1. đ
nđ
.
-
– ELISA),
nucleic acid lai (NAH),
.
,
tra
,
.
.
:
i) )
ii)
iii)

2. iv)
,a
- -
A.
1.
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ngụ ý rằng có một loại enzyme dựa trên
phản ứng khuếch đại trong khảo nghiệm. các
'phản ứng dây chuyền' là thuật ngữ chỉ một số chu kỳ sao chép một đoạn quy
định của DNA, trong trường hợp này từ bộ gen
của một tác nhân gây bệnh. Khu vực để được khuếch đại được xác định bởi hai
(hoặc hơn) các chuỗi nucleotide ngắn, gọi là
sơn lót các trang web sườn chuỗi mục tiêu. Mồi, ngắn oligonucleotide bổ sung
của lớp sơn lót
các trang web, liên kết với các sợi DNA được sao chép. Sử dụng một
polymerase, đó không phải là denatured trong quá trình đi xe đạp nhiệt, nó là
có thể sao chép chuỗi mục tiêu bằng cách tham gia các nucleotide miễn phí để
mồi. Bằng cách lặp lại nhiệt đi thời gianchế độ20-40, số lượngsao
chépDNAmục tiêutăngtheo cấp số nhân, sản xuất đủđể tiếp tục
hoạt động, chẳng hạn nhưnhân bản,pháthiệnhoặctrình tự. Độ
nhạychẩnđoáncủaPCRlà rất caobởivì
vài triệubảnsaocủamục tiêuđượclựachọnđược sản xuất.Độ đặc hiệucũng có thể
làrất cao,được xác định bởi
các trình tựnucleotidecụ thểcủamục tiêuđượclựachọn, cũng như thiếtkếmồi.
Mồicóthểđược thiết kế để
phát hiệnrất cụ thểtrình tự nucleotidetrong bộ gencủamục tiêu lựa chọncác đại
lýtruyền nhiễm, hoặc có thể được
được thiếtkếđểbổ sung chocácvùng bảo tồnhơn, dođóchophéppháthiệncủa các
thành viêntrongmột gia đình hoặc
chi của tác nhân gây bệnh. Một tổng quanchi tiết hơn vềcáckỹ thuật phân tửđã
được xuất bản(17)

3. a)
b) )
.
c)
2.

4. 'PCR thông thường (hoặc đơn giản là PCR) sử dụng một cặp mồi
oligonucleotide để khuếch đại một phần nhỏ của bộ gen của
các tác nhân gây bệnh.
Southern blotting ,
3.
. Tuy nhiê
4.
Real-time PCR khác vớitiêu chuẩnPCR, ởđâycácsản phẩm PCRkhuếch đạiđược
phát hiệntrựctiếptrong
khuếch đại chu kỳ, bằng cách sử dụng cácthiết bị thăm dòlai, trong đó tăng
cườngđặckhảo nghiệm. Phươngphápthời gianthực khác nhau, chẳng hạn
TaqMan, Scorpion sơn lót,chuyển giaonăng lượngcộng hưởnghuỳnh
quang(FRET), chuyển giao năng lượngPrimer-Probe(PriProET), SybrGreen, Light-
Upon-eXtension (LUX)vàcácxét nghiệmBeaconcácphân tửđãtrở nên phổ biến
công cụ để pháthiệncáctác nhân lây nhiễm. Real-time PCR đã được sử
dụngchoviệc phát hiện cácvi khuẩn, virushoặc
ký sinh trùng từmột loạt cácloài động vật(2-4, 14, 17). Nhữngxét
nghiệmnàycónhiều lợi thế hơn'cổ điển'

