng
mt/ACTB
1 0,5 0,25 0,125 0,0625
Tỷ số diện tích đỉnh
mt/ACTB
0.99 0.497 0.246 0.124 0
A B
Hình 16 - Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ tỉ số mt/ACTB.
A- Hình ảnh phân tích HPLC với các tỉ số hàm lượng mt/ACTB khác nhau
B- Biểu đồ đường chuẩn tỉ số mt/ACTB
Dựa trên hình ảnh thu được sau khi phân tích HPLC ta có thể thấy được hai
đỉnh của ADN chuẩn được rửa giải khỏi cột với thời gian lưu khoảng giữa 35,5 - 37

49. 40
phút. Mặt khác, khi phân tích với các tỉ số mt/ACTB khác nhau, diện tích các đỉnh
thu được khác nhau, ta thấy đỉnh thứ hai giảm rõ ràng về diện tích, như vậy có thể
khẳng định được đỉnh 1 có thời gian lưu sớm hơn là đỉnh của băng ACTB và đỉnh
thứ hai có thời gian lưu muộn hơn là đỉnh của băng mt.
Qua biểu đồ trên ta thấy với các mẫu có tỉ số băng mt/ACTB về lượng khác
nhau cho các kết quả rất tương ứng sau khi phân tích HPLC. Với tỉ số mt/ACTB là
1/16 tương ứng mẫu lên cột có 3,125 ng mt/50ng ACTB thì không phân biệt được
đỉnh của băng mt so với đường nền. Với tỉ số 1/8 tương ứng mẫu lên cột có chứa
6,25 ng mt/50ng ACTB thì tỉ số về lượng ADN và tỉ số diện tích đỉnh của mt/ACTB
đã tương ứng với nhau. Như vậy với lượng ADN tối thiểu của mỗi băng chứa trong
mẫu khi lên cột là 6,25 ng đã cho phép phân biệt được với đường nền và cho kết
quả tốt để định lượng. Đường chuẩn thu được dạng tuyến tính với hệ số tương quan
cao (R2
= 0,9961).
3.3.3.2. Phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN và
đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú
Chúng tôi đã tiến hành phân tích HPLC với các mẫu của 46 bệnh nhân nhân
ung thư vú và 20 mẫu bệnh nhân u xơ vú. Trong đó có 46 mẫu mô u và lân cận u
của bệnh nhân ung thư vú, 20 mẫu mô và 19 mẫu máu của bệnh nhân u xơ vú. Các
biến đổi số lượng bản sao mtADN (giá trị tương đối) được xem xét dựa trên tỉ số
mt/ACTB của các mẫu và phân tích mối liên quan với các đặc điểm bệnh học.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo loại mẫu
Xem xét trên hai đối tượng bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân u xơ vú, về
phương diện loại mẫu chúng tôi thu được kết quả ở bảng 8.

50. 41
Bảng 8. Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú và bệnh
nhân u xơ vú
Loại mẫu Số lượng Trung bình tỉ số mt/ACTB P
Mô lân cận u
Mô u
46
46
3,6
2,6
0,0096
Mô u
Mô u xơ
46
20
2,6
2,5
0,245
Mô u xơ
Máu
20
19
2,5
3,1
0,11621
Chú thích: Kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney (giá trị P).
Hình 17- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình ở các loại mẫu.
Bằng cách sử dụng phương pháp kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho
từng cặp nhóm mẫu ở bệnh nhân ung thư và bệnh nhân u xơ vú. Chúng tôi thấy ở
bệnh nhân ung thư vú, ở mẫu mô u có hiện tượng số lượng bản sao mtADN giảm
(tỉ số mt/ACTB) so với các mẫu lân cận u, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với
với p = 0,0096 < 0,05. Như vậy, hiện tượng giảm số lượng bản sao mtADN có thể
liên quan đến sự hình thành khối u ở bệnh nhân ung thư, có thể sự suy giảm số
lượng bản sao này đã ảnh hưởng đến chức năng điều hòa quá trình apoptosis, giúp
các tế bào đột biến gây ung thư thoát khỏi chết theo chương trình để trở thành tế bào
bất tử.

