SlideShare a Scribd company logo

Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

•
•
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận án tiến sĩ ngành hóa hữu cơ với đề tài: Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum, cho các bạn tham khảo

Education
1 of 193
FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HUẾ - NĂM 2019
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy HUẾ - NĂM 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Nghiên cứu sinh Trần Thị Ái Luyến
ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt BMM basal minimum medium Môi trường tối ưu cơ bản C Carbon Cacbon CFU/mL colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL COSY Correlated Spectroscopy DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl EPS Exopolysaccharide EPS-TC13 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC13 EPS-TC16 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC16 EPS-TC21 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC21 EPS-MC3 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 EtOH Ethanol Cồn etylic FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ Fruc Fructose FTF fructosyltransferase HePS heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp HMBC Heteronuclear multiple - Bond Correlation HoPS homopolysaccharide Polysaccharide thuần HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSQC Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence Gal galactose GalNAc N-acetyl-D-galactosamine GalT galactose 1-phosphate- uridyltransferase GC-MS Gas Chromatrography Mass Spectometry Sắc ký khí ghép khối phổ GDP guanosine diphosphate Glc glucose Glc-1-P glucose-6-phosphate Glc-6-P glucose-1-phosphate GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
iii GlcA glucuronic acid GRAS Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn GTF glycosyltransferase La. Lactococcus LAB Lactic Acid bacteria Vi khuẩn lactic Lac Lactose Lb. Lactobacillus Leu. Leuconostoc Man-6-P Mannose-6-Phosphate Man-1-P Mannose-1-Phosphate MeOH Methanol MRS Man Rogosa Sharpe MTTH Môi trường thích hợp N Nitrogen Nitơ NDP diphosphate nucleoside NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy P. Pediococcus PEP-PTS phosphoenolpyruvate- phosphotransferase PGM phosphoglucomutase PMM phosphomannomutase PS Polysaccharide Rha Rhamnose S. Streptococcus Suc Sucrose TCA trichloroacetic acid TDP tyrosine diphosphate TFA Trifluoroacetic acid TGP TDP-glucose pyrophosphorylase TMS Tetramethylsilan UDP Uridine diphosphate WPC whey protein concentration
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.....................................................................................................................i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU.........................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH....................................................................................................vii CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3 1.1. Tổng quan về polysaccharide...........................................................................3 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide..........................................................3 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide...................................................................4 1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum...........................................................5 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic........................................6 1.3.1. Khái niệm..................................................................................................6 1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa ..........................................6 1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng...........................................................14 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB ....................................20 1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS.......................................................20 1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS..................................................23 1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc .. ...........................................................................................................................24 1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe ................................34 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................37 3.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................37 3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ.......................................................................37 2.2.1. Hóa chất...................................................................................................37 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................37 3.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................38 2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD)...................................................................................................38 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] ........................................38 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS ........................................................39 2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum................................................................40 2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37]........43 2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] ........44
v 2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.................................................................................................45 2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS ...........................................................................................................................47 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN.........................................52 3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum..............................................................................................................52 3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao. ...........................................................................................................................52 3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn ...................................54 3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3........................................66 3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men ............................82 3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước..................................................................89 3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu..................................................91 3.2.3. Khả năng chống oxy hóa.........................................................................95 3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3...........................................................99 3.3.1. Khối lượng phân tử .................................................................................99 3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3.....................................................103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................128 1. Kết luận ...........................................................................................................128 2. Kiến nghị.........................................................................................................130 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ .................................................................................................................................................131 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................133 PHỤ LỤC
vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các loài Lactobacillus đã được công bố ..........................................................................22 Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng...................27 Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố.............................................................................................................29 Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố...........................................................................................35 Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS ..........50 Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong luận án .......................................................................................................................81 Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb. fermentum trong luận án............................................................................................89 Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum .................90 Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum ................92 Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum.........................93 Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) ....................................................................96 Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 ......................................................................................................103 Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3...................................................................................103 Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3...................110 Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1 H –NMR và 13 C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO .....................................................................................................................118 Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC .................................................................................................................................119 Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án....................................................................123
vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose (b) của fructose............................................................................................................3 Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum ..........................................................5 Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS ..............7 Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan ..............................7 Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB.....9 Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS ............10 Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB ...........................11 Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP- glactose......................................................................................................................12 Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB ...................................................................................................................................14 Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB....15 Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối ...........................................................38 Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS .....................................................................39 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS...................40 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.......................................................................................45 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside ...................................................................................................................................48 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS........................................49 Hình 3-1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic..............53 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum.................55 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum.............................................61 Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ............................................................................66 Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ...........................................................................................................69 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum.................................................................................................72
viii Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum.................................................................................................77 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 .............................................83 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 .............................................83 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 .............................................83 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 ..............................................84 Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS ...................................................................................................................................87 Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS .......88 Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel...........................................................................................................100 Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR...................................................111 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ...............................................................112 Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3..............................................................113 Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3.......................................................116 Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 ...............................................................117 Hình 3020. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3.............................................................118 Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 ............................................................119 Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần.........................................................................................................................120
1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, ... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…. Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình
2 lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”. Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được: 1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; 2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm; 3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về polysaccharide 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật),... [29]. Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside. Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan. Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy, hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng α và β. Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a). Ngoài ra, vòng 5 cạnh (furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình 1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật. (b)(a) a) b) Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose (b) của fructose [29]
4 Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật. Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh. Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học,... Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan thương mại từ nấm men bia [67]. 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,… Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt, từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67]. Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114]. Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film, tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất
5 chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography (HPLC)) [67], [114]. Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136]. Một trong những nguồn cung cấp các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS. 1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose... Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …), các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…). Lb. fermentum có thể tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm. Hình dạng khuẩn lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.2a). Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc Lb. fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1.2b). Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không di động [143]. a) b) Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum [143]
6 Từ lâu, Lb. fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. Bên cạnh đó, cũng giống như các loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là acid lactic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59]. Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132]. Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung đặc biệt là từ các loài Lb. fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên và an toàn. Nhờ những tính chất ưu việt độc đáo và mới lạ riêng biệt, gần đây các chế phẩm PS thương mại được khai thác từ vi sinh vật đã và đang nhận được sự quan tâm nhiều hơn. Trong luận án này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về EPS từ các chủng LAB thuộc loài Lb. fermentum. 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.3.1. Khái niệm Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều loại PS khác nhau. Tùy theo vị trí của chúng trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào hoặc ngoại bào. Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt và được gọi là PS dạng màng bao hoặc cũng có thể được gắn lỏng lẻo hoặc được bài tiết hoàn toàn ra môi trường như là các chất nhờn gọi là EPS [19], [87], [91]… Chúng là những PS chuỗi dài, phân nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của chúng [87]. 1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa
7 Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các EPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và các homopolysaccharide (HoPS) [13], [91], [115]. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào. Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme [69], [90]. - Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS) HoPS là những PS được cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) như D- glc hoặc D-fruc (Hình 1.3). Các chi thuộc LAB như Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.), Streptococcus (S.) được biết đến như là nguồn sinh tổng hợp HoPS. a) b) Màng plasmid Phần ngoại bào Tế bào chất Chất xúc tác Tín hiệu xuất Glc Fruc Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS [13] Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan [13]
8 Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyltransferase (FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ tín hiệu xuất. Sau đó chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc và fruc và tạo ra liên kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan hoặc fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào (EPS) (Hình 1.4) [13], [59]. Như vậy, sucrose chính là cơ chất được LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS. Trong quá trình này, sucrose được thủy phân thành glc và fruc như là những cơ chất mới. Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp nên các PS [27]. Các HoPS từ LAB thường có sự khác nhau về loại liên kết, mức độ phân nhánh, độ dài của chuỗi glycan, khối lượng phân tử và cấu tạo của chúng [59], [106]. Tùy vào thành phần monosaccharide tạo thành trong cấu trúc của HoPS là glc hoặc fruc mà các HoPS có thể được phân thành hai nhóm chính: glucan và fructan (Hình 1.5) [13], [92], [106]. Tóm lại, hai phân nhóm glucan và fructan là các HoPS được cấu tạo bởi các monome là các phân tử glc và fruc. Sự khác nhau giữa chúng được thể hiện qua các liên kết đặc trưng, khối lượng phân tử, độ dài và cấu tạo hóa học [28].