5. thông thường hay phương phápPCRlồng nhau. Nói chung,chỉ có mộtcặp mồiđược
sử dụng,cungcấpđộ nhạy cảmthườnggần hoặc
bằng truyền thốnglồng nhauPCRnhưngvới nguy cơô nhiễmthấp hơn nhiều. Huỳnh
quang,cho thấy
sự hiện diện của sản phẩmkhuếch đại, được đo thông quanắpbên củabình phản
ứng, do đó không có nhu cầu
-PCR xử lýDNAkhuếch đại. Những thủ tục nàyít hơn đáng kểthời gianso
với truyền thốngkhuếch đạisauphát hiện sản phẩmPCRtrongagarose geltiếp
theoethidiumbromidehoặc
DNA phát hiệntươngđươngvết bẩn vàmột lần nữa,nguy cơ ô nhiễmgiảm.Việc sử
dụngmộtmicrotitre96-giếng
tấm định dạng,màkhôngcósự cần thiết choPCRlồng nhau, chophépcác thủ tục
đểđược tự độngvà phù hợp vớiquy mô lớn
thử nghiệm (10,17). Chẩn đoáncó thểđược tiếp tụctựđộngbằng cách sử
dụngrobotchoDNA /RNAnhổvàpipetting.
So với các phương phápkhuếch đạicổ điển, mộtlợi thế hơn nữacủaPCRthời gian
thựclà nócó thể
thực hiệncácxét nghiệmđịnh lượng(6,7). Sửdụngthời gian thựcPCR, thời
gianchẩnđoáncóthểđược rút ngắntừ vài giờ đến
phút. Real-time PCR cũng có thểđược sử dụngchophiên
mãngượcPCRbằngcáchsửdụnggiaothứcmột bước, vì thế cho phép
bước RT-PCR sẽ diễn ratrongcùngmộtốngPCRtrongcùngmộtgiao thức(17).
5. PCR
PCR sử dụng các mồi nhiều hướng vào các mục tiêu khác nhau trong một thử
nghiệm duy nhất được gọi là xét nghiệm PCR .
TrongPCR , các truyền nhiễm khác nhau có thể được phát
hiện và phân biệt trong một bình phản ứng duy nhất tạicùng một thời gian. Các
chỉ tiêu PCR khác nhautrong một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn được
xác định dựa trên sản phẩm PCR
kích thước. Việc sử dụng các phương pháp cổ điển PCR lồng nhau để xây dựng
một nghiệm phức tạp bởicần cho mục của các kích cỡ khác
nhau, cũng như mồi có thể "cạnh tranh" với nhau trong cùng một hỗn hợp phản
ứng,cả hai đều có thể tác động tiêu cực hiệu quả PCR. Ngược lại, các khái
niệm về PCR (cặp mồi duy nhất)cung cấp khả năng tuyệt vời cho
việc xây dựng các hệ thống ghép kênh có độ nhạy cao (4, 9) dựa trên nhiều
Kích thước thống nhất mục tiêu, điều kiện khuếch đại thống nhất, và phát hiện
khác biệt giữa các mục tiêu sử dụng cụ thể
đầu dò lai dán nhãn với fluorophore khác nhau. Nó cũng cần được lưu ý rằng
mồi thông thường có thể được sử dụng
để khuếch đại các vùng cụ thể của bộ gen của một nhóm các tác nhân gây bệnh

6. và thăm dò fluorogenic (TaqMan) sau đó có thể được
sử dụng để phân biệt đối xử giữa các thành viên của nhóm. Đây không phải là
nghiêm multiplex PCR mặc dù nó có thể
nhầm lẫn được mô tả như vậy.
6.
,
-
B.
.D
1.1.4
C. Hợp thức xét nghiệm
Xác nhận khảo nghiệm - GIỚI Thiệu

7. 1. Lựa chọn phù hợp của khảo nghiệm đối với mục đích của nó
Sự thích hợp của những xét nghiệm PCR cho các mục đích khác nhau rất rộng. Nơi
nào có nhu cầu cho phát hiện trực tiếp của một tác nhân gây bệnh, nói chung có thể
sử dụng PCR. Trong những năm đầu tiên của phát triển chuẩn đoán PCR, nhiều
phòng thí nghiệm đã có vấn đề với ô nhiễm và sự sử dụng, do đó PCR đã có danh
tiếng khiêm tốn như là một kỹ thuật thích hợp để sử dụng chẩn đoán. Thành tựu
trong những năm gần đây đã đảo ngược quan điểm đó. Công nghệ mới (tức là real-
time PCR) đã thực hiện các kỹ thuật ít tạo ra các kết quả sai gây ra do ô nhiễm và
dễ dàng hơn để sử dụng. Hơn nữa, tự động hoá việc khai thác và pipet thủ tục sử
dụng robot đã có những giảm chi phí, nâng cao khả năng lặp lại và giảm tải công
việc yêu cầu. Trong nhiều năm đầu thử nghiệm trong nhà được phát triển hài hòa,
và xác nhận người nghèo hoặc không tồn tại. OIE, National Laboratories và Cộng
đồng châu Âu Reference Laboratories (ECRLs) có một vai trò quan trọng trong
việc thúc đẩy các công việc xác nhận và hài hòa về phía trước. Nó là công bằng để
nói rằng PCR, nó được thực hiện ngày hôm nay, là an toàn (thấp hơn đáng kể nguy
cơ kết quả dương tính giả), thường được xác nhận trong một số hình thức và phù
hợp cho các mục đích dự định của nó. Một số ví dụ cụ thể về tầm quan trọng của
PCR được đưa ra dưới đây, định nghĩa của mục đích (s) có thể được tìm thấy trong
Chương 1.1.4.
• Để chẩn đoán nhiễm trùng khi mức độ kháng thể như vậy là thấp rằng việc tiếp
xúc trước không thể được khẳng định bằng xét nghiệm kháng thể (ví dụ như
enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA] lặp đi lặp lại trong "vùng xám"
trong các chương trình xoá bò bệnh bạch cầu).
• Để phân biệt giữa nhiễm trùng và khả năng miễn dịch mẹ ở động vật trẻ (ví dụ
như bê trẻ trong chương trình xóa).
• Để phát hiện virus hoặc vi khuẩn acid nucleic khi mẫu chẩn đoán không phải là
thích hợp cho việc phân lập virus do độc tính (ví dụ như tinh dịch, kỳ thi xác ướp
của thai nhi).