51. 42
Ở bệnh nhân u xơ vú, số lượng bản sao mtADN ở các mẫu mô u xơ có xu
hướng giảm so với máu, tuy nhiên sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Giữa mẫu mô u ung thư và mẫu mô u xơ, số lượng bản sao mtADN không có
sự sai khác rõ rệt với giá trị trung bình tỉ số mt/ACTB tương đương nhau (p > 0,05).
Biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú
Tiến hành phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN
với các đặc điểm bệnh học của các bệnh nhân ung thư vú, chúng tôi thu được kết
quả ở bảng 9.
Bảng 9. Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư vú
Đặc điểm Số lượng Trung bình tỉ số mt/ACTB P
Tuổi <50
≥50
21
25
3,0
2,4
0,028
Độ biệt hóa
Rõ
Vừa
Kém
2
25
10
1,81
3,42
3,34
0,108*
Kích thước khối u
< 5cm
≥ 5cm
24
22
2,0
3,3
0,000125
Mức độ xâm lấn
của khối u (T)
T1,2
T3,4
35
10
2,66
2,65
0,361
Hạch di căn (N)
N0
N1,2
21
24
2,45
2,83
0,1225
Giai đoạn bệnh
I
II
III
18
3
24
2,45
2,31
2,85
0,507*
Chú thích: Giai đoạn I: T1,2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0;
kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis (*
) (giá trị P).

52. 43
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo nhóm tuổi bệnh nhân
Ung thư vú có liên quan đến sự thay đổi hormon trong cơ thể phụ nữ, vì vậy,
chúng tôi chia bệnh nhân theo 2 nhóm tuổi: dưới 50 tuổi và từ 50 tuổi trở lên (giai
đoạn mãn kinh). Trong đó có 21 bệnh nhân <50 và 25 bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên,
Kết quả phân tích thu được trong bảng 9, Hình 18
Hình 18- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo nhóm tuổi ở bệnh
nhân ung thư vú
Kết quả ở bảng và hình trên cho thấy số lượng bản sao mtADN ở nhóm bệnh
nhân từ 50 tuổi trở lên giảm so với nhóm dưới 50 tuổi, sự sai khác này có ý nghĩa
thống kê với p = 0,028 <0,05.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo kích thước khối u
Chúng tôi chia bệnh nhân thành hai nhóm tương ứng với cách chia của nhiều
nghiên cứu trước đây ở bệnh nhân ung thư vú, nhóm có kích thước khối u < 5cm và
nhóm có kích thước khối u ≥ 5 cm và thu được kết quả như bảng 3.6.6.2 (Hình 19).
Ở các mẫu của các bệnh nhân có kích thươc khối u lớn hơn, có tỉ số
mt/ACTB lớn hơn so với các bệnh nhân có khối u < 5cm, như vậy có sự biến đổi số
lượng bản sao mtADN tăng ở các bệnh nhân có khối u ≥ 5cm, đây là biến đổi có ý
nghĩa thống kê với p = 0,000125 <0,05.

53. 44
Hình 19- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo kích thước khối u ở bệnh
nhân ung thư vú.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn,
hạch di căn và giai đoạn bệnh
Chúng tôi đã xem xét sự biến đổi số lượng bản sao mtADN trên nhiều khía
cạnh như theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh
và thu được kết quả trong bảng 9.
Về mức độ biệt hóa, tuy có sự sai khác lớn giữa nhóm biệt hóa rõ và hai
nhóm biệt hóa vừa và kém, số lượng bản sao mtADN có xu hướng giảm ở nhóm
biệt hóa rõ, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p >0,05).
Với mức độ xâm lấn của khối u, các nhóm có sự sai khác không đáng kể, với
tỉ số mt/ACTB trung bình là 2,66 và 2,65, sự sai khác này không có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05).
Về số hạch di căn, nhóm có hạch di căn (nhóm N1,2) có xu hướng biến đổi số
lương bản sao mtADN tăng so với nhóm không có hạch di căn, tuy nhiên sự sai
khác này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Xét chung giai đoạn bệnh, giai đoạn I, II của bệnh có số lượng bản sao
mtADN tương đương nhau, giai đoạn III có xu hướng biến đổi tăng so với hai giai
đoạn đầu, tuy nhiên sự sai khác này cũng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

54. 45
Qua kết quả phân tích sự biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung
thư vú và bệnh nhân u xơ vú bằng phương pháp HPLC, chúng tôi nhận thấy không
có sự sai khác đáng kể nào ở mẫu máu và mô u xơ ở bệnh nhân u xơ vú, cũng như ở
mẫu u xơ vú và u ung thư, tuy nhiên ở bệnh nhân ung thư vú, có hiện tượng số
lượng bản sao mtADN giảm ở nhóm mẫu u ung thư so với mẫu lân cận u, ở nhóm
tuổi ≥ 50 so với nhóm tuổi < 50, và có hiện tượng tăng số lượng bản sao mtADN ở
nhóm có kích thước khối u lớn ≥ 5cm so với nhóm có kích thước < 5cm, các sai
khác này đều có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Xét trên mức độ biệt hóa, mức độ
xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh, không có sự khác biệt đáng kể nào.
Như vậy sự biến đổi số lượng bản sao mtADN có liên quan đến sự hình thành khối
u, sự phát tiển của khối u và tuổi của bệnh nhân.
3.3.4. Kết quả phân tích phần mềm IMAGEJ
Sau khi điện di, nhuộm bạc và scan các bản gel, ta sử dụng hình ảnh để phân
tích bằng phần mềm Image J. (Hình 20)
Hình 20- Hình ảnh bản gel khi phân tích bằng phầm mềm ImageJ
Khi sử dụng phầm mềm ImageJ khoanh các vùng cần phân tích, phần mềm
sẽ cho ta hình ảnh của các băng biểu diễn qua các đỉnh, dựa vào độ đậm và rộng của
các băng. Đánh dấu vùng cần tính diện tích ta có thể dễ dàng tính diện tích các đỉnh.
Từ đó có thể thu được số liệu để đánh giá biến đổi số lượng bản sao ở mỗi mẫu.