9 HoPS 105 – 106 Da Fructan: liên kết β - Lb. panis - Lb. pontis - Lb. frumenti Glucan Các liên kết α Các liên kết β - Lb. suebicus - Lb. G77 Mutan α-(1,3) - Lb. reuteri ML1 Dextran α-(1,6) - Lb. fermentum - Lb. sakei - Lb. parabuchneri - Lb. hilgardii Reuteran α-(1,4) - Lb. reuteri 121 - Lb. reuteri ATCC 55730 Fructosyltransferase Glucansucrase Inulin: liên kết β- (1,2) Mạch thẳng hoặc phân nhánh - Lb. reuteri Levan: liên kết β-(2,6) Mạch thẳng - Lb. reuteri 121 - Lb. sanfranciscensis Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB [13]
10 - Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS) Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểm cấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 1.6). Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lactococcus (La) lactis subsp. lactis, La. lactis subsp. cremoris, Lb. casei, Lb. sake, Lb. rhamnosus, v.v.) và các chủng ưa nhiệt (Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus và S. thermophilus) được biết đến như là nguồn tổng hợp nên các HePS từ LAB [18], [27] [29]. Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào (Hình 1.7). Đó là một chuỗi phức tạp của các phản ứng liên quan đến hệ enzyme nội bào của LAB và thường trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đường trung gian và (c) quá trình tổng hợp PS [59], [66]. (1) Sự hấp thụ cơ chất từ môi trường vào trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.7a) Đây là quá trình vận chuyển các nguồn C, chủ yếu là các monosaccharide và disaccharide, từ bên ngoài môi trường vào tế bào chất. Sau khi vào trong tế bào, hầu hết các nguồn C đều được chuyển thành glc. Quá trình này được thực hiện lặp đi lặp lại. Tùy thuộc vào loại cơ chất mà nó có thể được đưa đến các tế bào thông qua một hệ thống vận chuyển thụ động hoặc chủ động. Các hệ thống tham gia vào quá trình vận chuyển đường thường là phosphoenolpyruvate - phosphotransferase (PEP-PTS) của LAB [98]. (2) Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian (Hình 1.7b): Quá trình chuyển hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đường. Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS [13]
11 Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB [59]
12 - Sự tổng hợp glucose-1-phosphate Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa. Đây là chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp EPS và các quá trình dị hóa của sự phân giải đường. Trước hết, dưới tác dụng của hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P). Sau đó, dưới tác dụng của phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P được chuyển thành Glc-1P. - Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường: Glc-1P tiếp tục được chuyển hóa thành các nucleotide-đường (NDP) như Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDP- glc) (Hình 1.8) nhờ xúc tác của các enzyme tương ứng là UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP). Sau đó, các loại đường này tiếp tục chuyển hóa tạo nên các NDP khác bao gồm Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) do UDP-Glc chuyển thành dưới tác dụng của UDP-Gal-4-epimerase (UGE) và TDP Rhamnose (TDP-Rha) do sự chuyển hóa từ TDP-Glc dưới tác dụng xúc tác bởi TDP-glc dehydratase. Bên cạnh đó, Glc-1P cũng có thể được chuyển hóa theo hướng tạo thành Mannose-6P (Man-6P) nhờ xúc tác của enzyme phosphomannomutase (PMM). Từ Man-6P tiếp tục hình thành các TDP-glucoseUDP-glucose TDP-rhamnose UDP-galactose Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP- glactose [27]
13 hợp chất Man-1P, GDP-Man và Guanosine di phosphate fructose (GDP-Fruc) nhờ sự xúc tác lần lượt của các enzyme tương ứng là, man-1P guanylyltransferase, GDP- mannose pyrophosphorylase (GMP) và GDP-mannose dehydratase; hoặc từ Glc-1P thông qua bước gian là tạo thành fructose-6P (fruc-6P) dưới tác dụng của hexokinase. Man-6P được hình thành từ fruc-6P nhờ sự xúc tác của enzyme phosphomannoisomerase (PMI) và cuối cùng là GDP-fructose. Sự tạo thành các NDP này (UDP-glc, TDP-Rha, UDP-Gal và GDP-Fruc) có vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp EPS. Chúng chính là tiền thân của các đơn vị lặp lại góp phần tạo nên sự đa dạng trong cấu trúc của các PS từ vi khuẩn. Bên cạnh đó, Glc-6P còn được đồng phân hóa và hướng tới các sản phẩm của quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí. Pyruvate này theo chu trình Kreps và hình thành ATP (Adenosin Triphosphate) để cung cấp năng lượng cho quá trình sinh tổng hợp các nucleotide-đường trong tế bào. (3) Quá trình tổng hợp EPS (Hình 1.7c). Đây là sự lắp ráp của các đơn vị lặp đi lặp lại monosaccharide. Dưới sự xúc tác của hệ enzyme GTF, các NDP gồm UDP- glc, UDP-gal, TDP-rha, GDP-fruc kết hợp lại với nhau tạo thành một đơn vị lặp đi lặp lại trong phân tử HePS. Các phân tử lặp đi lặp lại này được đẩy lên từ bề mặt tế bào sau đó được polyme hóa để tạo thành một chất nhờn lỏng hoặc PS dạng periplasmic gắn xung quanh các tế bào và chiết xuất ra bên ngoài. Như vậy, quá trình sinh tổng hợp các HePS trước hết đòi hỏi sự tổng hợp nên các tiền chất đã được kích hoạt. Đó là các monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu là các loại NDP [42]. Các chủng thuộc LAB có thể sử dụng các monosaccharide và các disaccharide khác nhau như nguồn năng lượng trong quá trình sinh tổng hợp của chúng [27], [59]. Sự hình thành các HePS gồm một bộ khung của các đơn vị monosaccharide, các dẫn xuất của monosaccharide và luôn luôn có sự phân nhánh. Nhìn chung, sự phân nhánh cao trong HePS một phần là do các đơn vị lặp đi lặp lại tạo nên, một phần là do số lượng các monosaccharide ở các mạch bên tạo thành (có thể là một, hai, hoặc ba monosaccharide). Các monosaccharide trong HePS thường phân nhánh rất lớn với các loại liên kết khác nhau (dạng α- hoặc β-) để tạo nên bộ khung khác nhau (có thể
14 là vòng 6 cạnh – pyranose hoặc vòng 5 cạnh – furanose). Trong đó, D-galactose (Gal) có tần suất xuất hiện lớn nhất ở cả hai dạng pyranose và furanose. D-Glc chỉ có ở dạng pyranose (Hình 1.9) [13], [27], [28], [29]. Như vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn được cấu tạo bởi các monome đa dạng hơn như D-gal, L-rham, man, dạng acetyl,… và có sự phân nhánh nhiều hơn. Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấu trúc của các đơn vị lặp lại thường không cố định, trong đó, D-gal, D-glc và L-rham hầu như luôn luôn có mặt, nhưng ở tỷ lệ khác nhau [29]. Sự khác biệt giữa HoPS và HePS không chỉ thể hiện qua tính chất hoá học, bản chất của các mối liên kết mà nó còn thể hiện thông qua các enzyme tổng hợp và vị trí tổng hợp nên chúng [18]. 1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng HePS Khối lượng phân tử: từ 1x104 – 6x106 Da- Phân nhánh liên kết α, β nhánh (ở vị trí C2, C3, C4, C6) - Không phân nhánh Gồm 3 – 8 phân tử monosaccharide cấu tạo thành Các monosaccharide dạng: pyranose hoặc furanose Được tổng hợp từ các loài Lactobacillus ưa nhiệt và ưa ẩm Các monosaccharide chủ yếu gồm: - D-Glucose - D-Galactose - L-Rhamnose Ngoài ra: + Mannose, fructose, glucuronic acid + Phosphate, glucosamine, dạng acetyl, galactosamine Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB [13]
15 Do có sự đa dạng trong cấu trúc, các EPS từ vi sinh vật, đặc biệt là từ LAB đã tạo ra được những tiềm năng ứng dụng có giá trị cao, chất lượng sản phẩm hoàn toàn vượt trội so với các PS từ thực vật, tảo [87]. Bên cạnh những tác dụng nổi bật liên quan đến việc hỗ trợ về sức khỏe, các tính chất chức năng công nghệ, các ứng dụng của EPS ngày càng được mở rộng trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, dinh dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Chính vì vậy, chúng có tiềm năng để phát triển và khai thác làm phụ gia thực phẩm hoặc thành phần của thực phẩm chức năng về cả sức khỏe và lợi ích kinh tế [27]. 1.3.3.1. Chức năng liên quan đến sức khỏe Việc sử dụng các thực phẩm chứa EPS hoặc các vi khuẩn có khả năng tổng hợp nên các EPS mang lại rất nhiều lợi ích khác nhau. Trong phạm vi tổng quan của luận án này, một số chức năng liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB được giới thiệu chủ yếu như có tính probiotic và prebiotic; hoặc có hoạt tính chống ung thư, chống viêm loét dạ dày, kích thích miễn dịch, hoặc các hoạt động làm giảm cholesterol (Hình 1.10) [106], [107]. - EPS có chức năng như là prebiotic và probiotic Ruột Prebiotic và probiotic Hoạt động chống khối u (ung thư) Tham gia hệ miễn dịch - Kích thích hoạt động của đại thực bào - Giúp tăng nhanh tế bào bạch huyết - Sản sinh tế bào Chống viêm, loét dạ dày Làm giảm cholesterol trong máu Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB [106]
16 Prebiotic được biết đến là những thành phần không phải dạng sống và không tiêu hóa được, có tác dụng kích thích vi khuẩn trong ruột. Chúng thường là các oligosaccharide với mức độ polyme hóa trong phạm vi giữa 2 và 20 monome; được chuyển hóa bởi các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe và cải thiện khả năng miễn dịch để chống lại những mầm bệnh [13]. EPS là hợp chất PS. Vì vậy sự có mặt của EPS trong đường ruột có vai trò như là prebiotic. Bên cạnh tính năng prebiotic, nhiều chủng vi khuẩn thuộc LAB cũng đã được nghiên cứu và công bố về tiềm năng probiotic của chúng bao gồm Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. lactis, Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus, Lb. parasei, Lb. fermentum và Lb. helveticus. Đây cũng chính là nguồn sinh tổng hợp nên các EPS [13], [90]. Như vậy, khi sử dụng các chủng LAB trong các sản phẩm lên men lactic, một mặt chúng sinh ra EPS để làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm, mặt khác chúng cũng góp phần tạo nên tính probiotic cho sản phẩm. Bên cạnh đó, sự có mặt của các EPS này còn mang lại tính năng prebiotic giúp hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa [131]. - Chống viêm, loét dạ dày và tác động làm giảm cholesterol Tác động chống viêm loét dạ dày trên chuột của các sản phẩm sữa lên men từ các chủng S. thermophilus (CRL 1190 và CRL 804) có khả năng sinh tổng hợp EPS đã được công bố khi so sánh với sản phẩm lên men bởi các chủng không sinh tổng hợp EPS [105]. Tương tự, khả năng chống loét nhất định của EPS được sinh tổng hợp từ các chủng Bifidobacteria, Lactobacilli, và Streptococcus cũng được công bố bởi Nagaoka và cộng sự (1994) [84]; EPS tổng hợp từ Lb. rhamnosus GG có tác dụng chống lại các yếu tố miễn dịch bẩm sinh trong ruột [70]. Sự hấp thụ cholesterol của các PS đã được ghi nhận trong điều kiện in vitro bởi nhiều nhóm nghiên cứu độc lập khác nhau như Soh và cộng sự (2003) [113]; Tok và Aslim (2010) [117]… - Hoạt tính chống ung thư (kháng u), kích thích hệ miễn dịch Một số LAB và các hợp chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của chúng được chứng minh là có tác động làm tăng hệ miễn dịch của cơ thể nhờ khả năng sản sinh tế bào T (là tế bào trung gian của miễn dịch tế bào) và hoạt động tiêu diệt khối u [24], [50]. Tác động điều hòa hệ miễn dịch của các phân đoạn EPS gồm EPS trung tính và