8. • Trong giai đoạn cuối của chương trình xoá, khi điều tra kỹ lưỡng các trường hợp
duy nhất là cần thiết (ví dụ như herpesvirus độ trễ và động vật lò phản ứng duy
nhất trong các chương trình diệt trừ bệnh Aujeszky).
• Để phân biệt chủng vaccine từ virus thực địa (DIVA [phân biệt nhiễm từ động vật
chủng ngừa]
phương pháp tiếp cận).
• Để xác định mối quan hệ phát sinh loài của virus và sử dụng thông tin này cho
epizootiology phân tử.
• Để kích hoạt tính năng chẩn đoán nhanh chóng và an toàn đầu tiên trong các tình
huống bùng nổ (ví dụ như năm 2006 dịch cúm gia cầm gây bệnh cao).
• Để xác định tải lượng virus (ví dụ như trong các loại Circovirus lợn 2 nhiễm
trùng).
• Nhanh chóng giám sát động vật chủng ngừa xuất hiện có dấu hiệu lâm sàng.
• Phát hiện đột biến kháng thuốc của các tác nhân gây bệnh, vv
• Để chứng minh quyền tự do nhiễm trùng ở động vật sống hoặc sản phẩm động
vật. Tuy nhiên, nó phải được lưu ý rằng một số động vật bị nhiễm bệnh có thể
không có axit nucleic phát hiện trong các mô được kiểm tra.

9. 2. Cân nhắc phát triển xét nghiệm ban đầu
a) Các cảnh báo và điều khiển
Xem xét sự không chắc chắn về sự an toàn và độ tin cậy của PCR trong chẩn đoán
thường xuyên, biện pháp phòng ngừa đặc biệt nên được áp dụng trong bất kỳ
phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng PCR để phát hiện các tác nhân lây nhiễm để
tránh kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả. Này, cùng với kiểm soát nội bộ (ví
dụ như bắt chước) đảm bảo việc đánh giá an toàn của các kết quả, miễn phí từ các
kết quả dương tính giả gây ra do ô nhiễm. Kiểm soát nội bộ thực sự bằng cách sử
dụng các nhà gen giữ cũng hoàn thành với mục tiêu PCR nhưng chỉ cho thuốc thử
là vượt quá rộng lớn như polymerase và nucleotide. Tối thiểu cạnh tranh ngụ ý
rằng mức độ của mục tiêu thực sự được biết đến, mà không thể là trường hợp cho
các mẫu thực địa. RNA bọc thép cho phép bắt chước được thêm vào trong quá
trình khai thác, mà là một bước tiến trong việc biết rằng việc khai thác đã làm việc.
Một hệ thống kiểm soát nội bộ thực sự cung cấp thêm tự tin rằng khai thác đã được
thực hiện một cách chính xác. Các xuống bên bằng cách sử dụng các gen giữ nhà
như kiểm soát nội bộ là họ có thể có mặt với số lượng lớn hơn các tác nhân gây
bệnh mục tiêu.
b) Các cảnh báo thực hiện để tránh kết quả dương tính giả
Kết quả dương tính giả (mẫu tiêu cực cho thấy một phản ứng tích cực), có thể phát
sinh từ hoặc các vấn đề liên quan đến phòng thí nghiệm, như ô nhiễm chéo, hoặc
các yếu tố liên quan đến khảo nghiệm, như tối ưu hóa không hiệu quả hoặc thực
hiện khảo nghiệm. Sản phẩm thực hiện giao từ mẫu dương tính, hoặc phổ biến hơn,
từ ô nhiễm chéo bởi các sản phẩm PCR từ các thí nghiệm trước đây là một nguồn
có thể của lỗi, và thực hành và các công cụ khác nhau đã được áp dụng để ngăn
chặn các kết quả PCR dương tính giả. Mẫu và thuốc thử nên được xử lý riêng biệt

