Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, cho các bạn làm luận văn tham khảo

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------
LÊ LAN PHƢƠNG
XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH
CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2012

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------
Lê Lan Phƣơng
XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH
CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: CH.60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Trịnh Hồng Thái
Hà Nội - 2012

3. LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, ngƣời thầy
đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học
và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học,
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian
học tập tại Trƣờng.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị học viên và các bạn
sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự
nhiên đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện
luận văn tại Phòng.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm
giúp đỡ của các cán bộ, nhân viên thuộc Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện
K2, Tam Hiệp, Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Luận văn đƣợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số KLEPT-09-02.
Hà Nội, tháng 6 năm 2012
Học viên
Lê Lan Phƣơng

4. MỤC LỤC
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................a
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................d
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................................e
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN..........................................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN...............................................................3
1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát...........................................................3
1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan.............................................................4
1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan..................................................................6
1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan.................................................8
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ..........................9
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ................................................................9
1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ.............................10
1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thƣ gan .........................................11
1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ ................................................................13
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ..........................................................13
1.3.2. Kháng nguyên ung thƣ............................................................................13
1.3.3. Chỉ thị ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch...................................14
1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƢ GAN .................15
1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics ...........................15
1.4.2. Hệ protein gan ngƣời...............................................................................16
1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thƣ gan ......................................17
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................24
2.1. NGUYÊN LIỆU.............................................................................................24
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................24

5. 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................24
2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................25
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................25
2.2.1. Xử lý mẫu mô gan...................................................................................25
2.2.2. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford ....................................27
2.2.3. Điện di hai chiều .....................................................................................27
2.2.4. Western Blot............................................................................................28
2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot ......29
2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều ..............................30
2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein................................................31
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................................33
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN ......................................................33
3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU ......................34
3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều ...................34
3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều ...............36
3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS ......41
3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU...................44
3.4.1. Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp...........................44
3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều ..............................................................46
3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT....47
3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis .................................50
3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể ...................52
3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào..............................................................53
3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất............................................54
3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến ..............55
3.5.6. Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tƣơng.....................................56
KẾT LUẬN...............................................................................................................60

6. KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................62
PHỤ LỤC.................................................................................................................... i
Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân ung thƣ tế bào gan ......................................... i
Phụ lục 2. Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel điện di
hai chiều ............................................................................................................. ii
Phụ lục 3. Kết quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần
mềm Mascot...................................................................................................... vi
Phụ lục 4. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC
......................................................................................................................... viii

7. a
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
α1AT Alpha-1-antitrypsin
ABC Ammonium bicarbonate
AcCN Acetonitrile
ACTB Beta-actin
AFP Alpha fetoprotein
AFB1 Aflatoxin B1
CATD Cathepsin D
CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid
CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
cs Cộng sự
Da Dalton
DTT Dithiothreitol
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
(Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme)
GS Glutamine synthetase
HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)
HBsAg Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm
gan B)
HCC Hepatocellular carcinoma (Ung thƣ tế bào biểu mô gan)
HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)
HLPP Human Liver Proteome Project (Dự án Proteome gan ngƣời)
HPT Haptoglobin
HUPO Human Proteome Organisation (Tổ chức Proteome ngƣời)
HRP Horse - radish peroxidase

8. b
HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)
IAA Iodoacetamide
IEF Isoelectric Focusing (Điện di phân vùng đẳng điện)
IPG Immobilized pH gradient (Gradient pH cố định)
LC-MS/MS Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ)
MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
MFAP3 Microfibrillar-associated protein 3
MHC Mayjor Histocampatibility Complex
(Phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu)
MS Mass spectrometry (Khối phổ)
Mw Molecular weight (Khối lƣợng phân tử)
PBS Phosphate Buffer Saline (Đệm muối phosphate)
PCNA Proliferating cell nuclear antigen
PDIA1 Protein disulfide-isomerase
PDIA3 Protein disulfide-isomerase A3
PMF Peptide Mass Fingerprint (Đặc trƣng khối peptide)
PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride
PVDF Polyvinylidene fluoride
p53 Cellular tumor antigen p53
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(Điện di trên gel polyacrylamide có SDS)
SEREX Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries
(Phân tích huyết thanh bằng thƣ viện biểu hiện cDNA tái tổ hợp)
SODC Superoxide dismutase [Cu-Zn]

9. c
SODM
Mn-SOD
Superoxide dismutase [Mn]
Manganese superoxide dismutase
Spot Điểm protein
ST7L Suppressor of tumorigenicity 7 protein-like
TAA Tumour Associated Antigen
(Kháng nguyên liên quan đến ung thƣ)
TAP Transporters of Antigen Peptide
(Phân tử vận chuyển peptide kháng nguyên)
TFA Trifluoroacetic acid
TNM Tumor Node Metastasis
(Kích thƣớc khối u - Hạch Lympho - Di căn)
TSA Tissue Specific Antigen (Kháng nguyên đặc hiệu mô)
TSTA Tumour Specific Transplantation Antigen
(Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thƣ)

10. d
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan ...........................................7
Bảng 2. Các chỉ thị ung thƣ gan mới đƣợc công bố (20 năm gần đây) ....................12
Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu.............................................24
Bảng 4. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm...........28
Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều..........................................36
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan
bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10......................39
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan
bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7..........................39
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ
so với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL................40
Bảng 9. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô
gan ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC .............................42
Bảng 10. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan
ung thƣ so với mô gan đối chứng đã đƣơc nhận dạng ..............................................48

11. e
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan ....................................................3
Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan.........................................5
Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan................................................................26
Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix .30
Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và
mô gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS .............................................33
Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều
...................................................................................................................................35
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều..................................37
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thƣ so với bản
gel mô bình thƣờng ...................................................................................................37
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thƣ so với
mô gan bình thƣờng của bệnh nhân HCC mã 8935..................................................38
Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân spot protein
C-256-B bằng trypsin................................................................................................41
Hình 11. Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide
và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot ..............................................45
Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1
có độ pha loãng khác nhau........................................................................................45
Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977...........47
Hình 14. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau ...50
Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I............................58

12. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
1
MỞ ĐẦU
Ung thƣ gan hiện là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới và
Việt Nam, đây là bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có
xu hƣớng tăng lên. Theo thống kê năm 2008, ƣớc tính trên thế giới có khoảng
748.300 trƣờng hợp mắc ung thƣ gan và 695.900 ca tử vong do ung thƣ gan. Việt
Nam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có tỷ lệ mắc ung thƣ gan cao nhất [18]. Theo
thống kê của bệnh viện K, nƣớc ta có tỷ lệ mắc ung thƣ gan nguyên phát cao do
nhiễm virus viêm gan B và virus viêm gan C [41]. Do đó, việc nghiên cứu về tác
nhân gây bệnh, cơ chế và phƣơng pháp chẩn đoán, phát hiện sớm ung thƣ gan có vai
trò quan trọng đối với việc giảm tỷ lệ mắc và giảm tỷ lệ tử vong ở loại ung thƣ này.
Hiện nay, các phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng nhƣ: sinh thiết gan, chụp
cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học nhƣ
anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thƣ gan. Tuy nhiên,
các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chỉ phát hiện đƣợc bệnh vào giai đoạn
muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thƣ gan [38]. Nhu cầu đặt ra
là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thƣ gan ở
giai đoạn sớm.
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm
kiếm các chỉ thị ung thƣ gan sử dụng công cụ proteomics. Phần lớn các protein có
trong huyết tƣơng đều đƣợc tổng hợp từ gan. Mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan
cũng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u. Do đó, các tín hiệu
protein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển của bệnh
gan, phát triển chẩn đoán phân tử [29]. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh
rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp
ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng nguyên ung thƣ đã đƣợc
xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ [27]. Vì thế, các tự kháng thể có thể đƣợc
dùng để chẩn đoán lâm sàng ung thƣ và dùng trong phân tích proteomics để nhận
dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển

13. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
2
dạng ác tính của tế bào. Đây là hƣớng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị
sinh học ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan”
nhằm mục đích:
- Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình
thƣờng của bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di
hai chiều.
- Nhận dạng đƣợc một số protein khác biệt đặc trƣng giữa mô gan ung thƣ so
với mô gan bình thƣờng.
- Xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan)
đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan.
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

14. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
3
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN
Ung thƣ gan là một trong các dạng bệnh lý phổ biến nhất trên thế giới và tỷ
lệ tử vong do ung thƣ gan xếp hàng thứ ba trên tổng số các trƣờng hợp tử vong do
ung thƣ. Tại Mỹ, từ năm 2004 đến 2008, tỷ lệ mắc mới ung thƣ gan mỗi năm tăng
3,6% ở nam giới và 3% ở nữ giới, xu hƣớng này đã tồn tại từ năm 1992. Các nhà
nghiên cứu dự đoán trong năm 2012 sẽ có khoảng 28.720 trƣờng hợp mắc mới ung
thƣ gan, hơn 80% trong số đó là ung thƣ tế bào biểu mô gan [8].
Ung thƣ gan gồm hai dạng là ung thƣ gan nguyên phát và ung thƣ gan thứ
phát (di căn). Ung thƣ gan nguyên phát là ung thƣ xuất phát từ các loại tế bào gan
(hình 1). Ung thƣ gan thứ phát là do các tế bào ung thƣ của các cơ quan, bộ phận
khác trong cơ thể di chuyển theo dòng máu hoặc mạch bạch huyết tới gan và định
khu tại đây, hình thành khối u. Ung thƣ di căn gan không mang các đặc trƣng của
ung thƣ xuất phát từ gan, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập
tới ung thƣ gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thƣ tế bào biểu mô gan
(Hepatocellular Carcinoma - HCC) thƣờng gọi là ung thƣ gan [49].
Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan [49]
1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát
Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thƣ, ung thƣ gan
nguyên phát đƣợc phân thành các loại chính nhƣ sau [42]:

15. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
4
- Ung thƣ tế bào biểu mô gan là dạng ung thƣ biểu mô hay gặp nhất trong ung
thƣ gan. Ung thƣ bắt nguồn từ các tế bào biểu mô, đây là loại tế bào gan chủ yếu, do
đó, HCC chiếm 85 - 95% các trƣờng hợp ung thƣ gan nguyên phát [32].
- Ung thƣ tế bào ống mật, đây là dạng ung thƣ bắt đầu ở các đƣờng mật nhỏ
trong gan. Dạng ung thƣ này chỉ chiếm khoảng 5 - 15% [32]. Nguy cơ mắc dạng
ung thƣ này sẽ tăng cao khi bệnh nhân bị sỏi mật, loét đƣờng tiêu hóa hay nhiễm
các dạng ký sinh trùng trong gan.
- Ung thƣ biểu mô hỗn hợp, đây là dạng ung thƣ hiếm gặp, tế bào ung thƣ gồm
cả tế bào biểu mô gan và tế bào ống mật.
- U nguyên bào gan là loại u gan ác tính ở trẻ em, hiếm gặp ở ngƣời lớn. U
nguyên bào gan xuất hiện có thể do các gene hoạt động bất thƣờng.
- Ung thƣ tế bào mạch là loại ung thƣ rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu
trong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp nhƣ vinyl chlorid hoặc các
hóa chất gây ung thƣ.
1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan
Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thƣ gan,
song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thƣ là đa nhân tố và quá trình
tiến triển thành ung thƣ rất phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc [39]. Các yếu tố nguy
cơ chính có thể tiến triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh nhƣ nhiễm
virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus -
HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính; xơ gan; các loại hóa chất nhƣ: rƣợu, aflatoxin B1,
vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn trao đổi chất nhƣ nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếu
hụt α1 - antitrypsin [38]. Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bào
gan theo các con đƣờng khác nhau nhƣng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền và
dẫn đến hình thành tế bào ung thƣ (hình 2).

16. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
5
Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan [13]
Theo số liệu hồi cứu năm 2006 của Wong và cộng sự (cs) cho thấy, nhiễm
HBV mạn tính đƣợc xem nhƣ là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến HCC. Các bệnh nhân
có phản ứng dƣơng tính với kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) có
nguy cơ phát triển thành HCC cao gấp 70 lần so với ngƣời có phản ứng âm tính
HBsAg. Nhiễm HBV là một bệnh phổ biến ở các nƣớc Đông Nam Á, Trung Quốc,
Đài Loan, Hàn Quốc, Châu Phi, tại những vùng này có tới 85% - 95% bệnh nhân
HCC dƣơng tính với HBsAg. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc HBV chèn
DNA của mình vào hệ gene ngƣời bệnh sẽ làm mất tính ổn định của nhiễm sắc thể,
hoạt hóa các gene gây ung thƣ hoặc gây bất hoạt các gene ức chế khối u nhƣ TP53.
Ngoài ra, các sản phẩm protein của HBV có thể gây rối loạn chu trình tế bào, tạo
điều kiện cho sự tiến triển của các tác nhân gây ung thƣ, đồng thời hoạt hóa các yếu
tố phiên mã và promoter của các gene cần thiết cho hoạt động sống của virus [38].
Nhiễm virus viêm gan C mạn tính cũng là một yếu tố nguy cơ dẫn đến ung
thƣ gan. Ở các nƣớc phát triển nhƣ Nhật Bản, Ý, Pháp và một số nƣớc thuộc Nam
Âu, tỷ lệ bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan C chiếm đa số [14]. Các nhà

17. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
6
nghiên cứu đã phát hiện ra rằng protein lõi của HCV có thể tác động tới quá trình
sinh trƣởng tế bào bằng cách kìm hãm hoạt động phiên mã của promoter p53 [38].
Đồng nhiễm HCV và HBV làm tăng nguy cơ mắc ung thƣ gan từ 2 đến 6 lần so với
nhiễm độc lập một loại virus.
Aflatoxin là những chất gây ung thƣ có độc tính cao đƣợc hình thành khi
thực phẩm và nƣớc bị nhiễm nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Ở
các nƣớc đang phát triển thuộc Châu Phi hay một số nơi ở Châu Á, ngƣời dân ăn
các thực phẩm nhiễm aflatoxin thì nguy cơ mắc ung thƣ gan cũng tăng. Aflatoxin có
thể trực tiếp làm tổn thƣơng gene TP53 gây bất hoạt protein p53. Đồng nhiễm
aflatoxin B1 (AFB1) và HBVsẽ gây ra biến đổi p53 ở gốc serine 249. HBV làm hoạt
hóa các cytochrome P450 gây bất hoạt quá trình trao đổi AFB1 tạo ra chất gây đột
biến là AFB1-8,9-epoxide và các hợp chất chứa oxy có khả năng hoạt động hóa học
mạnh làm tế bào mẫn cảm với AFB1 [14].
Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ tuổi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làm
tăng nguy cơ bị ung thƣ gan. Nam giới có nguy cơ bị ung thƣ gan cao hơn nữ giới
từ hai đến ba lần. Một số nghiên cứu về nội tiết đã chỉ ra rằng, thụ thể hormone giới
tính có biểu hiện thay đổi trong khối u HCC [29]. Kết quả điều tra dân số Mỹ cho
thấy những ngƣời gốc Châu Á có tỷ lệ ung thƣ cao nhất, ngƣời Mỹ da đen cũng có
tỷ lệ mắc ung thƣ cao hơn so với ngƣời da trắng.
Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê tại bệnh viện Việt Đức trong năm 2008,
số bệnh nhân nam mắc u gan cao gấp 3 lần so với bệnh nhân nữ; số bệnh nhân bị u
gan có phản ứng dƣơng tính với HBsAg chiếm 65,9% tổng số bệnh nhân u gan;
bệnh nhân u gan trong độ tuổi từ 20 đến 60 tuổi chiếm 73,88%, bệnh nhân u gan
thuộc nhóm tuổi dƣới 20 và trên 60 tuổi chỉ chiếm 26,12% [tài liệu chƣa công bố].
1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan
Căn cứ theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993),
thông qua các chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để xác định kích cỡ
khối u nguyên phát và tình trạng bị xâm lấn các mạch máu, các giai đoạn của ung

18. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
7
thƣ gan đƣợc mô tả ở bảng 1 [45, 32]. Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thƣớc u,
hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thƣ gan còn đƣợc phân
loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I, II, IIIA/B/C và giai đoạn IV [32].
Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan [32]
Phân loại TNM T N Giai đoạn
T1 - Có 1 khối u không xâm
lấn đến mạch máu xung quanh.
N0 - Không có hạch di căn.
M0 - Không có sự di căn tới
vùng xa.
Giai đoạn I
T1, N0, M0
T2 - Một khối u đã xâm lấn
mạch máu hoặc nhiều khối u
trên một lá gan, đƣờng kính u
không quá 5cm.
Giai đoạn II
T2, N0, M0
T3 - Có nhiều khối u đƣờng
kính lớn hơn 5cm hoặc một
khối u xâm lấn đến tĩnh mạch
cửa hoặc phân nhánh chính của
tĩnh mạch cửa gan.
Giai đoạn IIIA
T3, N0, M0
T4 - Một hoặc nhiều khối u
xâm lấn trực tiếp tới các cơ
quan khác hoặc làm thủng phúc
mạc tạng.
N1 - Có hạch bạch huyết di căn
Giai đoạn IIIB
T4, N0, M0
Giai đoạn IIIC
T bất kỳ
N1, M0
M1 - Có di căn tới vùng xa
Giai đoạn IV
T bất kỳ
N bất kỳ
M1

19. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
8
1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan
Gan đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khả
năng tái sinh mạnh nhờ phân bào liên tục, do đó, ung thƣ gan phát triển rất nhanh,
kích thƣớc gan có thể tăng gấp đôi sau 4 tháng. Các triệu chứng của HCC thƣờng
bộc lộ khi bệnh đã nghiêm trọng và khối u đã lớn, vì vậy, việc phát hiện HCC vào
giai đoạn muộn gây khó khăn trong việc điều trị, đây chính là lý do dẫn đến tỷ lệ tử
vong do HCC rất cao, chiếm khoảng 70% các trƣờng hợp tử vong do ung thƣ trên
toàn thế giới [14].
Hiện nay, phát hiện HCC chủ yếu dựa vào việc xét nghiệm máu để định
lƣợng alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh. AFP là một glycoprotein có khối
lƣợng 70kDa, đƣợc tổng hợp ở gan và túi noãn hoàng của thai, sau đó đƣợc tiết vào
huyết thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ. Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanh
giảm và ở ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh chỉ còn 3 - 5ng/ml, rất khó để phát hiện
đƣợc ở ngƣời trƣởng thành. AFP có thể đƣợc dùng để sàng lọc ngƣời có nguy cơ bị
ung thƣ gan cao [39]. Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trƣng cho ung thƣ gan vì
nồng độ AFP có thể cũng tăng trong một số trƣờng hợp khác: thai nghén bình
thƣờng, viêm gan ở giai đoạn phục hồi, viêm gan mạn tính, ung thƣ tế bào mầm nhƣ
ung thƣ tinh hoàn hay mắc một số dạng ung thƣ khác nhƣ ung thƣ dạ dày, ung thƣ
đƣờng mật [5]. Xét nghiệm AFP cũng không nhạy bởi có khoảng 15% - 30% bệnh
nhân ung thƣ gan mà hàm lƣợng AFP vẫn không tăng [39], nhất là đối với các khối
u gan nhỏ hơn 3cm.
Hàm lƣợng AFP cao có thể nghĩ đến ung thƣ gan nhƣng không thể là yếu tố
quyết định chắc chắn. Vì thế, để chẩn đoán ung thƣ gan cần kết hợp xét nghiệm định
lƣợng AFP và chẩn đoán hình ảnh bằng siêu âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng
hƣởng từ để có thể thấy đƣợc hình dạng, kích thƣớc và kết cấu của khối u, nhƣng để
chẩn đoán chính xác u lành tính hay ác tính thì nhất thiết phải sinh thiết gan. Tuy
nhiên, sinh thiết gan gây nguy cơ chảy máu cao, dò dịch mật, vết bầm máu và nhiễm
khuẩn có thể xảy ra, đồng thời tăng nguy cơ biến u lành tính chuyển dạng thành ác

20. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
9
tính và thúc đẩy di căn [50]. Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan [26].
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ
Chỉ thị sinh học là các phân tử đƣợc tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơ
thể hoặc trong mô đặc trƣng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý.
Chỉ thị sinh học có thể đƣợc dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác
đồ điều trị bệnh hoặc một trạng thái nhất định [46].
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ
Ngày nay, chỉ thị sinh học là một trong những công cụ quan trọng nhất để
phát hiện sớm ung thƣ, xác định chính xác sự tiến triển của bệnh, tiên lƣợng và theo
dõi điều trị ung thƣ nhằm kéo dài thời gian sống, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân
ung thƣ. Các chỉ thị ung thƣ là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thƣ, có
nồng độ thay đổi theo chiều hƣớng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng
trƣởng của những khối u ác tính. Chỉ thị ung thƣ là những chất do các tế bào hoặc
mô ung thƣ tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc đƣợc tạo ra từ các phản ứng
của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị
ung thƣ dạng tế bào bao gồm: các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể
hormone và thụ thể yếu tố tăng trƣởng, những biến đổi di truyền (biến đổi gene) của
tế bào. Chỉ thị ung thƣ dạng thể dịch bao gồm: các chất đƣợc phát hiện ở những
nồng độ không bình thƣờng có mặt trong huyết thanh, nƣớc tiểu, các loại dịch của
cơ thể [3].
Dựa vào khả năng đặc hiệu với bệnh, chỉ thị ung thƣ có thể đƣợc phân loại
và đánh giá theo các tiêu chí sau [3]:
- Đặc hiệu cao: chỉ thị ung thƣ không tìm thấy ở đối tƣợng khỏe mạnh hoặc u
lành tính.
- Độ nhạy cao: chỉ thị ung thƣ dễ phát hiện ở giai đoạn sớm khi chỉ có một tế
bào ung thƣ xuất hiện.

21. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
10
- Đặc hiệu cơ quan: chỉ xuất hiện ở cơ quan bị ung thƣ.
- Xuất hiện tƣơng quan với giai đoạn ung thƣ và kích thƣớc khối u.
- Tƣơng quan với tiên lƣợng về thời gian sống.
- Có giá trị dự báo.
Đối với ung thƣ gan, chỉ thị ung thƣ đƣợc ứng dụng theo hai hƣớng chính
sau [29]:
- Sàng lọc các nhóm nguy cơ cao để xác định đƣợc ung thƣ khi kích thƣớc
khối u còn nhỏ (< 3cm) để có liệu pháp điều trị hiệu quả.
- Xác nhận chẩn đoán ung thƣ ở những bệnh nhân có khối u lớn đã đƣợc phát
hiện nhờ chụp X quang.
1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ
Hiện nay, có ba cách tiếp cận đang đƣợc áp dụng rộng rãi để nghiên cứu các
chỉ thị sinh học phục vụ cho việc chẩn đoán phân tử, phát hiện sớm ung thƣ [17].
- Sử dụng các kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gene lạ có liên
quan đến các loại ung thƣ riêng biệt. Tuy nhiên, kết quả của các nghiên cứu này mới
chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh chứ không thể biết đƣợc nguy cơ thực
sự của bệnh.
- Phƣơng pháp proteomics xác định đƣợc hầu hết các protein có triển vọng trở
thành các protein chỉ thị ung thƣ. Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xác
đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lƣợng bệnh, dự đoán đƣợc các ảnh
hƣởng của việc điều trị và giúp phát triển lĩnh vực y học cá nhân. Hạn chế của
phƣơng pháp này là một số protein chỉ thị ung thƣ chỉ đƣợc tìm thấy ở trong mô ung
thƣ mà không có mặt trong máu.
- Sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng
nguyên ung thƣ. Song do có hiện tƣợng phản ứng chéo trong phản ứng miễn dịch,
do đó, kết quả của phƣơng pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu.

22. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
11
Sự kết hợp các phƣơng pháp trên sẽ làm tăng độ tin cậy cho các chỉ thị phân
tử, tăng tính chính xác khi chẩn đoán bệnh. Kỹ thuật proteomics ở đây có vai trò rất
quan trọng, bổ sung cho kỹ thuật genomics và dò tìm kháng thể để nhận dạng kháng
nguyên khối u. Kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng rộng rãi để nghiên cứu chỉ thị phân tử
của nhiều dạng ung thƣ khác nhau [17]. Sự phát triển của các kỹ thuật genomics,
proteomics giúp chúng ta mở rộng hiểu biết về bản chất sinh học của ung thƣ; ngày
càng phát hiện và sử dụng đƣợc nhiều phân tử chỉ thị với độ nhạy và tính đặc hiệu
cao trong chẩn đoán lâm sàng.
1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thƣ gan
Đối với nghiên cứu ung thƣ gan, các phƣơng pháp trên đều đã đƣợc áp dụng
để tìm ra các chỉ thị phân tử, bao gồm cả DNA và protein, đặc biệt là các kháng thể
đặc hiệu. Một trong những hƣớng nghiên cứu quan trọng nhất là phân tích tìm ra
các chỉ thị phân tử để nhận dạng kiểu hình ác tính của tế bào. Các phân tử chỉ thị
này bao gồm: các phân tử tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào, gây biến đổi
DNA; gene TP53; các protein khác tham gia điều khiển chu trình tế bào; các gene
gây ung thƣ và các thụ thể của chúng; các yếu tố liên quan đến sự chết theo chƣơng
trình của tế bào và sự hoạt động của telomerase. Một hƣớng nghiên cứu khác là tìm
ra các chỉ thị phân tử liên quan đến quá trình xâm lấn và di căn của ung thƣ, các chỉ
thị phân tử loại này gồm các phân tử bám dính (Adhesion), các enzyme thủy phân
protein làm giảm chất gian bào, các yếu tố sinh trƣởng tham gia vào sự hình thành
mạch giúp khối u phá vỡ vỏ bọc, di căn đến các vị trí khác trong cơ thể...[31].
Cho đến nay, ngoài AFP đã đƣợc xác định có giá trị, có nhiều chỉ thị sinh
học khác đã đƣợc nghiên cứu để chẩn đoán HCC. Trong một nghiên cứu tổng quan
về chỉ thị ung thƣ gan, tác giả Hoàng Văn Sơn (2011) đã liệt kê một số chỉ thị ung
thƣ gan đang đƣợc nghiên cứu (bảng 2). Đa số các chỉ thị mới này vẫn đang đƣợc
nghiên cứu lâm sàng, trong đó, chỉ thị huyết thanh AFP-L3, des-gamma-carboxy-
prothrombin (DCP), glypican-3 (GPC-3) có nhiều hứa hẹn [5].

23. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
12
Bảng 2. Các chỉ thị ung thƣ gan mới đƣợc công bố (20 năm gần đây) [5]
Loại STT Tên chỉ thị sinh học Năm công bố
Chỉ thị trong
huyết thanh
1 AFP gắn LCA 1991
2 AFP gắn Lectin L3 1993
3 AFP gắn concanavalin 1995
4 DCP 1997
5 Methyl hóa gene P16 1999
6 Telomerase 2000
7 Transforming Growth Factor β1 2002
8 AFP monosialyl 2002
9 Insulin-like growth Factor II 2003
10 Glutamate carboxypeptidase 2003
11 NH2 Fragment GPC-3 2004
12 Telomerase reverse transcriptase mARN 2007
13 Interleukin-6 2009
Chỉ thị ở mô
14 Glypican-3 2009
15 Heat shock protein 70 2009
16 Glutamin synthetase 2009
Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã công bố
nhiều chỉ thị ung thƣ nhằm phát hiện sớm, sàng lọc, chẩn đoán chính xác và theo
dõi điều trị HCC. Đa số các chỉ thị mới này hiện vẫn đang đƣợc nghiên cứu trên lâm
sàng. Do đó, hƣớng nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thƣ gan vẫn đang đƣợc triển
khai và tiếp tục phát triển. Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hƣớng
nghiên cứu tìm kiếm các protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các protein
này kích thích sinh ra kháng thể trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ung
thƣ tiềm năng.

24. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
13
1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ
Khi nghiên cứu ung thƣ thực nghiệm, có nhiều bằng chứng thể hiện có sự
kiểm soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên ung thƣ. Mặc
dù, một số ung thƣ có thể lẩn tránh khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch bằng
nhiều cơ chế nhƣ dung nạp, kháng thể phong bế, gây suy giảm miễn dịch, nhƣng
phần lớn ung thƣ có đáp ứng miễn dịch [7].
Các tế bào ung thƣ có thể bị phân hủy bởi các tế bào tham gia đáp ứng miễn
dịch không đặc hiệu, gồm: đại thực bào, tế bào giết tự nhiên và bạch cầu ƣa axít.
Đáp ứng miễn dịch loại này không cần có kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu.
Trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống ung thƣ, vai trò của đáp ứng miễn dịch
dịch thể không rõ bằng đáp ứng miễn dịch tế bào, song các nghiên cứu cũng chứng
minh đƣợc sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thƣ. Nhiều nghiên cứu
ung thƣ ở động vật thực nghiệm đã chứng minh vai trò của tế bào T độc (Tc) trong
phân hủy tế bào khối u khi đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tế bào. Quá trình này đòi hỏi
phải hoạt hóa tế bào TCD8
+
bởi các tế bào trình diện kháng nguyên có mang MHC
lớp I và các cytokin tƣơng ứng (Interleukin-2, Interleukin-4) [7].
1.3.2. Kháng nguyên ung thƣ
Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng thành tế bào ung thƣ, quá trình này làm
xuất hiện các protein mà tế bào bình thƣờng không có hoặc có rất ít. Các protein
này là các kháng nguyên ung thƣ và “lạ” đối với cơ thể và trở thành đích của các tế
bào đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Dƣới đây là một vài
loại kháng nguyên ung thƣ [7]:
- Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thƣ (Tumour specific transplantation
antigen - TSTA), kháng nguyên này đƣợc phát hiện khi ghép các mảnh ung thƣ. Khi
đó, TSTA sẽ kích thích cơ thể nhận sinh đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ ghép.
Đặc điểm TSTA của ung thƣ do hóa chất hoặc tia xạ là tính đặc hiệu kháng nguyên
phụ thuộc vào mô ung thƣ, chứ không phụ thuộc vào hóa chất gây ung thƣ. Ngƣợc

25. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
14
lại, TSTA của ung thƣ do virus gây ra có tính đặc hiệu phụ thuộc vào chủng virus,
không phụ thuộc vào mô ung thƣ. Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống
TSTA chỉ mới đƣợc xác định trong thực nghiệm ghép ung thƣ.
- Kháng nguyên đặc hiệu mô (Tissue specific antigen - TSA) là kháng nguyên
có trên bề mặt các tế bào bình thƣờng và có đặc tính riêng cho từng loại tổ chức.
Ung thƣ xuất hiện từ mô nào thƣờng biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu ở mô đó.
TSA không kích thích đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ, song nó có thể sử dụng
làm đích cho miễn dịch điều trị và làm chỉ thị tìm nguồn gốc xuất phát mô ung thƣ.
- Kháng nguyên liên quan đến ung thƣ (Tumour associated antigen - TAA) là
kháng nguyên phát hiện đƣợc trong các loại ung thƣ mà không có hoặc có rất ít
trong tế bào mô bình thƣờng. Ở ngƣời, kháng nguyên này đƣợc xác định bằng các
kháng thể đơn dòng [7].
TAA là các peptide hay protein đặc hiệu khối u, chúng có thể biểu hiện tăng
hoặc giảm bất thƣờng, bị đột biến hay cuộn gấp sai gây ra đáp ứng miễn dịch ung
thƣ. Vì vậy, nghiên cứu nhằm tìm ra các chỉ thị ung thƣ là các TAA giúp chẩn đoán
sớm ung thƣ có vai trò quan trọng. Nhiều chỉ thị sinh học là các TAA đã đƣợc xác
định, nhƣ kháng nguyên ung thƣ phôi thai (Carcino embryonic antigen - CEA) đặc
trƣng cho ung thƣ ruột kết, protein AFP đặc trƣng cho ung thƣ gan, CA19-9 cho
ung thƣ dạ dày - ruột và CA-125 cho ung thƣ buồng trứng [34].
1.3.3. Chỉ thị ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch
Hiện nay, các nghiên cứu xác định chỉ thị sinh học ung thƣ đang đƣợc tiến
hành theo hai hƣớng: hƣớng thứ nhất là xác định tự kháng thể trong huyết thanh của
bệnh nhân ung thƣ bắt nguồn từ những kháng nguyên ung thƣ. Hƣớng thứ hai là xác
định sớm ung thƣ dựa vào việc phát hiện ra các kháng nguyên liên quan đến khối u.
Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thƣ, trong khối
u xuất hiện các protein biểu hiện bất thƣờng, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã,
đây chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thƣ. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh các TAA gây ra đáp ứng miễn dịch sinh ra các kháng thể kháng TAA trong

26. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
15
huyết tƣơng và một số TAA đã đƣợc xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ [27].
Hơn nữa, tế bào ung thƣ cũng giải phóng nhiều protein vào máu. Do đó, hƣớng
nghiên cứu chẩn đoán sớm ung thƣ dựa vào xét nghiệm máu, huyết tƣơng của bệnh
nhân ung thƣ để xác định TAA đang rất đƣợc quan tâm.
Bên cạnh đó, trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ, trong huyết
thanh của bệnh nhân ung thƣ có xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu chống lại các
kháng nguyên của chính cơ thể. Các tự kháng thể này mang nhiều đặc điểm ƣu việt
khiến chúng trở thành những chỉ thị phân tử giúp phát hiện ung thƣ ở giai đoạn
sớm: (a) đƣợc xác định ở giai đoạn sớm của bệnh do phản ứng miễn dịch giữa các
tự kháng thể và các TAA xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình hình thành khối u,
chúng là kết quả của quá trình khuếch đại qua hệ miễn dịch của con ngƣời; (b) có
khả năng kháng lại quá trình phân giải protein và tránh đƣợc sự chuyển hóa phân tử.
Do đó, đời sống của chúng kéo dài khoảng 21 ngày; (c) các tự kháng thể có mặt
trong huyết thanh của bệnh nhân, nên có thể đƣợc xác định, phân tích bằng các kỹ
thuật đơn giản nhờ các xét nghiệm máu [28].
1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƢ GAN
1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics
Proteomics là một lĩnh vực khoa học nghiên cứu về proteome - sản phẩm của
genome hay chính là tập hợp các protein đƣợc biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể
ở những điều kiện và tại thời điểm xác định [23].
Mục đích của nghiên cứu proteomics là nhận diện đƣợc tất cả các protein
đƣợc mã hóa trong hệ gene của sinh vật và xác định: (a) phạm vi và phƣơng thức
biểu hiện, hoạt động của hệ protein ở các kiểu tế bào và loại mô khác nhau; (b) sự
phân bố ở dƣới mức tế bào; (c) những cải biến sau dịch mã; (d) mối tƣơng tác với
những protein và thành phần khác; (e) mối quan hệ cấu trúc - chức năng... Ngoài ra,
nghiên cứu proteomics cũng cung cấp những hiểu biết tổng thể về sự biểu hiện của
các protein ở những trạng thái sinh lý, phát triển và bệnh lý khác nhau [2].

27. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
16
Do đó, proteomics bao gồm những nghiên cứu có tính hệ thống nhằm cung
cấp những kiến thức tổng quan về cấu trúc, chức năng của protein và vai trò của
chúng trong điều hòa hoạt động của các hệ sinh học. Các kết quả nghiên cứu
proteomics sẽ bổ trợ cho kết quả giải trình tự gene từ các nghiên cứu genomics và
nghiên cứu genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng
vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu Sinh - Y học, là nền tảng cho sự phát triển
trong chẩn đoán và chữa bệnh trong tƣơng lai.
Sử dụng các công cụ proteomics trong nghiên cứu bệnh học, proteomics lâm
sàng đã thu đƣợc nhiều kết quả theo ba hƣớng nghiên cứu chính sau [4]:
- Nghiên cứu cơ chế phát sinh bệnh ở mức độ phân tử.
- Tìm ra các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo
dõi tiến triển của bệnh.
- Nghiên cứu các đích tác dụng của thuốc điều trị, qua đó tìm ra các thuốc có
tác dụng tối ƣu, phát triển hƣớng nghiên cứu y học cá nhân, tức là sử dụng
biện pháp điều trị thích hợp cho từng ngƣời.
Tới nay, proteomics lâm sàng đã đƣợc phát triển nhanh và hiệu quả nhất trong
nghiên cứu về ung thƣ. Các nghiên cứu proteomics đã phát hiện ra nhiều chỉ thị ung
thƣ mới, có giá trị hơn, các chỉ thị mới này hỗ trợ cho các chỉ thị đang đƣợc sử dụng
làm tăng độ đặc hiệu và chính xác lên rõ rệt trong chẩn đoán sớm ung thƣ [4].
1.4.2. Hệ protein gan ngƣời
Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể ngƣời, chỉ đứng thứ hai sau não về mức
độ phức tạp. Gan có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa, trao đổi chất, thanh
lọc độc tố và cũng là nơi sản sinh ra nhiều loại protein nhất. Các protein đƣợc tạo ra
từ tế bào gan thực hiện hàng ngàn phản ứng sinh hóa phức tạp.
Tại hội thảo khoa học của Tổ chức Proteome ngƣời (Human Proteome
Organisation - HUPO) diễn ra ngày 28-29/04/2002 ở Bethesda (Hoa Kỳ), đã đánh
dấu cho sự ra đời của dự án Proteome gan ngƣời (Human Liver Proteome Project -

28. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
17
HLPP). Đây là dự án lớn thứ 3 của tổ chức HUPO có mục đích nghiên cứu là: xây
dựng bản đồ protein toàn diện của gan ngƣời, nhận dạng sự biểu hiện của protein,
những cải biến sau dịch mã, thiết lập bản đồ tƣơng tác protein - protein, tiếp cận
theo hƣớng proteomics để tìm hiểu về trạng thái sinh lý, bệnh lý trong gan từ đó
giúp phát triển các chỉ thị chẩn đoán và điều trị các bệnh về gan, thành lập ngân
hàng dữ liệu HLPP [47].
Dự án HLPP đƣợc triển khai với tiến độ nghiên cứu nhanh và đã thu đƣợc
nhiều kết quả đáng kể. Trong 5 năm qua, các nhà khoa học của dự án đã thiết lập
quy trình thao tác chuẩn, tối ƣu hóa kỹ thuật phân tích proteomics và khảo sát thành
công hệ protein mô gan phôi thai và mô gan ngƣời trƣởng thành. Dự án đã thực hiện
đƣợc mục tiêu ban đầu đề ra là xác định đƣợc 5000 protein gan, 5500 khung đọc mở
của các gene biểu hiện ở gan ngƣời đƣợc lƣu giữ trong ngân hàng khung đọc mở.
Bên cạnh đó, một hệ thống hơn 1000 tƣơng tác giữa protein - protein ở gan ngƣời
đƣợc tìm thấy và miêu tả. Những thay đổi về proteomics trong mô gan và huyết
tƣơng đã đƣợc nghiên cứu và so sánh trong quá trình tiến triển của các bệnh về gan,
từ mô gan bình thƣờng tới viêm gan, xơ gan, ung thƣ gan và ung thƣ gan di căn. Từ
những nghiên cứu đó, 10 chỉ thị sinh học tiềm năng cho các bệnh về gan đƣợc tìm
ra và đƣợc khẳng định tính hiệu quả của chúng trong chẩn đoán các bệnh về gan.
Đặc biệt, dự án đã xây dựng và công bố 3 cơ sở dữ liệu về gan: Liverbase, dbLEP,
LiverMap nhằm cung cấp thông tin về đặc điểm protein biểu hiện trong gan, định vị
protein, mô tả tƣơng tác của protein và quá trình hoạt động chức năng của protein
trong gan [47].
1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thƣ gan
Ung thƣ có thể coi là bệnh về hệ protein, bởi chính những đột biến di truyền
làm sai lệch quá trình truyền tín hiệu, làm tế bào sai hỏng không bị loại bỏ, đồng
thời khiến tế bào tăng sinh không kiểm soát đƣợc. Hiện nay, đa số các chỉ thị ung
thƣ đang đƣợc sử dụng là kết quả nghiên cứu về protein, vì protein là sản phẩm cuối
cùng của gene và tác động trực tiếp đến các quá trình sinh học. Hơn nữa, protein là

29. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
18
thành phần phong phú nhất của tế bào. Do đó, các nhà khoa học đang tập trung ứng
dụng kỹ thuật proteomics trong nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thƣ là các
protein nhằm chẩn đoán sớm ung thƣ.
Proteomics ung thƣ là ứng dụng kỹ thuật proteomics để xác định sự thay đổi
định tính và định lƣợng của protein đƣợc tìm thấy trong mô hoặc các dịch cơ thể
của ngƣời bị ung thƣ, so sánh với ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh nhằm giúp cho
việc chẩn đoán ung thƣ, tiên lƣợng và điều trị có hiệu quả hơn [15].
Proteomics miễn dịch là một khái niệm tƣơng đối mới trong lĩnh vực nghiên
cứu proteomics. Proteomics miễn dịch nghiên cứu về tập hợp các protein tham gia
đáp ứng miễn dịch [35]. Trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ, trong
huyết thanh của bệnh nhân ung thƣ có xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu chống lại
các kháng nguyên ung thƣ của chính cơ thể. Đây chính là đối tƣợng nghiên cứu của
proteomics miễn dịch ung thƣ.
Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics miễn dịch trên dòng tế bào ung thƣ,
mô hình động vật, phân tích trực tiếp trên huyết tƣơng và mô gan của bệnh nhân
ung thƣ gan đã và đang đƣợc tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu đƣợc
nhiều kết quả khả quan [15].
Để xác định các tự kháng thể có tiềm năng làm chỉ thị phân tử trong chẩn
đoán HCC, năm 2006, Takashima và cs đã tiến hành phân tích các tự kháng thể
trong huyết thanh cho thấy có phản ứng miễn dịch với các protein trong mô ung thƣ
lấy từ bệnh nhân HCC. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã tiến hành phân tách
protein của 15 cặp mẫu mô ung thƣ và mô thƣờng bằng kỹ thuật điện di hai chiều,
sau đó chuyển lên màng và thực hiện phản ứng miễn dịch với huyết thanh của chính
bệnh nhân đó. Bằng cách so sánh từng phần, họ đã xác định đƣợc 4 spot có phản
ứng miễn dịch có độ nhạy với thuốc nhuộm ở mô ung thƣ mạnh hơn so với mô bình
thƣờng. Những protein này đƣợc nhận dạng bằng sắc ký lỏng kết nối với khối phổ
(LC-MS/MS), đó là protein sốc nhiệt 70kDa (HSP70), glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase, peroxiredoxin và manganese superoxide dismutase (Mn-SOD).

30. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
19
Trong huyết thanh bệnh nhân HCC, tần suất của các tự kháng thể kháng lại các
protein lần lƣợt là 7/15 (46,7%); 5/15 (33,3%); 5/15 (33,3%) và 6/15 (40%), trong
khi đó, ở mô đối chứng là 2/20 (10%); 7/20 (35%); 0/20 (0%) và 2/20 (10%). Tiếp
tục phân tích miễn dịch sử dụng các protein thƣơng mại đã tinh sạch đƣợc tiến hành
để khẳng định tính đặc hiệu của các tự kháng thể. Phân tích thống kê các tự kháng
thể kháng lại các protein HSP70, peroxiredoxin và Mn-SOD cho thấy những phản
ứng miễn dịch có độ đặc hiệu cao trong huyết thanh HCC. Ba kháng thể đƣợc cho là
đặc hiệu đối với bệnh HCC và có thể là các chỉ thị sinh học chẩn đoán bệnh [33].
Trƣớc đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng trong quá trình chuyển
dạng từ xơ gan, viêm gan thành ung thƣ gan, trong cơ thể xuất hiện các TAA kích
thích sinh ra tự kháng thể. Các tự kháng thể này có thể xuất hiện trong huyết thanh
trƣớc khi phát hiện biểu hiện chuyển dạng ác tính. Để đánh giá sự biểu hiện của các
tự kháng thể trong các trạng thái bệnh lý về gan, năm 2007, Zhang và cs đã tiến
hành sàng lọc huyết thanh của 30 bệnh nhân xơ gan, 30 bệnh nhân viêm gan và 142
bê ̣nh nhân HCC bằng viê ̣c sƣ̉ dụng 8 TAA chọn trƣớc là các protein có liên quan
đến điều hòa chu trình tế bào, yếu tố phiên mã đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi, gồm:
protein Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16. Sử dụng kỹ thuật
hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) để phát hiện các kháng thể kháng 8
TAA trong huyết thanh của các đối tƣợng đƣợc nghiên cứu, kết quả dƣơng tính
đƣợc kiểm tra lại bằng Western blot và xét nghiệm kết tủa miễn dịch. Kết quả cho
thấy tỷ lệ xuất hiện phản ứng dƣơng tính của tự kháng thể trong huyết thanh với
từng TAA biến đổi trong khoảng từ 9,9 - 21,8%, nhƣng khi kết hợp thêm lần lƣợt
từng TAA cho tới khi đủ 8 TAA thì thấy tỷ lệ phản ứng dƣơng tính với kháng thể
tăng lên đến 59,8% ở bệnh nhân HCC. Tỷ lệ này cao hơn hẳn so với tỷ lệ phản ứng
dƣơng tính với 8 TAA ở bệnh nhân viêm gan, xơ gan và ngƣời bình thƣờng lần lƣợt
là: 20%, 30% và 12,2%. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng quá trình chuyển dạng
ác tính thành ung thƣ có liên quan đến việc tăng phản ứng của tự kháng thể với một
số protein nhất định của tế bào, việc sử dụng mini-array gồm 8 TAA tăng cƣờng
phát hiện tự kháng thể có thể dùng để chẩn đoán HCC [40].

31. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
20
Khi nghiên cứu về quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan, các nhà khoa
học đã sử dụng tự kháng thể trong huyết thanh trong sàng lọc miễn dịch thƣ viện biểu
hiện cDNA của tế bào ung thƣ gan HepG2 để xác định kháng nguyên liên quan đến
quá trình này. Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Chen tại đại học Texas đã tiến hành
nghiên cứu xác định các kháng nguyên liên quan đến khối u nhƣ những chỉ thị cho
chẩn đoán miễn dịch ung thƣ gan. Trong nghiên cứu này, huyết thanh của bệnh nhân
HCC đƣợc sử dụng để sàng lọc miễn dịch từ thƣ viện biểu hiện cDNA của tế bào
HepG2. Kết quả sàng lọc thƣ viện biểu hiện cDNA HepG2 đã chỉ ra 27 gene bao gồm
21 gene đã biết và 6 gene chƣa biết. Trong 21 gene đã biết thì 11 gene liên quan đến
quá trình chết theo chƣơng trình, biệt hóa và tăng sinh của tế bào cũng nhƣ chế biến
kháng nguyên, 10 gene là liên quan đến các ung thƣ khác và 3 gene liên quan đến
HCC. Dựa vào ý nghĩa chức năng và mối liên hệ với ung thƣ gan, HCC-1 (Suil) và
HCC-13 (RalA) đƣợc xác định có thể liên quan đến di truyền ung thƣ HCC và đƣợc
lựa chọn cho những nghiến cứu tiếp theo: phân tích huyết thanh bằng ELISA và
Western blot ở các điều kiện khác nhau. Việc xác định biểu hiện protein của cả hai
kháng nguyên đƣợc đánh giá bằng hóa mô miễn dịch. Kết quả nghiên cứu này đã
chứng minh rằng hai TAA đƣợc xác định là Suil và RalA từ thƣ viện biểu hiện cDNA
HepG2 có phản ứng miễn dịch ở HCC cao hơn đáng kể so với viêm gan mạn tính, xơ
gan cũng nhƣ ở ngƣời bình thƣờng. Điều đó khẳng định rằng hai kháng nguyên này
có thể là những chỉ thị ung thƣ trong chẩn đoán HCC [10].
Năm 2008, Li và cs đã tiến hành xác định các kháng nguyên khối u và tự kháng
thể của bệnh nhân HCC sử dụng phƣơng pháp phân tích proteome huyết tƣơng kết hợp
với protein microarray. Họ tiến hành phân tách protein tổng số từ hai dòng tế bào ung
thƣ thực nghiệm HepG2 và HepG2.2.15 bằng điện di hai chiều. Sau đó, chuyển các
protein đã đƣợc phân tách lên màng Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Đầu tiên, protein
từ dòng tế bào HepG2 đƣợc ủ với mẫu huyết thanh thu đƣợc từ 8 bệnh nhân HCC liên
quan đến HBV. Huyết thanh bình thƣờng đƣợc sử dụng làm đối chứng. Protein của
dòng tế bào HepG2.2.15 đƣợc ủ với mẫu trộn từ mẫu huyết thanh của 10 bệnh nhân
HCC liên quan đến HBV và 10 bệnh nhân HCC âm tính với HBV. Các nhà nghiên cứu

32. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
21
đã phát hiện 6 spot protein kháng nguyên của dòng tế bào HepG2 có phản ứng với
huyết thanh của bệnh nhân HCC mà không phản ứng với huyết thanh của ngƣời bình
thƣờng. Trong trƣờng hợp HepG2.2.15, họ cũng đã phát hiện đƣợc 10 spot protein
kháng nguyên có phản ứng với huyết thanh ngƣời bệnh mà không phản ứng với huyết
thanh của ngƣời bình thƣờng. Kết quả trên đã phản ánh sự khác nhau giữa các tự kháng
thể của bệnh nhân HCC liên quan đến HBV và bệnh nhân HCC không liên quan đến
HBV. Các protein trên đƣợc nhận dạng bằng phƣơng pháp phân tích khối phổ MALDI-
TOF và phần mềm Mascot. Nhóm nghiên cứu đã xác định đƣợc 13 kháng nguyên liên
quan đến HCC. Tính kháng nguyên của các protein này đƣợc khẳng định thêm bằng
cách sử dụng kỹ thuật Western blotting và phân tích protein microarray. Kết quả chỉ ra
rằng, tần suất của các phản ứng dƣơng tính với DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp), yếu tố kéo
dài dịch mã 2 (eEF2), yếu tố cảm ứng apoptosis, heterogeneous nuclear A2 (hnRNP
A2), protein liên kết với prostatic (PBP), triosephosphate isomerase (TIM) ở mẫu ung
thƣ cao hơn đáng kể so với bình thƣờng và viêm gan ma ̣n tính. Phản ứng dƣơng tính
với DEAD, eEF2, AIF và PBP là thƣờng xuyên xảy ra ở HCC hơn bất kỳ bệnh ung thƣ
khác. Độ nhạy của tất cả kháng nguyên HCC từ 50% đến 85%. Vì vậy, các nhà nghiên
cứu kết luận rằng việc phát hiện các tự kháng thể kháng lại các kháng nguyên trên có
thể có giá trị trong việc chẩn đoán sớm ung thƣ gan [22].
Năm 2008, Looi và cs đã dùng phƣơng pháp proteomics để xác định các
TAA liên quan đến HCC. Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên mẫu huyết thanh của 20
bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và huyết
thanh của 10 ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh và dòng tế bào ung thƣ gan HepG2.
Trong số 34 spot protein có phản ứng miễn dịch đƣợc cắt ra khỏi bản gel điện di hai
chiều, thủy phân protein bằng trypsin và phân tích LC-MS/MS, các tác giả đã nhận
dạng đƣợc 28 protein. 17/28 protein không chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết
thanh của bệnh nhân HCC mà còn phản ứng với kháng thể trong huyết tƣơng của
bệnh nhân tiền ung thƣ. 11/28 protein chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết tƣơng
của bệnh nhân HCC, nhóm protein này có tiềm năng lớn để trở thành chỉ thị sinh
học của ung thƣ gan. Ngoài ra, để tìm hiểu mối liên quan của các protein đã nhận

33. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
22
dạng với ung thƣ, tác giả đã tìm kiếm trên Pubmed về cơ sở dữ liệu protein. Theo
kết quả tra cứu, 18/28 protein đã đƣợc báo cáo có liên quan đến ung thƣ: 3 protein
liên quan ung thƣ vú; 4 protein liên quan HCC (GRP78, HSP70, serotransferrin,
Mn-SOD); 11 protein còn lại liên quan đến các loại ung thƣ khác [26].
Gần đây, việc nhận dạng và mô tả đặc điểm của các TAA và dùng làm “TAA
mini-array” để chẩn đoán miễn dịch ung thƣ là một hƣớng tiếp cận để phát hiện ung
thƣ đang đƣợc quan tâm. Theo hƣớng nghiên cứu này, năm 2010, Zhang và cs đã
tiến hành nghiên cứu “Sàng lọc miễn dịch ung thƣ tế bào biểu mô gan thông qua tự
kháng thể và kháng nguyên liên quan đến khối u kết hợp với biểu hiện tăng bất
thƣờng của AFP”. Nhóm tác giả đã dùng các tự kháng thể trong huyết thanh của
một bệnh nhân HCC làm mẫu dò để sàng lọc miễn dịch xác định các TAA có liên
quan đến quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan trong thƣ viện biểu hiện
cDNA của dòng tế bào ung thƣ thực nghiệm HepG2. Theo cách này đã xác định
đƣợc 2 gene là SUI1 và RA1A. Protein tái tổ hợp của 2 gene này là Sui1 và Ra1A
đƣợc biểu hiện, tinh sạch và dùng làm kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để
xác định sự có mặt của tự kháng thể trong huyết thanh của 77 bệnh nhân HCC, 30
bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và 82 ngƣời bình thƣờng. Tỷ lệ
xuất hiện kháng thể kháng Sui1 và Ra1A trong huyết thanh bệnh nhân HCC lần lƣợt
là 11,7% (9/77) và 19,5% (15/77), tỷ lệ này cao hơn đáng kể so với tỷ lệ xuất hiện
kháng thể kháng lại 2 protein này trong huyết thanh của bệnh nhân xơ gan (3,3% và
3,3%) và không xuất hiện kháng thể kháng 2 protein này ở huyết tƣơng bệnh nhân
viêm gan và ngƣời bình thƣờng. Khi bổ sung 2 protein này vào mini-array gồm 8
TAA (Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16 [40]) đã đƣợc nghiên
cứu trƣớc đó thì thấy tỷ lệ xuất hiện tự kháng thể kháng 10 TAA đạt tới 66,2%.
Ngoài ra, khi kết hợp sử dụng 10 TAA trên để chẩn đoán ở những ngƣời có AFP
biểu hiện bất thƣờng độ nhạy tăng từ 66,2% lên 88,7% [11].
Hiện nay, nhiều nghiên cứu về proteomics miễn dịch ung thƣ đã xác định
đƣợc các kháng nguyên liên quan đến khối u. Khi một TAA đƣợc xác định, các nhà
nghiên cứu sẽ dùng nhiều phƣơng pháp khác nhau để mô tả một cách toàn diện về

34. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
23
TAA, mối liên hệ của TAA với quá trình chuyển dạng tế bào ác tính và xác nhận
tƣơng tác của TAA với kháng thể kháng TAA nhằm đánh giá tiềm năng trở thành
chỉ thị để chẩn đoán miễn dịch ung thƣ. Theo hƣớng này, năm 2011, Liu và cs đã
tập trung nghiên cứu về hai TAA mới đƣợc tìm ra là p62 và p90 để tìm hiểu vai trò
của chúng trong chẩn đoán miễn dịch [24].
Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics mới chỉ đƣợc bắt đầu triển khai
tại các Phòng thí nghiệm Trọng điểm (PTNTĐ) về công nghệ Gene và Protein đƣợc
thiết lập trong giai đoạn 2001 - 2005 [2]. Ở nƣớc ta đã có một số nghiên cứu về ung thƣ
gan sử dụng kỹ thuật proteomics, tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ bƣớc đầu phân tích
hệ protein mô gan của bệnh nhân ung thƣ, so sánh với mô gan của ngƣời bình thƣờng
nhằm tìm ra các protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này. Năm 2010, nhóm
nghiên của chúng tôi thuộc Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc PTNTĐ
Công nghê ̣Enzyme và Protein , Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã ti ến hành
nghiên cứu phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thƣ gan nguyên phát đã xác
định đƣợc 44 spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan bệnh nhân ung thƣ so với
mô gan ngƣời bình thƣờng, nhận dạng đƣợc 37/44 spot protein tƣơng ứng với 28
protein đã đƣợc định danh và 8 protein giả thuyết. Trong đó, một số protein biểu hiện
khác biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ so với mô thƣờng nhƣ: Annexin V, PCNA (biểu
hiện tăng ở mô ung thƣ), p53, SODC (biểu hiện giảm ở mô ung thƣ) có tiềm năng trở
thành chỉ thị của ung thƣ tế bào gan [20]. Năm 2011, chúng tôi đã tiến hành phân tích
các protein biểu hiện khác biệt của mô gan ung thƣ và mô gan lành trên cùng lá gan của
bệnh nhân ung thƣ gan [6], đồng thời cũng tiến hành phân tích biểu hiện khác biệt của
protein huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ gan sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều [36].
Tiếp tục thực hiện hƣớng nghiên cứu proteomics ung thƣ gan tại Việt Nam,
trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân
ung thƣ gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm ra
các protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein kháng nguyên phản ứng
miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ gan, đây là các
protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan.

35. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
24
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí có khối u của bệnh nhân ung thƣ tế bào
gan nguyên phát và huyết tƣơng của chính bệnh nhân đó. Mẫu đối chứng là mô gan
cách ít nhất 5cm trên cùng lá gan tại vị trí không có khối u. Danh sách bệnh nhân
ung thƣ gan đƣợc tiến hành nghiên cứu ghi tại Phụ lục 1.
Mô gan và huyết tƣơng sử dụng trong nghiên cứu này (15 mẫu) do Khoa Tế
bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K2, Tam Hiệp cung cấp. Mẫu mô đựng trong ống
eppendorf đƣợc vận chuyển bằng bình chứa nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu
-80o
C, mẫu huyết tƣơng đƣợc bảo quản ở tủ lạnh -20o
C.
2.1.2. Hóa chất
Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Nhà cung cấp
Ampholytes pH 4 - 7, pH 3 - 10 GE Health Care, Mỹ
ECL Advance Western Blotting Detection Kit Product
Booklet (RPN2135)
GE Health Care, Mỹ
Peptide chuẩn (Insulin B; Angiotensin II)
Chất nền CHCA
Sigma - Aldrich, Mỹ
Trypsin Sigma - Aldrich, Mỹ
CHAPS, DTT, IAA, Tris - base, Biorad, Mỹ
Agarose low melting, Glycine, Urea, Tween 20 Sigma, Mỹ
SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia, Thụy Điển
Acetonitrile, Methanol, Acetone Merck, Đức
Tất cả các hóa chất khác đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh sạch
phân tích.

36. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
25
2.1.3. Thiết bị
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các dụng cụ, thiết bị trong Phòng
Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Enzyme và Protein, các thiết bị chính bao gồm:
- Máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorft, Đức), máy ly tâm K30 (Sigma, Đức).
- Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad, Mỹ), Ettan IPGphor3
(GE - Healthcare, Mỹ).
- Thanh IPG strip pH 3 - 10, 17cm; IPG strip pH 4 - 7, 7cm (Biorad, Mỹ).
- Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chạy 6 bản gel 17cm cùng
một lúc, Protean II XL cell chạy 2 bản gel kích thƣớc 17cm và Mini-Protean
3 cell (Biorad, Mỹ) chạy các gel kích thƣớc 7cm.
- Nguồn điện di PowerPacTM
HC (Biorad, Mỹ).
- Hệ thống phân tích hình ảnh sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích bản
gel diện di hai chiều Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản).
- Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA - CRF PLUS
(KRATOS ANALYTICAL, Anh).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu mô gan
Mẫu mô gan lành và mô gan ung thƣ của cùng một bệnh nhân đƣợc cắt
nhuyễn trong cối sứ đặt trên đá lạnh, protein mô gan đƣợc chiết bằng đệm muối
phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4 và đệm phá tế bào (đệm Lysis) có chứa Urea 7M,
Tris 30mM, CHAPS 4% w/v, DTT 65mM, PMSF 10mM. Tiến hành ly tâm thu các
phân đoạn dịch chiết và kéo dài thời gian ly tâm lạnh với tốc độ cao để loại bỏ các
thành phần phi protein (lipid, ARN, DNA...). Quy trình chiết protein từ mô gan
đƣợc mô tả trong hình 3.
Dịch thu đƣợc từ các phân đoạn gồm dịch chiết PBS1, PBS2, Lysis1, Lysis2
và Lysis3 sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành

37. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
26
phần và độ sạch. Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch Acetone
100% theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20o
C trong 2 giờ.
Protein lắng tủa đƣợc hòa lại bằng đệm Lysis. Các dịch chiết của cùng một mẫu
đƣợc trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều.
Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan

38. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
27
2.2.2. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford
Để đảm bảo tính đồng nhất về lƣợng protein giữa các mẫu nghiên cứu, trƣớc
khi chạy điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng protein trong
mẫu bệnh và mẫu đối chứng bằng phƣơng pháp Bradford [9].
Phƣơng pháp này định lƣợng bằng cách so màu và dựa trên sự thay đổi bƣớc
sóng hấp thụ cực đại của phức protein với thuốc nhuộm coomassie brilliant blue.
Dung dịch Bradford có tính axít thì độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 465nm, nhƣng
khi kết hợp với protein thì độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 595nm. Trƣớc tiên,
chúng tôi xây dựng đƣờng chuẩn về độ hấp thụ của albumin huyết thanh bò đã biết
trƣớc nồng độ sau đó tiến hành đo mẫu. Từ số đọc của mẫu, dựa vào đƣờng chuẩn
để xác định hàm lƣợng protein trong dịch chiết.
2.2.3. Điện di hai chiều
Điện di hai chiều gồm: điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân tách
protein theo điểm đẳng điện và điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối
lƣợng và hình dạng phân tử. Quá trình này bắt đầu bằng việc làm trƣơng thanh strip
có gradient pH cố định (IPG strip) bằng đệm trƣơng gel có chứa protein, sau 2 giờ,
protein sẽ thấm hết vào thanh strip. Lƣợng protein tối đa mà sợi gel IPG strip dài
7cm và 17cm có thể thấm tƣơng ứng là 100µg và 400µg.
Điện di đẳng điện đƣợc thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad,
Mỹ) hoặc Ettan IPGphor3 (GE - Healthcare, Mỹ) để tập trung các phân tử protein
vào vị trí tƣơng ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện
di đẳng điện diễn ra theo 5 buớc đƣợc trình bày ở bảng 4.
Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh IPG strip đƣợc ngâm trong đệm cân
bằng I (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol 30%, SDS 2%, DTT 0,1%) ở
nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol
30%, SDS 2%, IAA 0,25%), thực hiện trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Mỗi bƣớc
cân bằng đƣợc thực hiện 3 lần, mỗi lần 10 phút.

39. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
28
Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS (SDS-
PAGE) để tiếp tục phân tách protein theo khối lƣợng phân tử.
Bảng 4. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm
Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng
V7cm 17cm 7cm 17cm 7cm 17cm
Bƣớc 1 50 12 giờ 0 Trƣơng gel
Bƣớc 2 125 2 giờ ... ... Tuyến tính
Bƣớc 3 250 15 phút ... ... Nhanh
Bƣớc 4 4.000 10.000 1 giờ 2 giờ ... ... Chậm
Bƣớc 5 4.000 10.000 ... ... 10.000 40.000 Nhanh
Tổng ~ 18 giờ ~ 20 giờ ~ 14.000 ~ 60.000
Trong nghiên cứu này, mỗi cặp mẫu bệnh và đối chứng của từng bệnh nhân
đƣợc tiến hành điện di hai chiều thành hai cặp bản gel. Sau khi kết thúc điện di hai
chiều, một cặp bản gel đƣợc cố định protein bằng dung dịch chứa axit phosphoric
1,3%, methanol 20% trong một giờ, sau đó, nhuộm qua đêm bằng Coomassie G250
theo phƣơng pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988).
Phƣơng pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng
protein [37]. Hình ảnh các protein trên bản gel này đƣợc chụp lại, lƣu giữ, phân tích
đánh giá mức độ biểu hiện và so sánh với cơ sở dữ liệu sẵn có hoặc cắt, thủy phân
spot protein để phân tích khối phổ. Cặp bản gel còn lại sẽ đƣợc dùng để điện chuyển
sang màng PVDF để thực hiện phản ứng miễn dịch Western Blot.
2.2.4. Western Blot
Western Blot hay còn gọi là kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, đây là kỹ thuật
đang đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện sự có mặt của các protein cụ thể trong mẫu
nghiên cứu dựa vào tƣơng tác đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể. Tiến hành kỹ
thuật Western Blot sử dụng kit ECL AdvanceTM
Western blotting detetion (GE
Healthcare, Mỹ) để xác định kháng nguyên cố định là protein trong dịch chiết mô
gan sử dụng kháng thể bậc một là huyết tƣơng của ngƣời bệnh và kháng kháng thể

40. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
29
(kháng thể bậc hai) liên kết với peroxidase cỏ ngựa (HRP), enzyme này xúc tác cho
phản ứng oxy hóa Luminol gây ra hiện tƣợng phát quang. Sự phát sáng tối đa xuất
hiện ở bƣớc sóng 425nm. Quá trình thực hiện gồm các bƣớc sau:
Tiến hành điện đi biến tính để phân tách protein trong mô gan trên bản gel
polyacrylamide 10% có SDS.
- Điện chuyển qua đêm ở 4o
C để chuyển protein trong gel lên bề mặt màng
PVDF.
- Nhuộm màng bằng dung dịch Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng,
sau đó, tẩy trắng màng bằng H2O và ủ màng với dung dịch blocking trong 1 giờ.
- Ủ màng qua đêm với dung dịch kháng thể bậc 1 (huyết tƣơng của ngƣời
bệnh) đã pha loãng. Sau đó, rửa sạch màng để loại bỏ kháng thể thừa và các
liên kết không đặc hiệu.
- Ủ màng với dung dịch kháng thể bậc hai (kháng kháng thể gắn với HRP)
đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1:10.000 trong 1 giờ. Rửa bỏ kháng thể thừa.
- Ủ màng với dung dịch chứa Luminol và H2O2, để trong bóng tối 5 phút, ghi
lại hình ảnh phát quang trên màng PVDF.
2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot
Hình ảnh các bản gel điện di hai chiều và hình ảnh phát quang trên màng
PVDF sau khi thực hiện phản ứng kháng nguyên - kháng thể đƣợc số hóa bằng cách
quét vào máy tính có phần mềm chuyên dụng Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản) để
phân tích hình ảnh. Trƣớc tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên
mỗi bản gel và màng, mỗi spot đều đƣợc xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo
độ lớn và độ đậm nhạt của spot) trên bản gel/màng. Phần mềm này còn cho phép xác
định các spot protein tƣơng ứng trên từng cặp bản gel. Dựa vào cƣờng độ khối trung
bình của từng spot (nomalized volume - đƣợc tính bằng thể tích của spot đó chia cho
tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100) có thể chỉ ra điểm khác biệt
giữa bản gel/màng mẫu bệnh so với bản gel/màng mẫu đối chứng (hình 4).

41. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
30
Sau khi phân tích hình ảnh, chúng tôi có thể chỉ ra các spot protein xuất hiện
trên bản gel/màng này mà không xuất hiện trên bản gel/màng khác; các spot protein
biểu hiện tăng, giảm ở các bản gel/màng khác nhau. Dựa vào kết quả này, chúng tôi
xác định các spot protein ở các mẫu nghiên cứu có thể cắt ra khỏi bản gel phục vụ
cho các phân tích tiếp theo. Đồng thời cũng xác định đƣợc các điểm protein tƣơng
ứng trên màng có tính kháng nguyên, đây chính là các protein kích thích sinh ra đáp
ứng miễn dịch chống ung thƣ.
Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix
2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều
Các spot protein quan tâm trên các bản gel điện di hai chiều đƣợc cắt ra khỏi
bản gel, lúc này, phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với phân tử
thuốc nhuộm Coomassie, do đó, để thu đƣợc tập hợp các mảnh peptide phục vụ cho
phân tích khối phổ, cần loại bỏ chất màu Coomassie và phá vỡ cấu trúc không gian
của phân tử protein giúp enzyme trypsin có thể hoạt động. Enzyme trypsin cắt phân
tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R) ở đầu C, và không cắt tại các vị trí
này khi các gốc này đƣợc liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein đƣợc cắt
thành các mảnh peptide (6 - 20 acid amin) thích hợp cho phân tích khối phổ.
Quá trình tẩy màu spot và thuỷ phân protein thành các peptide sẵn sàng cho
phân tích khối phổ, bao gồm các bƣớc cụ thể nhƣ sau:

42. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
31
- Cắt các spot ra khỏi bản gel.
- Rửa các spot bằng nƣớc MiniQ.
- Tẩy màu các spot đã nhuộm coomassie bằng dung dịch chứa ammonium
bicarbonate (ABC) 50mM, acetonitrile (AcCN) 50%.
- Làm khô các spot bằng AcCN 100%.
- Nhỏ dung dịch trypsin vào các spot và ủ ở 37o
C trong 4 giờ, khi đó, phân tử
protein trong các spot sẽ bị thuỷ phân thành các peptide có thể đi ra khỏi gel
polyacrylamide.
Các peptide trong dịch thủy phân sẽ đƣợc hấp phụ bằng Ziptip C18. Quy trình
Ziptip đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau:
- Làm ƣớt Ziptip bằng dung dịch có Trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong
AcCN 70%.
- Cân bằng Ziptip bởi dung dịch TFA 0,1%.
- Hấp phụ peptide trong dịch thuỷ phân vào Ziptip.
- Loại muối bằng dung dịch TFA 0,1%.
- Phản hấp phụ peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1%
trong AcCN 70%.
- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch matrix (CHCA 10mg/ml trong
TFA 0,05%, AcCN 50%).
2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein
Tiến hành phân tích khối phổ (MALDI-TOF MS) để xác định khối lƣợng của
tập hợp các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân mỗi spot protein. Phƣơng pháp khối
phổ (MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác
khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện tích
hay ion trong một điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Nguồn MALDI đƣợc dùng
trong phân tích các hợp chất cao phân tử dựa trên nguyên lý làm ion hóa và thăng

43. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
32
hoa mẫu peptide từ phức hợp với chất nền (matrix) ở dạng tinh thể qua tác động của
các xung laser [1].
Mẫu peptide đƣợc phân tích song song với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai
peptide: angiotensin II (Mw 1046,5423Da) và insulin B (Mw 3494,6513Da). Hỗn
hợp peptide đƣợc trộn với chất nền CHCA, để khô và đƣa vào máy phân tích khối
phổ AXIMA - CRF PLUS
(KRATOS ANALYTICAL, Anh). Các thông số hoạt động của
máy khối phổ gồm:
- Nguồn laser: 55
- Profile: 30 profile cho một lần bắn
- Khối lƣợng tối ƣu: 2000Da
- Phổ khối lƣợng: 500 - 5000Da
Protein đƣợc nhận dạng theo phƣơng pháp Peptide Mass Fingerprint (PMF).
Theo phƣơng pháp này, protein đƣợc xác định bằng việc so sánh khối lƣợng của các
peptide thu đƣợc sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu lý thuyết sẵn có sử dụng phần
mềm Mascot để tra cứu theo chế độ sau:
- Cơ sở dữ liệu: NCBInr
- Phân loại: Homo sapiens
- Enzyme: Trypsin
- Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C)
- Các cải biến thay đổi: Oxidation (M)
- Cho phép sai số: ± 1Da
- Giá trị khối: MH+

44. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
33
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN
Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ
mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng (mẫu đối chứng). Mẫu mô đƣợc cắt nhỏ,
ngâm trong dịch chiết PBS 0,05M pH7,4 và đệm phá tế bào (Lysis) rồi thực hiện
các bƣớc ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch chiết protein. Kết quả tách chiết đƣợc
kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE (hình 5).
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
A. Dịch chiết mô gan bình thƣờng B. Dịch chiết mô gan ung thƣ
Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và
mô gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS
(Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1;
Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3)
Trong điê ̣n di SDS-PAGE, protein đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử,
các protein có khối lƣợng phân t ử khác nhau thì đƣợc hiê ̣n lên dƣới da ̣ng tƣ̀ ng băng
vạch khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein đƣợc đánh giá thông qua thành phần và
hàm lƣợng protein thể hiện bằng số lƣợng các băng và độ đậm nhạt của các băng
protein. Khi nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm có chứa Coomassie, băng protein bắt
màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lƣợ ng protein tại đó càng lớn . Số lƣợng
băng trong một giếng điê ̣n di càng nhiều ch ứng tỏ thành phần protein của mẫu càng
đa da ̣ng phong phú.

45. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
34
Trong kết quả điện di kiểm tra dịch chiết protein từ mẫu mô gan (hình 5),
chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên
xuống dƣới, chứng tỏ mẫu dịch chiết protein từ mô gan có thành phần protein đa
dạng. Tuy nhiên, các phân đoạn dịch chiết protein mô gan có độ sạch khác nhau, ở
các giếng 1, 3 (hình 5A) và giếng 1 (hình 5B), sự biểu hiện của các băng protein là
chƣa rõ ràng, hơn nữa, ở các giếng vẫn có hiện tƣợng kéo vệt dọc.
Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu dịch chiết thô bằng dung dịch acetone
100% theo tỉ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20o
C nhằm tập trung
protein có trong mẫu, đồng thời loại mỡ và các chất phi protein. Các dịch chiết sau
khi tủa đƣợc hòa lại bằng đệm lysis và trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein
đầy đủ của mô gan dùng để tiến hành bƣớc thí nghiệm tiếp theo.
3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều
Cho đến nay, kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) đã trở thành một trong những
công cụ phân tách protein đƣợc dùng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ protein.
Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau 0,1 đơn vị pI (isoelectric
point) và 1kDa về khối lƣợng phân tử [37]. Protein trong dịch chiết mô gan bình
thƣờng và mô gan ung thƣ cùng đƣợc phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel
điện di, các protein trong mẫu đƣợc phân tách thành các spot protein riêng rẽ hoặc
các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do
sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lƣợng phân
tử tƣơng tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau.
Tuy hệ protein mô gan rất phức tạp, song hàm lƣợng của các protein trong
gan khá đồng đều, do đó, các protein đƣợc phân tách khá tốt trên bản gel 2-DE
(hình 6). Khi phân tách protein mô gan trên bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài
17cm trong khoảng pH 3 - 10 (hình 6A1, B1), kết quả điện di cho thấy các protein đã
đƣợc phân tách rõ ràng thành các spot riêng rẽ nằm trải khắp bản gel và ít có những
vùng tập trung các spot protein có hàm lƣợng cao bao trùm lên các spot protein

46. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
35
khác. Tuy nhiên, ở vùng giữa bản gel trong khoảng pH 4 - 7, mật độ các spot
protein cao, do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành điện di hai chiều sử dụng thanh strip
7cm, pH 4 - 7 để phân tách protein trong khoảng pH này rõ ràng hơn (hình 6A2, B2).
A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ
Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều
Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip
dài 7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10%.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tách đƣợc hệ protein mô gan ung
thƣ và mô gan bình thƣờng của 6 bệnh nhân HCC trên cả bản gel 2-DE sử dụng
thanh strip dài 17cm, pH 3 - 10 và thanh strip dài 7cm, pH 4 - 7. Kết quả điện di
phân tách protein mô gan của bệnh nhân HCC trên bản gel 2-DE đƣợc thể hiện
trong hình 6 và phụ lục 2.

47. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
36
Bƣớc đầu sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di
hai chiều - Phoretix, chúng tôi đã xác định đƣợc tổng số spot đƣợc phân tách trên
các bản gel 2-DE (bảng 5).
Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều
Mã bệnh
nhân
Bản gel 17cm Bản gel 7cm
Mô bình thường Mô ung thư Mô bình thường Mô ung thư
8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot
8460 329 spot 288 spot 139 spot 123 spot
8935 258 spot 291 spot 53 spot 61 spot
8977 229 spot 254 spot 72 spot 91 spot
9242 275 spot 334 spot 108 spot 155 spot
10480 220 spot 268 spot 145 spot 141 spot
3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều
Phần mềm chuyên dụng Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các
protein thuộc mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng thông qua sự biểu hiện
của các spot trên các bản gel 2-DE. Phần mềm giúp xác định các spot tƣơng ứng
trên các bản gel, đƣa ra giá trị cƣờng độ khối trung bình của các spot. Ngoài ra,
phần mềm còn đƣa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot, trong đó, độ lớn của
spot đƣợc thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D, độ đậm của spot đƣợc
thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh và độ sắc nét của spot nhuộm
màu coomasie đƣợc thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D (hình 7).
Đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel.
Căn cứ vào các thông số thu đƣợc khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE,
chúng tôi có thể chỉ ra các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thƣ (+);
các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt trên bản gel mô bình thƣờng (-); các spot biểu hiện
tăng (↑) và các spot biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mô ung thƣ so với bản gel mô bình
thƣờng (hình 8).

48. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
37
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều
A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thƣ so với bản gel
mô bình thƣờng
Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định đƣợc các spot
protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng trên
từng cặp bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6)
và phân tách protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7). Các spot biểu hiện
khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu protein mô gan ung thƣ so với mô gan bình
thƣờng đƣợc minh họa ở hình 9.

49. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
38
A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ
Ghi chú: A1, B1 - Bản gel 2-DE dài 17cm, pH 3 - 10
A2, B2 - Bản gel 2-DE dài 7cm, pH 4 - 7
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thƣ so với
mô gan bình thƣờng của bệnh nhân HCC mã 8935
A1 B1
A2 B2

50. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
39
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan
bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10
8261 8460 8935 8977 9242 10480
↑ 31 16 51 23 21 39
↓ 19 33 20 22 27 21
- 7 11 2 4 1 4
+ 2 4 7 3 2 5
Tổng 59 64 80 52 51 69
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan
bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7
8460 8935 8977 9242 10480
↑ 6 17 18 11 16
↓ 9 3 10 5 8
- 5 1 1 2 1
+ 1 2 3 2 2
Tổng 21 23 32 20 27
Ghi chú: Spot protein biểu hiện tăng (↑); spot protein biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mẫu
ung thƣ so với bản gel mô bình thƣờng; spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung
thƣ (+); xuất hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thƣ (-).
Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thƣ
so với bản gel mô gan bình thƣờng của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tôi nhận thấy có
52 spot khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mô gan ung thƣ so với mô gan
bình thƣờng, bao gồm:
- 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thƣ
- 5 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô đối chứng
- 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thƣ
- 18 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thƣ.

51. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
40
Khi so sánh hình ảnh các bản gel điện di thu đƣợc trong nghiên cứu này với
hình ảnh bản gel mô gan ngƣời trong cơ sở dữ liệu SWISS-2D-PAGE [43], chúng
tôi nhận dạng đƣợc 13 protein tƣơng ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản
gel mô gan ung thƣ so với bản gel mô gan bình thƣờng (bảng 8).
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ so
với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL
STT Protein
Yếu tố
nhận dạng
protein
Cƣờng độ khối
trung bình
Biểu
hiện
ĐC HCC
1
Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease
inhibitor) (A1AT)
P01009 0,0015 0,608 +
2 Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓
3 Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − −
4 Beta-actin, cytoplasmic 1 (ACTB) P60709 0,003 4,599 +
5 Haptoglobin (HPT) P00738 0,002 0,839 +
6 Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) P12004 0,0008 0,265 +
7
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH/G3P)
P04406 0,248 − −
8 Cathepsin D (CATD) P07339 0,0007 0,124 +
9
Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial
(ECHM)
P30084 0,0005 0,129 +
10
Superoxide dismutase [Mn],
mitochondrial (SODM)
P04179 2,730 0,315 ↓
11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓
12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓
13
Glutamate dehydrogenase 1,
mitochondrial (GDH/ DHE3)
P00367 0,686 − −
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu
hiện ở mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thƣờng; ĐC, bản gel mô gan
bình thƣờng; HCC, bản gel mô gan ung thƣ.