17 EPS acid (APS) sinh tổng hợp bởi La. delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 lên chuột đã được Makino và cộng sự (2006) nghiên cứu [78]. Oda và cộng sự (1983) đã kết luận rằng EPS sinh tổng hợp bởi Lb. helveticus ssp. jugurti có khả năng chống ung thư khi thực hiện thử nghiệm trên chuột bằng cách tiêm các chế phẩm EPS vào màng bụng của chuột đã xuất hiện tế bào ung thư. Kết quả cho thấy, tuổi thọ của loài chuột này đã được tăng lên 144% khi tiêm 20 mg EPS/kg trong chín ngày liên tiếp. Khi tăng liều lượng EPS tiêm tương ứng với 40 hoặc 80 mg EPS/kg, tuổi thọ của chuột đã tăng lên hơn 233% [88]. Tương tự, kết quả nghiên cứu của Kitazawa và cộng sự (1992) đã cho thấy rằng chất nhờn được tổng hợp từ La. Lactis ssp. cremoris KVS20 có hoạt tính chống ung thư [64]. Như vậy, thông qua một số nghiên cứu trên động vật và trong thử nghiệm in vitro đã gợi ý về tác dụng có lợi đến sức khỏe liên quan đến việc sử dụng thường xuyên các EPS sinh tổng hợp từ LAB. Những nghiên cứu này đã cho thấy EPS xứng đáng là mục tiêu nghiên cứu về tiềm năng ứng dụng nhằm phục vụ về sức khỏe của con người cũng như các ứng dụng liên quan như về y tế, mỹ phẩm và dược phẩm,… Đồng thời, các EPS từ LAB có thể mở ra một hướng mới cho việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng góp phần mở rộng thị trường tiêu thụ các thực phẩm với những đặc tính tự nhiên do chính các vi khuẩn này mang lại. 1.3.3.2. Tính chất chức năng công nghệ của EPS trong thực phẩm Các polyme từ thực vật, động vật là những thành phần không thể thiếu trong một số loại thực phẩm. Từ lâu, chúng đã được sử dụng như là những thành phần giúp hoàn thiện kết cấu cho các sản phẩm thực phẩm như sự tạo gel, sự ổn định, sự nhũ tương hóa, ngăn ngừa sự kết tinh. So với các PS phân lập từ nguồn thực vật (như carrageenan, guar gum, tinh bột biến tính, glucan v.v), các PS từ vi sinh vật có lợi thế hơn với quy trình kiểm soát tốt, được sản xuất với một quy mô lớn trong một không gian và thời gian tương đối hạn chế, các đặc tính hóa học thu được ổn định và đặc biệt là đáp ứng được những yêu cầu về tính an toàn của thị trường. Việc định hướng sử dụng EPS từ LAB với mục đích làm phụ gia bổ sung vào thực phẩm hay sử dụng trực tiếp LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS làm giống khởi động cho quá trình sản xuất sản phẩm thực phẩm lên men được coi là an toàn, thành phẩm thu được là tự
18 nhiên [90]. Bên cạnh đó, các EPS cũng có những tác động quan trọng đến sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm mới (cả về thực phẩm lên men và không lên men), trong đó phải kể đến các sản phẩm thực phẩm cần được tăng cường các đặc tính lưu biến, cải thiện kết cấu và sự ổn định cũng như khả năng giữ nước [29]. Đây là những vấn đề cần giải quyết trong cấu trúc của thực phẩm và EPS từ LAB có thể giải quyết được các vấn đề này. - EPS là tác nhân tạo kết cấu Các EPS được sử dụng trong thực phẩm với chức năng chính là tác nhân làm đặc sinh học tạo nên sự ổn định và hạn chế hiện tượng tách nước của các thành phẩm trong thực phẩm lỏng phổ biến nhất là sữa chua. Khả năng này của EPS có được là nhờ sự tương tác của chúng với protein, các ion và những thành phần khác trong sản phẩm do đó giúp làm giảm hiện tượng tách nước, tăng tính ổn định cho sản phẩm, từ đó giúp thực phẩm có tính đồng nhất cao và tăng giá trị cảm quan. Bên cạnh đó, các EPS từ một số chủng LAB cũng được kết luận là góp phần cải thiện kết cấu của bột nhào trong quá trình chế biến các loại bánh sản xuất từ bột mì [16], [90]. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học đã quan tâm đến việc nghiên cứu một số tính chất hóa lý của EPS có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo nên tính chất lưu biến cho sản phẩm thực phẩm. - EPS giúp hoàn thiện tính lưu biến của các sản phẩm lên men [13]. Độ đàn hồi và độ nhớt là hai biến quan trọng trong tính chất lưu biến của thực phẩm. Chúng có ảnh hưởng lớn đến các tính chất lý hóa của sản phẩm thực phẩm đặc biệt là sản phẩm lên men. Việc sử dụng EPS nhằm cải thiện các tính chất lưu biến của sản phẩm là điều rất cần thiết. Trong các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động quá trình lên men sữa, nhiều chủng LAB đặc biệt là các loài Lactobacilli được biết đến là có khả năng sinh tổng hợp EPS. Do đó, dù lượng EPS sinh tổng hợp bởi LAB là không cao, tuy nhiên chúng cũng đủ để tạo kết cấu cho sản phẩm sữa lên men mà không cần bổ sung thêm các chất ổn định trong quá trình sản xuất [29]. Tác động hỗ trợ tích cực trong việc cải thiện kết cấu và giảm khả năng tách nước của sản phẩm sữa chua tạo thành bởi các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB sử dụng để lên men sữa đã được kết luận như EPS từ Lb. delbrueckii bulgaricus và S. thermophilus [14]; EPS từ L. lactis subsp. cremoris LC330 [79]; EPS từ Lb
19 delbrueckii ssp. bulgaricus [60]. Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các EPS được giải phóng ra bởi các loài Lactobacilli như Lb. delbrueckii bulgaricus, Lb. helveticus và Lb. casei có tác dụng thúc đẩy khả năng giữ nước và cải thiện kết cấu tổng thể của các loại pho mát khác nhau trong giai đoạn chín tới do đó giúp cấu trúc sản phẩm tạo thành ổn định hơn [13], [92], [144]. Coeuret và cộng sự (2003) kết luận rằng, quá trình hình thành pho mát phụ thuộc vào sự liên hệ giữa các chủng Lactobacilli với nhau cũng như sự hiện diện hay vắng mặt của các EPS sinh tổng hợp được [23]. Từ các công bố trên cho thấy rằng, có thể sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp EPS cao làm tác nhân vi sinh vật gây lên men trong chế biến thực phẩm. Quá trình này được thực hiện trong điều kiện in situ. EPS được sử dụng theo điều kiện này sẽ có tác động như là các tác nhân ổn định tự nhiên, có khả năng làm đặc, tạo độ nhớt cao và giảm khả năng tách nước. Công nghệ này sẽ tạo ra những sản phẩm bảo đảm tính an toàn thực phẩm cao do đó sẽ không cần sử dụng các chất phụ gia tổng hợp từ bên ngoài vào. 1.3.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa Các gốc tự do như O.- , OH. và ROS được coi là các tác nhân oxy hóa mạnh, chúng có thể phản ứng với tất cả các phân tử lớn trong tế bào dẫn đến gây ra các đột biến và ung thư. Đặc tính chống oxy hóa của các PS từ thực vật, nấm đã được nghiên cứu khá phổ biến và được sử dụng như các chất chống oxy hóa tự nhiên. Trong những năm gần đây, EPS từ các vi khuẩn thuộc LAB đã nhận được nhiều sự quan tâm hơn về tính chống oxy hóa. Các vi khuẩn có tiềm năng probiotic sinh tổng hợp EPS có thể làm giảm ung thư bằng nhiều cơ chế khác nhau thông qua hoạt động quét các gốc tự do và một phần của cơ chế đó có thể liên quan đến các EPS tổng hợp được. Chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic tổng hợp các PS ngoại bào (EPS) với những tác động sinh lý khác nhau có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp. Hoạt tính sinh học quan trọng của EPS này được đặc trưng bởi khả năng loại bỏ các phản ứng oxy hóa (ROS) - là dạng được hình thành trong ruột bởi các phản ứng trao đổi chất khác nhau, chính vì vậy chúng đã thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính chống oxy hóa của EPS từ chủng vi khuẩn này được so sánh với chất chống oxy hóa
20 là vitamin C. Kết quả cho thấy, EPS sinh từ chủng này có hoạt tính loại bỏ gốc tự do và chống oxy hóa đáng kể [65]. Khả năng loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl và chuỗi các gốc oxide của EPS sinh tổng hợp bởi hai chủng Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B-EPS) và Lactobacillus plantarum R315 (L-EPS) và cả sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được đánh giá. Kết quả cho thấy, cả B-EPS và L-EPS đều có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và các chuỗi phản ứng ROS rất tốt ở nồng độ cao. Sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được ghi nhận. Với các khả năng này, cả hai EPS tổng hợp được đều có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như là các tác nhân chống oxy hóa tự nhiên [72]. Như vậy, bên cạnh khả năng chống ung thư, giảm cholesterol, chống viêm loét dạ dày cùng các chức năng tạo cấu trúc, giúp hoàn thiện tính lưu biến đối với các sản phẩm lên men từ sữa, các EPS từ LAB cũng được biết đến với khả năng chống oxy hóa cao. Với các tính chất chức năng quan trọng này, EPS sinh tổng hợp từ LAB xứng đáng là nguồn nguyên liệu mới, tự nhiên, an toàn trong các ứng dụng công nghiệp trọng yếu liên quan đến sức khỏe con người. 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB Trong những thập kỷ qua, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về EPS sinh tổng hợp từ LAB được công bố [18], [22], [29]. Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và điều kiện thu nhận EPS; một số đặc tính lý hóa của EPS như khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu trúc cũng như một số tính chất chức năng liên quan đến ứng dụng của chúng trong công nghiệp. 1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS Mặc dù có vai trò quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn còn có nhược điểm là năng suất tạo thành thấp. Đây là lý do khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ LAB nói riêng còn khá hạn chế. Một phương pháp hữu ích để quá trình sinh tổng hợp EPS đáp ứng về phương diện ứng dụng trong thực phẩm nếu LAB có thể được lên men trong môi trường ăn được và an toàn là cải thiện quá trình lên men sinh tổng hợp EPS [59]. Năng suất của EPS từ LAB chịu tác động bởi các yếu tố vật lý (nhiệt độ, pH, thời gian lên men,…), các yếu tố hóa