10. laminar luồng không khí lưu mũ trùm, thường xuyên được khử trùng bằng cách sử
dụng ánh sáng UV (nhu cầu sử dụng ánh sáng UV-bảo dưỡng rất cẩn thận để có
hiệu lực) và thuốc tẩy. Xây dựng và sử dụng các ống đặc biệt chủ sở hữu và cụ mở
cũng có thể giúp ngăn ngừa giả tích cực (2). Ngoài ra, thực hành phòng thí nghiệm
tốt nên được áp dụng, tức là thực hiện các bước cơ bản (chiết xuất DNA, trộn và
chuẩn bị mồi, chuẩn bị mẫu, agarose gel điện di sản phẩm khuếch đại, vv ...) tại
các khu vực phòng thí nghiệm tách hoặc phòng (Hình 1; refs 1 , 4,
17). Bộ khác nhau của ống hút nên được sử dụng cho mỗi bước. Việc sử dụng các
chuyển tích cực và lời khuyên lọc được khuyến khích. Đây cũng là, nếu có thể,
khuyến khích để có người khác nhau thực hiện các bước khác nhau, những người
được giới hạn cho các khu vực phòng thí nghiệm tương ứng. Biện pháp phòng
ngừa cần được thực hiện để ngăn chặn sự ra đời của vật liệu khuếch đại từ các
phòng thí nghiệm có khả năng bị ô nhiễm vào các khu vực phòng thí nghiệm 'sạch'
hạn chế di chuyển trên mẫu, giấy tờ, trang thiết bị, các cá nhân hoặc bất kỳ phương
pháp khác có tiềm năng gây ô nhiễm. Di chuyển theo hướng ngược lại chỉ xảy ra
sau khi khử trùng bề mặt của thiết bị và vv ống và thay đổi áo khoác phòng thí
nghiệm và găng tay. Nếu mẫu dự kiến sẽ có một số tiền cao của đại lý hoặc axit
nucleic mục tiêu, đó là thích hợp hơn để pha loãng trước khi giới thiệu nó vào các
khu vực phòng thí nghiệm 'sạch'
Hình 1. Đê phòng thí nghiệm, chẩn đoán real-time PCR. Các mẫu được phân tích
được chuyển vào phòng thí nghiệm Chuẩn bị cho khai thác của acid nucleic. PCR
kết hợp tổng thể được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm Clean 'và chuyển giao cho'
phòng thí nghiệm Chuẩn bị 'cho phân phát vào tấm PCR và thêm mẫu. Ready-
made ống phản ứng / tấm được sau đó được chuyển vào phòng Thiết bị cho chạy
PCR. Các
'Sạch phòng thí nghiệm được sử dụng chỉ để chuẩn bị PCR chủ kết hợp, không có
DNA hoặc sản phẩm PCR được cho phép trong phòng. Đó là khuyến khích để có
một không khí khóa lối vào phòng thí nghiệm Clean 'để thay đổi vào một chiếc áo
khoác phòng thí nghiệm và giày mà chỉ được sử dụng ở đây. 'Chuẩn bị phòng thí
nghiệm được sử dụng để xử lý mẫu và thiết lập

11. Phản ứng PCR (với tổng thể kết hợp chuẩn bị trong phòng thí nghiệm Clean ').
Không có sản phẩm PCR được trong căn phòng này và không có gì từ phòng thí
nghiệm Chuẩn bị 'trở lại' phòng thí nghiệm Clean '. Thiết bị phòng chứa máy PCR
và không có gì từ phòng này đi trở lại phòng thí nghiệm sạch 'hoặc
'Chuẩn bị phòng thí nghiệm'. Nếu phòng thí nghiệm có một hệ thống kiểm soát
không khí, phòng thí nghiệm sạch sẽ nên được tích cực và tiêu cực khác. Nếu lồng
nhau PCR sẽ được thực hiện, hai phòng nhiều hơn được khuyến khích.
A 'phòng thí nghiệm PCR thứ hai cho việc thiết lập phản ứng PCR thứ hai (mà sẽ
liên quan đến xử lý
Sản phẩm PCR, do đó làm cho nó không thể làm điều này trong phòng thí nghiệm
Chuẩn bị "') và một' Electrophoreses phòng thí nghiệm để phân tích sản phẩm PCR
trong agarose gel.
Nó cũng rất quan trọng bao gồm điều khiển tiêu cực, các mẫu tức là tương tự như
các mẫu thử nghiệm càng tốt, nhưng mà không có mục tiêu. Trong phòng thí
nghiệm gặp vấn đề với ô nhiễm chéo, ít nhất một tiêu cực kiểm soát trên năm mẫu
chẩn đoán đã được khuyến cáo. Mẫu điều khiển cả tích cực và tiêu cực nên thường
xuyên được xen kẽ với các mẫu chẩn đoán để đánh giá hiệu suất xét nghiệm PCR.
c) Các cảnh báo thực hiện để tránh kết quả âm tính giả
PCR đã được chứng minh là một phương pháp rất hiệu quả của phát hiện axit
nucleic, chẳng hạn như bộ gen của virus trong các mẫu lâm sàng. Tuy nhiên, một
con vật bị nhiễm bệnh trong giai đoạn cuối của bệnh có thể không còn có acid
nucleic của virus trong các mô được kiểm tra. Do đó, trong trường hợp như vậy,
các kết quả PCR âm tính nên được coi là một phần của một cuộc kiểm tra chẩn
đoán phức tạp.

12. Kết quả âm tính giả (mẫu có chứa tác nhân quan tâm nhưng thử nghiệm là tiêu
cực) chủ yếu xảy ra do tác dụng ức chế và / hoặc pipetting lỗi, tuy nhiên, các vấn
đề do xử lý mẫu cũng có thể mang lại giả
50 OIE Terrestrial Manual 2008
Chương 1.1.5. - Xác nhận và kiểm soát chất lượng của các phương pháp PCR để
chẩn đoán bệnh truyền nhiễm
kết quả âm tính. Vì vậy, kiểm soát nội bộ có thể được sử dụng như các chỉ số hiệu
quả xét nghiệm PCR. PCR kiểm soát nội bộ có thể bao gồm nước ngoài DNA được
thêm vào với mẫu hay DNA phổ biến tự nhiên trong mẫu. Ngoại DNA mẫu, có thể
bao gồm DNA hoặc RNA bắt chước. Bắt chước DNA, oligonucleotides sản xuất,
có trình tự cùng một mồi ràng buộc như là mục tiêu PCR, nhưng sườn một đoạn
DNA dị của một kích thước khác nhau. Chuỗi nucleotid primer-ràng buộc cho
phép đồng khuếch đại của mục tiêu và bắt chước trong ống cùng với cạnh tranh tối
thiểu. Sự khác biệt kích thước cung cấp phân biệt đối xử dễ dàng phân tích dấu vết
phía Nam. Armored RNA ®, một khái niệm giống hệt nhau để bắt chước DNA, sử
dụng một điều khiển RNA đoạn đóng gói trong protein lông vi khuẩn để bảo vệ
hoặc ổn định RNA để kiểm soát hoặc tiêu chuẩn hóa các xét nghiệm RT-PCR (biết
thêm chi tiết về kiểm soát nội bộ, xem ở trên).
Với xét nghiệm PCR thời gian thực, nó cũng có thể sử dụng hệ thống kiểm soát nội
bộ, giữ nhà một gen tự nhiên, chọn một mảnh của bộ gen của vật chủ như beta-