55. 46
Đối chiếu kết quả tỉ số mt/ACTB của các mẫu khi phân tích bằng HPLC và
phân tích bằng phần mềm ImageJ không sai lệch nhiều, các mẫu tăng giảm đều cho
kết quả tương ứng (số liệu được cung cấp đầy đủ ở phần phụ lục).
3.3.4.1. Phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN và
đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú và u xơ vú từ các kết quả phân tích
bằng phần mềm ImageJ
Tương ứng với các mẫu phân tích HPLC, chúng tôi tiến hành phân tích song
song bằng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ với 46 bệnh nhân nhân ung thư vú
và 20 mẫu bệnh nhân u xơ vú. Trong đó có 46 mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân
ung thư vú, 20 mẫu mô và 19 mẫu máu của bệnh nhân u xơ vú. Các biến đổi số
lượng bản sao mtADN được xem xét dựa trên tỉ số mt/ACTB của các mẫu và so
sánh với nhiều đặc điểm bệnh học.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo loại mẫu
Xem xét trên hai đối tượng bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân u xơ vú, về
phương diện loại mẫu chúng tôi thu được kết quả ở bảng 10.
Bảng 10. Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú và bệnh
nhân u xơ vú bằng phương pháp ImageJ
Loại mẫu Số lượng
Trung bình tỉ số
mt/ACTB
P
Mô lân cận u
Mô u
46
46
3,4
2,7
0,058
Mô u
Mô u xơ
46
20
2,7
2,48
0,131
Mô u xơ
Máu
20
19
2,48
3,1
0,595
Chú thích: Kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney (giá trị P).
Bằng cách sử dụng phương pháp kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho
từng cặp nhóm mẫu ở bệnh nhân ung thư và bệnh nhân u xơ vú. Ở kết quả phân tích
bằng phần mềm ImageJ, các số liệu cho thấy xu hướng tương ứng với phân tích
bằng phương pháp HPLC (tương ứng về hiện tượng tăng giảm) (Hình 17 và Hình

56. 47
21). Ở bệnh nhân u xơ vú, số lượng mtADN ở các mẫu mô u có xu hướng giảm so
với máu, tuy nhiên sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Giữa mẫu
mô u ung thư và mẫu mô u xơ, số lượng bản sao mtADN không có sự sai khác rõ
rệt với giá trị trung bình tỉ số mt/ACTB tương đương nhau (p > 0,05). Ở bệnh nhân
ung thư vú, mẫu mô u có xu hướng số lượng bản sao mtADN giảm so với các mẫu
lân cận u, tuy nhiên, sự sai khác này mặc dù không có ý nghĩa thống kê với p<0.05
nhưng giá trị p cũng nhỏ (p=0,058). Kết quả này sai khác một chút so với kết quả
phân tích bằng phương pháp HPLC. Như vậy, phương pháp ImageJ có thể sử dụng
để nhận biết xu hướng biến đổi số lượng bản sao ở các mẫu nhưng không cho độ
chính xác cao như phương pháp HPLC.
Hình 21- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo loại mẫu phân tích bằng
phương pháp ImageJ.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú
Tiến hành phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN
với các đặc điểm bệnh học của các bệnh nhân ung thư vú đựa trên các số liệu thu
được bằng phương pháp phân tích ImageJ, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 11.
Bảng 11. Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư vú phân
tích bằng phương pháp ImageJ
Đặc điểm Số lượng
Trung bình tỉ số
mt/ACTB
P