21 học (nguồn C, N, tỉ lệ C/N,…) do đó có thể điều chỉnh các điều kiện lên men nhằm tăng quá trình hình thành các polyme sinh học này [19], [31], [66]. Grobben và cộng sự (1996) đã kết luận rằng, hàm lượng và thành phần của các EPS sinh tổng hợp bởi Lb. delbruckii. subsp. bulgaricus NCFB 2772 trong các môi trường chứa nguồn C khác nhau là không giống nhau [55]. Trong khi đó, công bố của Degeest và De Vuyst (1999) chỉ ra rằng, thành phần EPS tổng hợp từ S. thermophilis không có sự thay đổi khi chủng này được nuôi cấy trên các nguồn carbohydrate khác nhau [32]. Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của LAB cũng được tăng lên khi bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitrogen (N) khác nhau. Việc sử dụng các nguồn N hữu cơ dẫn đến những tác động tích cực trong việc tạo EPS có thể liên quan đến tỷ lệ carbon /nitrogen (C / N) [83]. Bên cạnh những nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn C và N lên quá trình sinh tổng hợp EPS của LAB, nhiều công bố liên quan đến sự tác động của nhiệt độ và pH lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khác nhau cũng được đề cập. Garcia-Garibay và Marshall (1991) đã kết luận rằng, sự tổng hợp EPS bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus tăng lên khi tăng nhiệt độ [48]. Ngược lại, quá trình sinh tổng hợp EPS bởi chủng S. thermophilus BN1 đạt được ở 37o C là cao hơn so với 42o C [99]. Đã có nhiều công bố về giá trị pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng LAB khác nhau là không giống nhau, tuy nhiên đa phần quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng này đều xảy ra tốt hơn ở khoảng pH gần 6,0 [44], [51], [140], [141]. Trong những năm gần đây, số lượng các nghiên cứu về điều kiện lên men sinh tổng hợp EPS có xu hướng tăng. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung cải thiện sản lượng EPS sinh tổng hợp từ LAB và tối ưu hóa các điều kiện lên men tương ứng với các nguồn vi khuẩn từ LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS cao [44], [52], [124], [136], [139],…. Đây cũng được coi là cơ sở quan trọng để làm nền tảng cho việc sử dụng chúng một cách rộng rãi vào các mục đích công nghiệp khác nhau [115]. Các thông tin về kết quả nghiên cứu cụ thể liên quan đến sự tác động của các yếu tố như thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ loài thuộc chi Lactobacillus thuộc LAB được tóm tắt ở Bảng 1.1.
22 Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các loài Lactobacillus đã được công bố STT Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Thành phần môi trường Nhiệt độ và pH của môi trường Thời gian nuôi cấy (giờ) Hàm lượng EPS (µg/ml) Tác giả (năm) [TLTK] 1 helveticus ATCC 15807 MRS có bổ sung đường lactose pH=4,5 30 280 Torino và cộng sự (2005) [118] 2 fermentum TDS030603 MRS có chứa frucose 1% 30o C, pH=6,5 72 97,1 Fukuda và cộng sự (2010) [44] 3 johnsonii 142 MRS 37o C 48 Gorska và cộng sự (2010) [52] 4 plantarum KF5 MRS bổ sung whey 30o C, pH=6,3 30 95,58 Wang và cộng sự (2010) [130] 5 fermentum F6 MRS bổ sung 10% sữa gầy, 2% glucose 370 C pH=6,5 32 44,49 Zhang và cộng sự (2011) [141] 6 fermentum CFR 2195 MRS 370 C, pH=6,7 24 28820 Yadav và cộng sự (2011) [136] 7 confusus TISTR 1498 nước dừa, 20 g/L sucrose, 5 g/L pepton, 2,5 g/L cao thịt, 2,5 g/L cao nấm 350 C, pH=5,5 24 38200 Seesuriyachan và cộng sự (2011) [111] 8 rhamnosus KL37B MRS 37o C 48 Gorska và cộng sự (2011) [54]
23 STT Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Thành phần môi trường Nhiệt độ và pH của môi trường Thời gian nuôi cấy (giờ) Hàm lượng EPS (µg/ml) Tác giả (năm) [TLTK] 9 johnsonii 151 MRS 37o C 48 Gorska và cộng sự (2013) [53] 10 plantarum YW32 MRS 37o C, pH=6,6 32 90 Wang và cộng sự (2015) [124] 11 delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 MRS bổ sung 10% sữa gầy 37o C 18 Calsteren và cộng sự (2015) [17] Từ kết quả tổng hợp ở Bảng 1.1 chúng tôi nhận thấy rằng, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn thuộc LAB. Hàm lượng EPS tổng hợp từ LAB phụ thuộc vào thành phần môi trường (nguồn C, N) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy. Mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB đều có khả năng phát triển và sinh tổng hợp EPS trong những điều kiện khác nhau. Với sự đa dạng của các nguồn cơ chất khác nhau được bổ sung thêm vào môi trường MRS thì tương ứng sẽ có sự thay đổi tương ứng về các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian. Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn có thể giống nhau về loài nhưng được phân lập từ các nguồn khác nhau thì quá trình thu nhận EPS cũng được thực hiện với các nguồn dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy không giống nhau. Như vậy, không có quy trình với những chỉ số duy nhất về điều kiện nuôi cấy để đảm bảo hiệu suất thu nhận EPS cao. 1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS Quá trình thu nhận các PS ngoại bào của vi khuẩn từ môi trường lỏng thường được thực hiện qua nhiều công đoạn: (1) Loại bỏ protein, tế bào bằng cách ly tâm hoặc lọc. Việc sử dụng acid tricloroacetic (TCA) để loại bỏ protein hoặc peptide trong môi trường lên men đã
24 được đề xuất bởi Garcia- Garibay và Marshall (1991) [48]. Phương pháp này có ưu điểm là nhanh hơn so với các kỹ thuật đã đề cập trước đó. Tuy nhiên, một tỷ lệ lớn của EPS sẽ đồng kết tủa trong TCA và do đó cần phải rửa kết tủa ít nhất một hoặc hai lần để thu nhận EPS được tốt nhất [19]; (2) Các polyme kết tủa từ dịch nổi được thu nhận bằng cách cho thêm tác nhân kết tủa. Đó là một dung môi hòa tan được trong nước trong đó các polyme là không hòa tan (chẳng hạn như methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetone). Tỉ lệ dung môi sử dụng có thể là một, hai hoặc ba so với dịch nuôi cấy; (3) Thu polyme kết tủa bằng cách sấy đông khô (quy mô phòng thí nghiệm) hoặc sấy trống (quy mô công nghiệp). Đầu tiên, các EPS kết tủa được thu nhận bằng cách ly tâm, sau đó hòa tan lại với nước cất và tiến hành thẩm tích để loại bỏ các loại đường còn lại hoặc các thành phần hòa tan khác trong môi trường. Các EPS này sau đó được đông khô ở nhiệt độ lạnh và bảo quản ở 4 °C [66]. Các phương pháp tinh chế EPS này có thể làm giảm hiệu suất thu nhận sản phẩm, vì thế việc lựa chọn quy trình thu nhận thích hợp đặc biệt là các hóa chất cần dựa vào mối tương quan giữa mức độ thu nhận sản phẩm, độ tinh khiết của sản phẩm và các tác động đến tính chất của nó [42]. Các thông số liên quan cụ thể áp dụng trong từng phương pháp tách chiết và tinh chế EPS từ LAB đã được nhiều nhóm tác giả sử dụng để thu nhận nhằm nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, về các đặc điểm lý hóa và cấu trúc của EPS như Doco và cộng sự (1990) [36], Harding và cộng sự (2005) [58], Yuksekdag và cộng sự (2008) [138], Rabha và cộng sự (2011) [99], Seesuriyachan và cộng sự (2011) [111]. 1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc Để xác định một cách đầy đủ về các đặc tính lý hóa của một PS cụ thể, việc xác định các thông tin về khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu hình các monomer và các dạng liên kết của các monome đó trong phân tử đó là điều rất cần thiết. Đây được xem là yếu tố quan trọng để hiểu rõ hơn về hoạt tính của các polyme sinh học trong các môi trường khác nhau [42], [68]. Về khối lượng phân tử trung bình Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của PS thường chỉ thể hiện là giá trị trung bình của khối lượng phân tử. Có rất nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử
25 dụng để xác định khối lượng phân tử trung bình của các polymer thuộc PS như phương pháp sắc ký trao đổi ion [21], sắc ký rây phân tử [91], phương pháp sắc ký thẩm thấu gel [10], [32],… Nguyên tắc chung của các phương pháp là dựa vào thời gian lưu của các PS được rửa giải kết hợp với mức độ khúc xạ của nó. Những phương pháp này cũng tạo điều kiện cho việc ước tính được ngay khối lượng phân tử của PS. Về thành phần hóa học Việc đánh giá thành phần hóa học của EPS liên quan đến việc xác định các phân tử đường, sự lặp lại của chúng và các nhóm phức đi kèm (nhóm acyl, nhóm phosphate,…). Sắc ký khí là phương pháp truyền thống đã được sử dụng để xác định thành phần monosaccharide, trong đó bao gồm các quá trình methyl hóa của tất cả các nhóm hydroxyl, sau đó là sự thủy phân PS thành các monosaccharide, tiếp đến quá trình alditol và acetyl hóa để tạo thành dẫn xuất alditol acetate và phân tích bằng GC-MS [58], [126]. Về cấu trúc hóa học Sự kết hợp nhiều đơn vị monome, cùng với các dạng stereo cụ thể của liên kết glycoside (α hoặc β- anome), dẫn đến các cấu trúc hóa học rất phức tạp bao gồm từ sự tuyến tính của các HoPS đến sự phân nhánh cao của các HePS. Phương pháp phân tích và xác định cấu trúc của các PS hoàn chỉnh đã được tóm tắt bởi Kamerling và Gerwig (2007) [62]. Các mô hình liên kết của các monome được phân tích bởi quá trình methyl hóa tất cả các nhóm hydroxyl, sau đó thực hiện thủy phân PS thành monosaccharide bằng acid (như TCA hoặc acid trifloroacetic (TFA)), tiếp đến là quá trình khử, acetyl hóa và phân tích GC-MS. Kết quả của GC-MS không chỉ đưa ra được thông tin về vị trí hình thành liên kết mà còn chỉ ra cấu hình hoặc các monosaccharide trong chuỗi oligosaccharide [9]. Sự suy thoái Smith (Smith degradation) cũng có thể được sử dụng để phân mảnh một cách có chọn lọc các PS. Quá trình này dựa trên ba bước liên tiếp là: oxy hóa, tiếp theo là giảm đến một polyalcohol với borohydride, và cuối cùng là thủy phân bằng acid yếu. Hơn nữa, việc làm giảm khối lượng phân tử và độ phân nhánh và làm tăng khả năng hòa tan trong dung môi của các chất cần phân tích có thể đạt được bằng cách thủy phân một phần với acid không đặc hiệu, hoặc sử dụng các enzyme đặc hiệu cho các mối liên kết