13. actin, GAPDH, hoặc RNA ribosome. Bằng cách ghép như một điều khiển nội tại
với một fluorophore phóng viên đặc biệt màu, nó có thể kiểm tra chất lượng mẫu
và xác nhận hiệu quả PCR, như là tác nhân mục tiêu và DNA nội tại đồng thời phát
hiện (14).
Kiểm soát nội bộ (ví dụ như 'bắt chước') làm tăng độ tin cậy của chẩn đoán PCR
(1, 4). Phạt cảnh cáo phải được sử dụng khi thiết kế và kiểm tra kiểm soát nội bộ.
Mở rộng thử nghiệm là cần thiết để đảm bảo rằng khuếch đại PCR của kiểm soát
nội bộ tăng không cạnh tranh với PCR chẩn đoán và do đó giảm độ nhạy phân tích.
Kiểm soát nội bộ được sử dụng ở nồng độ cao hơn so với giới hạn phát hiện của
PCR chẩn đoán để đảm bảo hiệu suất của thử nghiệm. Nó cũng nên nhớ rằng kiểm
soát nội bộ có một bất lợi, tương tự như với các mẫu đinh, không phải là đại diện
của acid nucleic mục tiêu và có thể dẫn đến kết quả âm tính giả.
d) Chuẩn bị tiêu chuẩn
Các phòng thí nghiệm tham chiếu nên cung cấp tiêu chuẩn mẫu đại diện của một
tác nhân gây bệnh. Mẫu này có thể trồng được các tác nhân lây nhiễm hoặc các
mẫu lâm sàng, vv, được phân phối trong một cách thức rằng các tác nhân gây bệnh
được bảo tồn tốt. Vì vậy, các mẫu được phân phối đông lạnh, trong các dung môi
hữu cơ (ví dụ như Trizol) hoặc cách thức phù hợp khác. Các mẫu cũng có thể được
gửi như axit nucleic (đông lạnh, đông lạnh khô hoặc ethanol). Để biết chi tiết cụ
thể, xem chương bệnh cá nhân. Tham khảo các phòng thí nghiệm cũng nên cung
cấp bắt chước thích hợp.
Sự sẵn có của mẫu chuẩn là rất quan trọng cho một xác nhận khảo nghiệm thành
công. Thật không may này thường là vấn đề khó giải quyết nhất để giải quyết khi
lập kế hoạch một dự án xác nhận. Nó không phải là đủ để sử dụng các đại lý chỉ
canh tác hoặc các mẫu đinh, mẫu thực sự từ trường có thể có những đặc điểm rất
khác so với những mẫu được tạo ra trong phòng thí nghiệm. Nó có thể chứng minh

14. rất khó khăn để có được các mẫu từ các lĩnh vực mà thực sự tiêu cực hay tích cực,
đặc biệt là PCR thường có độ nhạy cao hơn phân tích hơn so với các phương pháp
của hầu hết các tiêu chuẩn vàng, do đó làm cho nó khó khăn để xác định tình trạng
của các mẫu xác nhận dự định sử dụng đã thành lập thử nghiệm. Như đã đề cập
trước đây, các phòng thí nghiệm tham chiếu có thể là một nguồn tiềm năng cho
mẫu chuẩn đó. Ngoài ra, phương pháp Bayesian cung cấp các phương pháp tiếp
cận xác suất để xác nhận các xét nghiệm chẩn đoán trong trường hợp không có một
tiêu chuẩn vàng (5), nhưng không được tiếp tục thảo luận trong chương này.
D. Định lượng xác nhận - PART 1
1. Tối ưu hóa và tiêu chuẩn hóa các chất phản ứng và xác định các thông số kiểm
soát tới hạn
Bộ sưu tập mẫu, chuẩn bị và vận chuyển (xem Chương 1.1.1 Thu thập và vận
chuyển mẫu vật chẩn đoán) và phương pháp chiết xuất axit nucleic (xem Chương
1.1.7 Công nghệ sinh học trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và phát triển
vắc-xin) là tất cả các thông số quan trọng trong hoạt động kiểm tra và nên được tối
ưu hóa để chẩn đoán bệnh. Phương pháp phù hợp khác nhau tùy thuộc vào mẫu và
loại sinh vật. Nói chung, huyết thanh, các mô cơ thể và các mẫu tăm bông là những
mẫu phù hợp cho khai thác dễ dàng của các axit mục tiêu nucleic, trong khi phân,
vật liệu và mẫu tinh dịch tự phân là khó khăn hơn để xử lý. Khai thác các mục tiêu
RNA khác từ khai thác của các mục tiêu DNA và RNA là dễ bị suy thoái. Cả hai
thương mại (robot, cột quay, nam châm nhổ, vv) và tiêu chuẩn hoá phương pháp
này được sử dụng để chiết xuất DNA hoặc RNA. Điều quan trọng là để xác định
phương pháp chiết xuất tái sản xuất và hiệu quả nhất trước khi tiếp tục xác nhận
khảo nghiệm được thực hiện. Nếu các phương pháp khai thác được thay đổi, dữ
liệu tương đương nên được tạo ra hoặc toàn bộ các thủ tục xác nhận cần phải được
lặp đi lặp lại.