57. 48
Tuổi <50
≥50
21
25
2,9
2,4
0.0427
Độ biệt hóa
Rõ
Vừa
Kém
2
25
10
1,85
2,98
2,81
0.336*
Kích thước khối
u
< 5cm
≥ 5cm
24
22
2,18
3,24
0.000246
Mức độ xâm lấn
của khối u (T)
T1,2
T3,4
35
10
2,74
2,6
0,341
Hạch di căn (N)
N0
N1,2
21
24
2,67
2,75
0,468
Giai đoạn bệnh
I
II
III
18
3
24
2,73
2,3
2,75
0,677*
Chú thích: Giai đoạn I: T2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0;
kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis (*
) (giá trị P).
Tương ứng với các kết quả phân tích bằng phương pháp HPLC, chúng tôi thu
được kết quả phân tích bằng ImageJ ở bệnh nhân ung thư vú. Biến đổi số lượng bản
sao có liên quan đến nhóm tuổi và kích thước khối u. Cụ thể là có hiện tượng giảm
số lượng bản sao mtADN ở nhóm tuổi từ 50 trở lên so với nhóm dưới 50 tuổi (p <
0,05) và hiện tượng tăng số lượng bản sao ở nhóm có kích thước khối u lớn hơn
5cm so với nhóm có kích thước khối u nhỏ hơn 5cm (p < 0,05).
Ở các khía cạnh khác như theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn
và theo giai đoạn bệnh, kết quả thu được cũng theo chiều hướng tương tự với kết
quả phân tích HPLC. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm
theo đặc điểm bệnh học (p > 0,05).
Qua so sánh giữa 2 phương pháp phân tích bằng HPLC và ImageJ, kết quả
phân tích mặc dù có sai khác nhưng vẫn tuân theo cùng xu hướng biến đổi (ví dụ, tỉ
số mt/ACTB của mẫu mô lân cận u cao hơn so với mẫu mô u, của máu cao hơn mô
u xơ , của nhóm tuổi trên 50 thấp hơn nhóm dưới 50, …).

58. 49
Như vậy có thể thấy, mặc dù phương pháp phân tích ImageJ không cho kết
quả chính xác bằng HPLC, tuy nhiên, phương pháp này có ưu điểm là phương pháp
đơn giản, cho kết quả nhanh, chi phí rất thấp. Vì vậy, có thể kết hợp phương pháp
sử dụng ImageJ với HPLC hoặc PCR định lượng để đánh giá số bản sao mtADN.
Phương pháp này thích hợp để áp dụng ở các cơ sở không được trang bị các thiết bị
đắt tiền như HPLC hoặc thiết bị PCR định lượng.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích trên 46 bệnh nhân
ung thư vú và 20 bệnh nhân u xơ vú để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao
mtADN. Kết quả của chúng tôi cho thấy ở bệnh nhân ung thư vú, số lượng bản sao
mtDNA trong mô u thấp hơn đáng kể so với mô lân cận u tương ứng. Chứng tỏ rằng
biến đổi số lượng bản sao mtADN có thể dẫn đến một khiếm khuyết chức năng ti
thể dẫn đến hình thành khối u ác tính. Số bản sao mtADN giảm trong mô u so với
mô lân cận u cũng được tìm thấy trong bệnh ung thư biểu mô gan [38], bệnh ung
thư dạ dày [33]. Bên cạnh đó, giảm số lượng bản sao mtADN có liên quan với
nhóm tuổi của các bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên. Kết quả này phù hợp với các quan
sát trước đây trên thế giới như trong nghiên cứu năm 2007 của Yu và cs, trong 59
trường hợp bệnh nhân ung thư vú có 46 (78%) mẫu có hiện tượng giảm số lượng
bản sao mtADN trong mô u so mô lân cận u tương ứng, hiện tượng này cũng thấy
xuất hiện thường xuyên hơn ở nhóm cao tuổi ≥ 50 tuổi (63%) so với nhóm tuổi < 50
(33%) [39]. Tuy nhiên, nghiên cứu trên các bệnh nhân ung thư vú người Trung
Quốc, Xia và cs (2009) lại không tìm thấy mối liên quan giữa số bản sao ADN ti thể
với nhóm tuối của bệnh nhân [35].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi còn tìm thấy số lượng bản sao mtADN tăng
ở nhóm có kích thước khối u từ 5cm trở lên so với nhóm có kích thước khối u nhỏ
hơn 5cm. Như vậy, ngược với quá trình hình thành khối u, sự giảm số lượng bản
sao ADN có thể dẫn đến khiếm khuyết chức năng trong quá trình trao đổi năng
lượng, ảnh hưởng đến hoạt động hô hấp của tế bào, hay thay đổi chức năng trong
quá trình apoptosis...dẫn đến việc hình thành các tế bào đột biến và cho chúng khả
năng bất tử trở thành các khối u ác tính thì việc tiến triển của các khối u có thể đòi
hỏi nhiều năng lượng hơn để đáp ứng nhu cầu của những tế bào tăng sinh vô hạn,
dẫn đến việc tăng số lượng bản sao mtADN.