26 glycoside khác nhau. Những phân đoạn có khối lượng phân tử thấp này sau đó có thể được phân tích bằng một số kỹ thuật như GC-MS, MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight - Mass Spectometry) và NMR [42]. Trong tất cả các phương pháp phân tích cấu trúc của các oligosaccharide, NMR là phương pháp rất nhạy và có khả năng đưa ra những thông tin chi tiết về cấu trúc của chất cần phân tích. Do đó, đây cũng là phương pháp được sử dụng phổ biến để xác định về cấu hình anome của monosaccharide, loại liên kết, nhóm thế và cả những thành phần có bản chất phi-carbohydrate mà cho đến nay chưa có một phương pháp nào có thể so sánh được [9]. Phổ 1D-1 H và 13 C NMR thường được ghi lại ở nhiệt độ khoảng từ 70o C trở lên với các PS hòa tan trong D2O hoặc trong DMSO. Độ chuyển dịch hóa học được biểu diễn theo ppm với việc sử dụng acetone làm chất nội chuẩn ( của 1 H là 2,225 và của 13 C là 31,55) hoặc TMS làm chất nội chuẩn ( 0 ppm). Trong phổ proton, vùng từ trường thấp bao gồm các cộng hưởng từ của các nguyên tử anomer và các proton khác trong cấu trúc dạng vòng ở vùng có từ trường cao [68]. Sự kết hợp các kết quả từ phổ 1 H và 13 C – NMR cho phép xác định số lượng các phân tử monosaccharide trong cấu trúc phân tử. Các phổ 2D-NMR cho phép đánh giá mức độ tương tác của mỗi C hoặc H với các nguyên tử lẫn cận hoặc xa nhau trong không gian và xác định được các vị trí liên kết của chúng trong cấu trúc PS. Phổ COSY và TOCSY được sử dụng để gán các hạt nhân proton trong cấu trúc vòng. Trong khi đó, với phổ 2D HSQC và HMBC, 13 C – 1 H lại được sử dụng để gán các nguyên tử C và cung cấp các thông tin về dạng liên kết trong cấu trúc của phân tử, cấu hình anomer (như phổ HMBC, NOESY, ROESY). Mô hình liên kết của các monome được xác định bằng sự kết hợp của quá trình methyl hóa và sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Kết quả về cấu trúc của các PS này được xác định bằng cách đối chiếu với các dữ liệu phổ thư viện đã được công bố [42], [68]. Thông tin về cấu trúc và các phổ tương ứng giúp xác định chi tiết về cấu trúc PS được cụ thể hóa ở Bảng 1.2 [9].
27 Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng Thông tin về cấu trúc Các phương pháp NMR tương ứng Số lượng phân tử đường Phổ một chiều 1 H – NMR Phổ 13 C – NMR Phổ tương tác hai chiều 1 H – 1 H giúp phân tích kết nối Phổ tương quan hai chiều 1 H – 13 C Các monosaccharide cấu thành Độ chuyển dịch hóa học của 1 H – NMR Hằng số ghép JH,H trong 1 H – NMR Phổ tương quan của các hạt nhân trong cùng phân tử (COSY) Độ chuyển dịch hóa học của 13 C – NMR Phổ tương quan giữa 1 H – 13 C Cấu hình anomer Độ chuyển dịch hóa học 1 H – NMR và hằng số ghép cặp Độ chuyển dịch hóa học 13 C – NMR và hằng số ghép cặp JH,H Tương tác trong phổ NOESY Vị trí liên kết và chuỗi lặp lại Độ chuyển dịch hóa học trong 1 H và 13 C – NMR Tương tác trong phổ NOESY Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử Vị trí của các nhóm thế Độ chuyển hóa học trong 1 H và 13 C – NMR Tương tác trong phổ NOESY Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử Có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng kết hợp quá trình methyl hóa và NMR trong quá trình phân tích các đặc điểm cấu trúc của PS [11], [39], [74], [104],… Kết quả công bố về các đơn vị monosaccharide chủ yếu thường gặp trong thành phần của EPS là glc, gal và rha với tỷ lệ khác nhau [29], [87], [91]. Sự liên kết giữa các đơn vị monome trong EPS đã tạo nên bộ khung của các polyme với sự thay đổi của các loại liên kết 1,4-β- hay liên kết 1,3-β- và 1,2-α- hay các liên kết 1,6-α-glycoside. Đây cũng là cơ sở chủ yếu được sử dụng để phân loại EPS [87]. Bằng phương pháp kết hợp phân tích các mối liên kết và giải phổ NMR 1D/2D (1 H và 13 C), cấu trúc của một số EPS sinh tổng hợp bởi các chủng khác nhau thuộc loài Lb. helveticus là khác nhau là kết quả được công bố bởi Yang và cộng sự (2000) [137], Robijn và cộng sự (1995) [103]. EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. helveticus 776 có cấu trúc lặp lại của các hexasaccharide D-gal và D-glc với tỷ lệ
28 phân tử là 1:2. Trong khi đó, EPS của chủng TY1-2 là một heptamer có chứa N- acetyl-D-glucasamine. Nhóm tác giả này cũng đã công bố rằng EPS của Lb. helveticus Aki4 và Lb161 chứa các hexa- và heptasaccharide và có lần lượt 1 và 2 mạch nhánh. Nhóm tác giả này cũng cho thấy rằng chủng Lb. helveticus K16 sinh tổng hợp EPS ngoại bào là một hexasaccharide lặp lại và là một hetero-EPS của các đường gal và glc và có cấu tạo mạch nhánh. EPS từ LAB có thể là sự tổng hợp của các hỗn hợp và có cấu trúc khác nhau. Bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp các phổ 1 H, 13 C, 1D và 2D NMR, cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lactobacillus spp. G-77 được kết luận gồm hai PS có cấu trúc đơn vị monosaccharide lặp lại khác nhau [38]. Grobben và cộng sự (1996) đã sử dụng một môi trường xác định để nuôi cấy Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus NCFB 2772. Khi nuôi cấy với glc hoặc fruc, có hai EPS đã được tách chiết: một PS có khối lượng phân tử cao và một PS có khối lượng phân tử thấp nhờ phương pháp sắc ký trao đổi ion. Thành phần monome và các liên kết trong PS có khối lượng phân tử lớn thu nhận từ glc và fruc đều tương tự và xấp xỉ nhau (± 5%) đã được xác định nhờ phương pháp GC-MS. Tuy nhiên, các PS có khối lượng phân tử thấp, được sinh tổng hợp với số lượng nhỏ, và xuất hiện một thành phần monome khác nhau [55]. Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, quá trình sinh tổng hợp các EPS có cấu trúc tương tự nhau nhưng có khối lượng phân tử khác nhau. Degeest và de Vuyst (1999) công bố kết quả về việc sinh tổng hợp một phân tử EPS có khối lượng cao (1,8x 106 ) và một phân tử EPS có khối lượng thấp (4,1x105 ) từ S. thermophilus LY03 [32]. Quá trình sinh tổng hợp hai PS bởi Lb. rhamnosus cũng đã được công bố bởi Pham và cộng sự (2000). Các EPS có khối lượng phân tử thấp tạo thành được lý giải là từ quá trình thủy phân các sản phẩm có khối lượng phân tử cao do enzyme glycosyl- hydrolase xúc tác [95]. Sự đa dạng về đặc điểm lý hóa của các EPS từ các chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB từ các công trình nghiên cứu đã công bố được tóm tắt ở Bảng 1.3
29 Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. acidophilus LMG9433 D-glc: D-gal: D-glcA :2- acetamido-2- deoxy-D-glc = 2:1:1:1 β-D-GlcpNAc 4)-β-D-GlcpA-(16)-α-D-Glcp-(14)- β-D-Galp-(14)- β- D-Glcp-(1 Robijn và cộng sự (1996) [102] Lb. helveticus K16 D-glc:D-gal = 2:1 β-D-Galp β-Glcp-(12- β-D-Glcp 4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1 Yang và cộng sự (2000) [137] 1  4 1  6 1  3
30 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 291 1,4 x 106 β-D-Galp-(14)- β-D-Glcp 4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1 Faber và cộng sự (2001) [39] Lb. rhamnosus KL37C D-glc:D-gal = 1:3 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D- Glcp-(13)-β-D-Galf(1 Lipin’ski (2003) [74] Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus LBB.B332 D-glc:D-gal:L-rha = 1:2:2 3)-α-D-Glcp-(13)-α -D-Galp-(13)-α-L-Rhap -(12)-α-L- Rhap 12)- α-D-Galp-(1 Sanchez- Medina (2007) [108] Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus LBB.B26 D-glc:D-gal = 2:3 α-D-Glcp 3)-α-Galp-(13)-β-Galp-(14)- β-D-Glcp-(13)- β-D-Galf- (1 Sanchez- Medina (2007) [108] 1  6 1  6
31 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. pentosus LPS26 2,0 x 106 D-glc:D-GlcA:L- rha = 1:2:2 4)-α-D-Glcp-(13)-α -D-GlcpA4Ac-(13)-α-L-Rhap- (14)-α-D-GlcpA-(13)-β-L-Rhap2Ac-(1 Rodríguez- Carvajal và Gil-Serran (2008) [104] Lb. johnsonii 142 1,0 x 105 D-glc:D-gal = 1:4 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D- Glcp-(13)-β-D-Galf(1 Górska và cộng sự (2010) [52] Lb. rhamnosus KL37B 4)-α-D-Galp-(16)- α-D -Galp-(16)- β- D-Galp-(16)- β -D-Galf-(1 3)- β -Glcp-(1 6)- β -Galf- (16)- β -Galf-(1 α-D-Glcp-(12)- β -Glcp Górska-Fra˛ czek và cộng sự (2011) [54] Lb. johnsonii FI9785 6)-α-Glcp-(13)- β -Glcp-(15) β -Galf-(16)- α -Glcp-(1 4)- β -Galp-(1 4)- β -Glcp-(1 Dertli và cộng sự (2013) [33] 3  1
32 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. fermentum TDS030603 D-glc:D-gal = 2,6:1,0 [3)-β-D-Glcp-(13)-α -D-Glcp-(1]n Gerwig và cộng sự (2013) [49] Lb. plantarum 70810 r-EPS1: D-glc:D- man:D-gal = 18,21:78,76:3,03 r-EPS2: D-glc:D- man:D-gal = 12,92:30, 89:56,19 Wang và cộng sự (2014) [126] Lb. plantarum YW32 D-man:D-fruc: D- gal: D-glc = 8,2:1,0:4,1:4,2 Wang và cộng sự (2015) [124] 2  1 α-D-Galp 6  1 α-Glcp
33 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 5,0 x 106 D-glc:D-gal = 1,0:1,5 β-D-Galp [2)-α-D-Glcp-(13)-β-D-Glcp-(13) β-D-Galp-(14)- α-D- Galp-(1]n Calsteren và cộng sự (2015) [17] Lb. fermentum Lf2 D-glc:D-gal = 2:1 Ale và cộng sự (2016) [12] 1  4
34 Từ kết quả tổng hợp trên Bảng 1.3 cho thấy các EPS được sinh tổng hợp từ các chủng thuộc LAB có sự đa dạng về thành phần, mối liên kết, tỉ lệ các monosaccharide trong cấu trúc của chúng. Cùng một loài vi khuẩn giống nhau nhưng khả năng sinh tổng hợp EPS có thể khác nhau (có thể là HoPS hoặc là HePS). Sự khác nhau giữa các EPS tổng hợp được có thể do nguồn thu nhận các vi khuẩn này khác nhau, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy không giống nhau. Trong luận án này, để xác định cấu trúc của EPS thu được chúng tôi cũng tiến hành sử dụng phương pháp phân tích GC-MS để xác định thành phần monosaccharide, dạng liên kết và các phổ NMR nhằm khẳng định lại một số thông tin chi tiết trong cấu trúc như cấu hình anomer, thành phần monosaccharide, loại liên kết,… Ở Việt Nam, các công bố về EPS từ LAB nói chung và từ chủng Lb. fermentum nói riêng còn rất hạn chế. Đa số các nguồn cung cấp PS trong các nghiên cứu tại Việt Nam mà chúng tôi đã cập nhật được chủ yếu là từ các loài nấm [1], [8], [3], tảo [4], các loại rong [7],.. Các công trình này nghiên cứu đa phần tập trung vào điều kiện tách chiết, thu nhận, các tính chất hóa lý,…Chính vì vậy, để góp phần tạo nên sự đa dạng và phong phú hơn về nguồn thu nhận các PS, đặc biệt là các PS từ LAB, trong các nội dung của luận án, chúng tôi đã tiến hành thực hiện các nghiên cứu về điều kiện thu nhận, quá trình tách chiết cùng các tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm cũng như xác định một số đặc điểm lý hóa về cấu trúc của các EPS mới thu nhận được này. 1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe Xuất phát từ nhu cầu ngày càng tăng về các polyme tự nhiên sử dụng với nhiều ứng dụng khác nhau đã dẫn đến sự quan tâm và nghiên cứu về EPS từ vi sinh vật nói chung và từ LAB nói riêng được phát triển mạnh mẽ. Bên cạnh những tác dụng chức năng trong thực phẩm như tạo gel, tạo độ đặc, ổn định cấu trúc sản phẩm, hạn chế sự tách nước…đã được ứng dụng từ lâu, một khía cạnh khác của EPS từ LAB cũng đã được nghiên cứu phổ biến trong những năm trở lại đây như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, kích thích khả năng miễn dịch và làm giảm cholesterol. 1.4.4.1. Các tác động liên quan đến sức khỏe của EPS