15. Tất cả các thiết bị được sử dụng trong quá trình này phải được duy trì. Thiết bị
(khối sưởi, tủ lạnh, tủ đá, thermocyclers, ống hút, vv) yêu cầu hiệu chuẩn phải
được kiểm tra theo các giao thức đảm bảo chất lượng của phòng thí nghiệm. Nó
cũng quan trọng để xác nhận các thiết bị và giao thức sử dụng đúng cách. Một ví
dụ gần đây là việc thực hiện các phương pháp khai thác robot để chế biến chẩn
đoán thường qui. Nó không phải là
đủ để so sánh các đặc điểm của kỹ thuật này với các phương pháp khai thác sử
dụng trước đó. Các robot và các giao thức phải được xác nhận để xác nhận rằng
không có nguy cơ ô nhiễm chéo, ví dụ như bằng cách chạy một tập hợp các mẫu
hỗn hợp tích cực và tiêu cực.
Khi phát triển 'cổ điển' hoặc xét nghiệm PCR thời gian thực, tất cả các thông số,
các giao thức và các thuốc thử cần phải được tối ưu hóa. Một xét nghiệm tiêu
chuẩn hóa là một phương pháp mà luôn cho cùng một kết quả cho một mẫu nhất
định khi lặp đi lặp lại nhiều lần và khi được thực hiện bởi các nhà phân tích khác
nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau.
Trong quá trình tối ưu hóa của các xét nghiệm PCR, nó cũng có thể để đánh giá
năng lực của các phương pháp để không bị ảnh hưởng bởi những thay đổi nhỏ
trong các thông số chính. Để đạt được một xét nghiệm PCR tối ưu hóa, nó là điều
cần thiết để đánh giá các thông số quan trọng trong việc khảo nghiệm. Ví dụ về các
thông số đó bao gồm: thời gian ủ và nhiệt độ, nồng độ của bộ đệm, sơn lót, MgCl2,
vv, pH, số lượng của các thành phần khác được thêm vào (ví dụ dNTP, albumin
huyết thanh bò, vv ...). Các đặc tính của các thông số kiểm soát quan trọng là rất
quan trọng để xác định điểm quan trọng cần phải được kiểm soát trong khảo
nghiệm. Các biến thể có chủ ý các thông số có thể dẫn đến một biểu hiện mạnh mẽ
khảo nghiệm sơ bộ
E. KHẢO NGHIỆM xác nhận - PHẦN 2

16. Đặc tính hiệu suất (hoặc các thông số khảo nghiệm) cung cấp thông tin về một
chức năng như thế nào phương pháp theo quy định điều kiện. Một số đặc điểm
thực hiện điển hình được đưa ra trong Chương 1.1.4.
Chương 1.1.5. - Xác nhận và kiểm soát chất lượng của các phương pháp PCR để
chẩn đoán bệnh truyền nhiễm
1. Xác định đặc tính hoạt động khảo nghiệm
a) quần thể động vật tham khảo
i) động vật tham khảo tiêu cực
Mẫu âm đúng, mẫu tức là từ động vật chưa từng có tiếp xúc có thể đến các đại lý,
đôi khi có thể khó khăn để có được. Thường thì nó có thể để thu thập mẫu từ các
quốc gia có loại trừ bệnh trong câu hỏi. Điều quan trọng là các mẫu âm tính thu
được là đại diện của các mẫu sẽ được phân tích, ví dụ như loài, tuổi, giới tính,
giống, vv
ii) Tích cực tham chiếu động vật
Nói chung đây là vấn đề để tìm các động vật tham khảo tích cực với số lượng đủ.
Nhiễm tự nhiên hoặc động vật thí nghiệm bị nhiễm là cần thiết và tích cực tình
trạng của họ được chứng minh bằng phân lập của các đại lý. Trước khi sử dụng
động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh, xin vui lòng xem Chương 1.1.4.
iii) tình trạng tham khảo động vật được xác định bởi các xét nghiệm khác. Thuật
ngữ "tiêu chuẩn vàng" thường được dùng để mô tả bất kỳ tiêu chuẩn so sánh và cần
được giới hạn các phương pháp một cách rõ ràng phân loại động vật bị nhiễm bệnh
hoặc không bị nhiễm bệnh. PCR xét nghiệm dự kiến sẽ tốt hơn bất kỳ phương pháp
đã có tiêu chuẩn vàng và do đó thành lập 'Tiêu chuẩn vàng' có thể không phù hợp
để sử dụng như một sự so sánh. Điều này đặc biệt đúng khi chứng minh rằng một
con vật tham khảo tiêu cực thực sự là tiêu cực. Xác nhận của các xét nghiệm phân
tử bằng cách so sánh chúng vào một.Thử nghiệm "tiêu chuẩn vàng" có thể được
phức tạp bằng PCR là nhạy cảm hơn, kết quả rõ rang giảm đặc hiệu. Đến một mức
độ này có thể được giải quyết bằng cách đánh giá mẫu nguồn gốc, lịch sử lâm sang
và trình tự bất kỳ sản phẩm PCR để xác nhận danh tính.