35 Hoạt động chống oxy hóa của EPS (LPC-1) tách chiết từ Lb. plantarum C88 đã được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2013). Kết quả nghiên cứu cho thấy, EPS từ Lb. plantarum C88 có khả năng loại bỏ tốt đối với các gốc hydroxyl. Mặt khác, hiệu quả bảo vệ của LPC-1 đối với H2O2 – là tác nhân gây ra sự tổn thương do oxy hóa tế bào Caco-2 đã được khảo sát. Kết quả cũng đã chỉ ra rằng tổng hoạt lực chống oxy hóa (T-AOC) của LPC-1 phụ thuộc vào nồng độ; tác dụng chống oxy hóa liên quan đến khả năng làm tăng hoạt lực của enzyme và các hoạt động chống oxy hóa phi enzyme cũng như giảm sự hình thành peroxy của lipid [139]. Hoạt động chống oxy hóa của EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB cũng được công bố bởi Kodali và cộng sự (2008) [65], Li và cộng sự (2014) [73], Polak và cộng sự (2013) [96] … Một số tác động khác liên quan đến sức khỏe cũng được tổng hợp ở Bảng 1.4. Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố EPS từ các chủng vi khuẩn thuộc LAB Tác động liên quan đến sức khỏe Tác giả (năm) [TLTK] Lb. lactis subsp. cremoris SBT 0495 Hỗ trợ quá trình chuyển hóa cholesterol Nakajima và cộng sự (1992) [85] Lb. acidophilus - Giúp làm giảm sự hình thành màng sinh học từ E. coli O157:H7 Kim và cộng sự (2009) [63] Lb. reuteri Ức chế enterotoxigenic Escherichia coli gây ra sự ngưng kết hồng cầu Wang và cộng sự (2010) [129] Lb. plantarum 70810 - Ức chế chống lại các tế bào ung thư HepG-2, BGC-823 và HT-29 Wang và cộng sự (2014) [125]. Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B- EPS) và Lb. plantarum R315 (L- EPS) - Chống oxy hóa - Có hoạt tính kháng khuẩn chống lại tác nhân gây bệnh như Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Candida albicans, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, và Shigella sonnei,… Li và cộng sự (2014) [72]
36 1.4.4.2. Các tác dụng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm Trong thời gian qua, đã có rất nhiều nghiên cứu khai thác tác dụng có lợi của EPS sinh tổng hợp từ LAB được tiến hành trong điều kiện in vitro. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung quanh sữa và các sản phẩm từ sữa với vai trò của EPS tác động lên những tính chất chức năng của sản phẩm: EPS từ S. thermophiles giúp làm tăng độ ẩm, cải thiện được những đặc tính tan chảy của pho mát Mozzarella [93], làm tăng khả năng giữ ẩm [76], [92]; EPS từ S. thermophilus, S. cremoris, và Lb. bulgaricus giúp làm giảm khả năng tách nước, giảm độ cứng tương đối và độ nhớt biểu kiến [110]. Những tính chất chức năng được tạo nên nhờ có sự có mặt của các EPS (có thể được bổ sung vào hoặc được tổng hợp trực tiếp trong quá trình sản xuất sản phẩm) đã góp phần hạn chế được việc sử dụng các phụ gia tổng hợp. Từ đó giúp duy trì tính chất tự nhiên, nâng cao chất lượng sản phẩm đáp ứng được yêu cầu về mức độ an toàn cần thiết và nâng cao lòng tin của người tiêu dùng khi sử dụng những sản phẩm có sự có mặt của hợp chất này. Tóm lại, các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB đã mang lại rất lớn những tiềm năng quan trọng trong các ngành công nghiệp và đối với sức khỏe con người. Tuy nhiên, với sự đa dạng về các chủng loài các vi khuẩn, cũng như sự phong phú về nguồn phân lập các vi khuẩn này, sẽ không có sự giống nhau về điều kiện thu nhận, các đặc tính lý hóa giữa các EPS tổng hợp được. Do đó, để quá trình tổng hợp EPS từ mỗi vi khuẩn hiệu quả hơn, việc tìm ra các thông số lý hóa thích hợp như thành phần môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy là hết sức cần thiết. Bên cạnh đó, việc xác định các điều kiện tách chiết, các tính chất lý hóa tương ứng với mỗi loại EPS thu nhận khác nhau cũng như các đặc điểm về cấu trúc của các EPS này sẽ là cơ sở và nền tảng giúp chúng ta có thể sử dụng chúng trong thực tiễn tốt hơn. Đây cũng là những nội dung chính sẽ được nghiên cứu và làm sáng tỏ trong luận án.
37 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn lactic được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: Lb. fermentum TC12, Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC14, Lb. fermentum TC15, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum TC18, Lb. fermentum TC19, Lb. fermentum TC20, Lb. fermentum TC21, Lb. fermentum MC2, Lb. fermentum MC3, Lb. fermentum N9 và Lb. fermentum N10. Các chủng này được cung cấp bởi phòng thí nghiệm vi sinh, Đại học Ghent, Bỉ (BCCM/LMG: Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms/ Laboratory for Microbiology). - Các EPS được sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum được chọn. 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.2.1. Hóa chất - MeOH, CHCl3,, NaBH4, TFA, TCA (hãng Merck - Đức). - (CH3)2SO, (CH3CO)2O, C6H6, CH3COOC2H5 (hãng Daejung Chemicals & Metals - Hàn Quốc). - NaOH, HCl, NH3 đậm đặc, CH3COOH, D-glucose, H2SO4 đậm đặc, (CH3)2SO4 (Trung Quốc). - EtOH tuyệt đối 99,9% của công ty cổ phần hóa chất Đức Giang (Việt Nam). - MRS lỏng (hãng Scharlau – Tây Ban Nha) (Phụ lục 2.1) và môi trường MRS agar: có thành phần là môi trường MRS có bổ sung 10 – 15 g agar/l. 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ Máy quét phổ tử ngoại - khả kiến mẫu lỏng (UV-Vis DRS-Jacos V630, Nhật Bản). Thiết bị Bruker Avance 500MHz. Thiết bị GC-MS (Shimadzu, Nhật Bản, 2010). Hệ thống sắc ký lỏng của hãng Agilent (USA). Máy ly tâm Universal R320, Máy li tâm để bàn K241R (Hettich-Đức). Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật khác: tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng,…
38 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) Nguyên tắc: Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ lửng sẽ bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với cường độ tia sáng đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ phản ánh một cách tương đối lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường. Ngoài ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng. Do đó, lượng ánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môi trường lỏng. Để đánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế bào như các hạt rắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch tế bào nuôi cấy, đối chiếu với môi trường lỏng không có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của sinh khối vi khuẩn. Để xác định mật độ tế bào vi khuẩn, canh trường được đo OD ở bước sóng 600nm. Tham chiếu giá trị OD 600nm = 1 tương ứng với mật độ tế bào là 8*108 CFU/ml (http://www.genomics.agilent.com/biocalc…/calcODBacterial.jsp). Số ml môi trường cần hút = Số ml môi trường lên men x mật độ tế bào cần bổ sung 𝑂𝐷𝑐𝑎𝑛ℎ 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔 x 8 x 108 Đo mật độ quang trên thiết bị Thermo Spectronic Genesys 10 UV/Vis. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] Chủng Lb. fermentum từ ống giống gốc MRS agar - Cấy ria Khuẩn lạc thuần - Ủ ở 37o C, 24 giờ MRS lỏng - Ủ ở 37o C, 24 giờ - Ly tâm 5000 vòng/phút, 4o C, 5 phút - Rửa hai lần bằng 1% pepton + 0,85% NaCl (tái huyền phù) Sinh khối (điều chỉnh OD600nm = 1) (1) Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối
39 Các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 từ ống giống gốc được cấy ria trên môi trường MRS agar, và ủ trong tủ ấm ở 37o C, 24 giờ. Khuẩn lạc thuần sau đó được cấy vào môi trường MRS lỏng, ủ trong tủ ấm ở 37o C, 24 giờ. Sinh khối được thu nhận sau khi ly tâm 5000 vòng/phút ở 4o C, trong 5 phút và rửa lại 2 lần bằng dung dịch 1% pepton + 0,85% NaCl được tái huyền phù và xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm. 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS Quá trình thu nhận và tách chiết EPS được thực hiện như Yuksekdag và Aslim có sửa đổi [138]. Sinh khối tế bào thu nhận theo sơ đồ Hình 2.1 của các chủng Lb. fermentum được bổ sung vào các môi trường cần khảo sát. Tiến hành lên men ở 37o C trong 24 giờ sau đó tủa protein bởi acid trichloroacetic 30% (TCA). Dịch nổi thu được sau khi ly tâm, kết tủa EPS bởi ethanol lạnh lần 1 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Hòa tan tủa trong nước cất 50o C (khoảng 2 ml). EPS trong dịch nổi thu được sau khi ly Dịch lên men từ các chủng Lb. fermentum - Xử lý nhiệt (1000 C, 15 - 20 phút) - Làm nguội - Bổ sung 30% TCA, giữ trong 24 giờ - Ly tâm (13000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) Dịch nổi chứa EPS EPS tủa Phương pháp phenol-sulfuric - Nước cất 50o C - Bổ sung ethanol lạnh, giữ ở 4o C - Ly tâm (6000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) Môi trường dinh dưỡng - Bổ sung sinh khối tế bào - Ủ ở 37o C trong 24 giờ Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS
40 tâm được kết tủa bởi ethanol lạnh lần 2 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Kết tủa được tiếp tục hòa tan trong nước cất 50o C. Dung dịch này được xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – sulfuric. 2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum Các chủng Lb. fermentum khác nhau từ ống giống gốc Nuôi cấy thu nhận sinh khối - Điều chỉnh OD600nm=1 - Lên men trong môi trường MRS, 37o C, 48 giờ Thu nhận và tách chiết EPS Phương pháp phenol-sulfuric Chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS cao - Nuôi thu nhận sinh khối - Lên men trong các điều kiện khác nhau Làm lạnh - Bổ sung TCA ở các nồng độ khác nhau - Giữ 24 giờ Ly tâm (13000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) - Bổ sung ethanol lạnh với các tỉ lệ khác nhau, - Giữ ở 4o C Protein Ly tâm (6000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) EPS tủa Phương pháp phenol-sulfuric Phương pháp kjeldahl Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum
Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