17. 2. Threshold xác định chẩn đoán nhạy cảm (DSE, tỷ trọng của các loài động vật
tham khảo nổi tiếng bị nhiễm xét nghiệm dương tính của xét nghiệm) và đặc hiệu
(DSP, tỷ trọng của các loài động vật tham khảo nổi tiếng không bị nhiễm xét
nghiệm âm tính của xét nghiệm). Số lượng mẫu tài liệu tham khảo cần thiết để xác
định dự toán và các lỗi cho phép của cả hai DSE và DSP có thể được tính toán. Để
làm điều này, một dự đoán hợp lý của cả hai DSE và DSP phải được sử dụng. Nói
chung, sự tự tin trong dự toán đặt ở 95%. Tuy nhiên, không có công thức có thể tài
khoản cho các máy chủ / sinh vật rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả các
kiểm tra. Số lượng các mẫu để xác định ước tính của DSE và DSP được nêu trong
Chương 1.1.4. Đối với một bệnh đó không phải là đặc hữu và lan rộng, nó có thể
khó khăn ban đầu để có được số lượng mẫu để đạt được một thỏa đáng tin cậy,
nhưng qua thời gian, dồn tích của các dữ liệu bổ sung sẽ tăng cường sự tự tin trong
ngưỡng. Việc sử dụng mẫu đinh trong phản ứng PCR là một phương sách cuối
cùng bởi vì các mẫu như vậy có thể không được đại diện một cách tự nhiên bị
nhiễm mẫu. Nếu mẫu từ động vật nhiễm tự nhiên không có sẵn, nhiễm trùng gây ra
bởi có nghĩa là nhiễm trùng bắt chước tự nhiên có thể cung cấp các mẫu hữu ích.
Một ví dụ là tick-borne nhiễm trùng gây ra bởi tiếp xúc với bọ ve bị nhiễm bệnh.
Nó không phải là luôn luôn có thể để phù hợp với hướng dẫn gợi ý (ví dụ như OIE
khuyến nghị về kiểm tra xác nhận). Đối mặt với số lượng thấp của các mẫu cho bài
kiểm tra đánh giá, hoặc cho các bài kiểm tra không có tiêu chuẩn vàng, một trong
những phương pháp tiếp cận là để giới thiệu xét nghiệm phân tử như một phần xác
nhận 'và sau đó thêm dữ liệu xác nhận nếu số lượng đáng kể các mẫu lâm sang thử
nghiệm. Trong hệ thống này, số ca được xác nhận bằng các phương tiện khác,
chẳng hạn như sự cô lập của các tác nhân gây bệnh trong câu hỏi hoặc trình tự, và
một mẫu của âm cũng được xác nhận là phù hợp (không ức chế) cho PCR thử
nghiệm bằng cách sử dụng kiểm soát gen. Nguyên tắc này xác nhận trên cho phép
nhanh chóng giới thiệu thử nghiệm mới và làm giảm chi phíxác nhận. Quá trình
này phải được sử dụng theo các điều kiện quy định. Nó chỉ được áp dụng khi
không có âm thanh bằng chứngthử nghiệm một phạm vi thích hợp của các nền văn
hóa biết, mẫu gai (để cung cấp dữ liệu phân tích) và một số lâm sang
F. KHẢO NGHIỆM xác nhận - Phần 3
1. Xây dựng khả năng tái của khảo nghiệm
2. Độ lặp lại là một tham số quan trọng trong khảo nghiệm chính xác. Độ lặp
lại được xác định trong một số phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng khảo

18. nghiệm giống hệt nhau (giao thức, chất phản ứng và điều khiển). Mỗi phòng
trong ít nhất ba phòng thí nghiệm kiểm tra cùng một bảng điều khiển mẫu
(tối thiểu là 20 mẫu), với phần phân ước giống hệt nhau đi đến phòng thí
nghiệm từng. Nỗ lực này sẽ mang lạ ước tính về độ chắc chắn khảo nghiệm.
Dự toán lặp lại để khảo nghiệm là rất cần thiết trước khi nó có thể được coi
là hợp lệ cho việc triển khai cho các phòng thí nghiệm khác.Hiện nay, khả
năng lặp lại hiếm khi hoàn toàn đánh giá trong phòng thí nghiệm thú y chẩn
đoán thực hiện PCR xét nghiệm. Theo truyền thống, nhiều phòng thí nghiệm
đã được sử dụng thử nghiệm phát triển trong nhà, có lẽ vì lý do thực
tế.Chương 1.1.5. - Xác nhận và kiểm soát chất lượng của các phương pháp
PCR để chẩn đoán bệnh truyền nhiễmKhi có thể, công bố phương pháp tiêu
chuẩn và xác nhận, đặc biệt là các phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE,
ECRLshoặc phòng thí nghiệm quốc gia, cần được theo sau. Ngoài ra quá
trình liên phòng thí nghiệm xác nhận nên được thực ra ngoài. Công việc này
sẽ giúp chuẩn hóa xét nghiệm, cho phép hài hoà hoạt động chẩn đoán ở các
quốc gia khác nhau.
G. KHẢO NGHIỆM xác nhận - PHẦN 4
1. Chương trình thực hiện
Tham khảo các phòng thí nghiệm đóng một vai trò quan trọng trong việc thực hiện
mới hoặc xác nhận xét nghiệm phân tử hiện có. OIE Phòng thí nghiệm tham chiếu
ECRLs và các phòng thí nghiệm quốc gia được khuyến khích để hỗ trợ trong việc
thực hiện các hứa hẹn xét nghiệm mới cho căn bệnh mà họ quan tâm. Một ví dụ là
sự hỗ trợ được cung cấp bởi OIE và CDRL để thực hiện các chẩn đoán phân tử
cúm gia cầm ở châu Âu.
2. Giám sát hiệu lực thực hiện khảo nghiệm
a) Giải thích kết quả kiểm tra các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực khảo nghiệm Một
yếu tố chính ảnh hưởng đến giải thích các kết quả thử nghiệm là sự phổ biến của
các chất phân tích trong mục tiêu dân số. Một xét nghiệm PCR chính xác cao và
chính xác, với ước tính của DSE và DSP tiếp cận 99%, vẫn có thể cung cấp kết
luận sai (xem Chương 1.1.4). Đối với các xét nghiệm acid nucleic, kết quả dương
tính giả quan tâm đặc biệt trong các quần thể có tỉ lệ thấp. Trong trường hợp này,
nó có thể là cần thiết để xác nhận PCR dương tính kết quả phân tích trình tự của

19. sản phẩm khuếch đại để hỗ trợ sửa lỗi do không đặc hiệu mục tiêu hoặc ràng buộc
mồi.
b) Duy trì các tiêu chí xác nhận
Khi khảo nghiệm được sử dụng như một bài kiểm tra thường xuyên, nó là quan
trọng để duy trì QC nội bộ. Khảo nghiệm cần phải được luôn theo dõi để lặp lại và
độ chính xác. Độ lặp lại giữa phòng thí nghiệm (trình độ thử nghiệm) là khuyến
cáo của OIE được hoàn thành ít nhất hai lần một năm (16). Thử nghiệm này
thường là quản lý bởi một phòng thí nghiệm tham chiếu phân phối tấm mẫu, nhận
được kết quả từ các phòng thí nghiệm, phân tích dữ liệu, và báo cáo kết quả lại cho
các phòng thí nghiệm. Nếu khảo nghiệm được áp dụng trong một vùng địa lý và /
hoặc dân số, nó có thể là cần thiết để hợp lệ lại hoặc tài liệu tương đương theo các
điều kiện mới. Tái xác nhận giá trị sử dụng hoặc tương đương nên được xác định,
nếu thử nghiệm áp dụng đối với một ma trận mẫu khác nhau, ví dụ như xác nhận
trên máu và được sử dụng trên mô khác, hoặc xác nhận cho gia súc mô và được sử
dụng trên một loài khác. Giao thức khai thác khác nhau có thể là cần thiết nếu một
loài khác hay mô được kiểm tra, có thể chứa các yếu tố ức chế khác nhau. Điều này
đặc biệt đúng đối với PCR xét nghiệm vì nó rất phổ biến cho các đột biến điểm xảy
ra nhiều tại các đại lý truyền nhiễm (tức là RNA virus).Đột biến, có thể xảy ra
trong lớp sơn lót hoặc các trang web thăm dò, có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của
các khảo nghiệm, làm như vậy, các tiêu chí thực hiện được thành lập không còn giá
trị. Nó cũng khuyến khích thường xuyên xác nhận trình tự mục tiêu tại các vùng
gien được lựa chọn cho phân lập quốc gia hoặc khu vực của các tác nhân gây bệnh.
Điều này đặc biệt đúng đối với các trang web mồi, để đảm bảo rằng họ vẫn ổn định
để xác nhận.khảo nghiệm có thể không được đặt câu hỏi. Xác nhận và dự toán
mạnh mẽ có thể cần phải được lặp đi lặp lại khi các kiểm tra được chuyển từ phòng
thí nghiệm phát triển cho lĩnh vực này là các điều kiện có thể ít hơn tối ưu và nhân
viên ít kinh nghiệm.