Recommended

Ung dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc pham
Ung dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc phamUng dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc pham
Ung dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc pham
Nguyen Thanh Tu Collection
 
Đề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắng
Đề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắngĐề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắng
Đề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắng
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)
Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)
Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)
Thành Lý Phạm
 
Xac dinh ham luong protein trong sua
Xac dinh ham luong protein trong suaXac dinh ham luong protein trong sua
Xac dinh ham luong protein trong sua
Nguyen Thanh Tu Collection
 
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAYĐặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Nước ép quả đục
Nước ép quả đụcNước ép quả đục
Nước ép quả đục
Kej Ry
 
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongNghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Mai vi sinh 11111
Mai vi sinh 11111Mai vi sinh 11111
Mai vi sinh 11111
Bá Mai
 

Recommended

Ung dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc pham
Ung dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc phamUng dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc pham
Ung dung cua sac ky loc gel gfc trong phan tich thuc pham
Nguyen Thanh Tu Collection
 
Đề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắng
Đề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắngĐề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắng
Đề tài: Thành phần hóa học cao chloroform của quả mướp đắng
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)
Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)
Bài tập Truyền Khối Bách Khoa HCM (sưu tầm)
Thành Lý Phạm
 
Xac dinh ham luong protein trong sua
Xac dinh ham luong protein trong suaXac dinh ham luong protein trong sua
Xac dinh ham luong protein trong sua
Nguyen Thanh Tu Collection
 
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAYĐặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Nước ép quả đục
Nước ép quả đụcNước ép quả đục
Nước ép quả đục
Kej Ry
 
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongNghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Mai vi sinh 11111
Mai vi sinh 11111Mai vi sinh 11111
Mai vi sinh 11111
Bá Mai
 
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdfThu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Man_Ebook
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 pro
trietav
 
Xylanase
XylanaseXylanase
Xylanase
bomxuan868
 
Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...
Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...
Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Bai giang che biến thủy sản
Bai giang che biến thủy sảnBai giang che biến thủy sản
Bai giang che biến thủy sản
Food chemistry-09.1800.1595
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystumNghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đánh giá cảm quan thực phẩm
đánh giá cảm quan thực phẩmđánh giá cảm quan thực phẩm
đánh giá cảm quan thực phẩm
Food chemistry-09.1800.1595
 
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...
Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...
Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...
ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...
ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...
Thanh Hoa
 
Tcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc phamTcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc pham
hopchuanhopquy
 
Nghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdf
Nghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdfNghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdf
Nghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdf
Man_Ebook
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nướcĐề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Sấy đối lưu
Sấy đối lưuSấy đối lưu
Sấy đối lưu
*3560748*
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộc
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộcNghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộc
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộc
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năng
Đồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năngĐồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năng
Đồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năng
Nhận Viết Đề Tài Điểm Cao ZALO 0917193864 - LUANVANTRUST.COM
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
quá trình thiết bị cô đặc
quá trình thiết bị cô đặcquá trình thiết bị cô đặc
quá trình thiết bị cô đặc
trietav
 
Tính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAY
Tính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAYTính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAY
Tính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide
Tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharideTính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide
Tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 

More Related Content

What's hot

Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdfThu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Man_Ebook
 

What's hot (20)

Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdfThu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 pro
 
Xylanase
XylanaseXylanase
Xylanase
 
Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...
Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...
Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn...
 
Bai giang che biến thủy sản
Bai giang che biến thủy sảnBai giang che biến thủy sản
Bai giang che biến thủy sản
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystumNghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
 
đánh giá cảm quan thực phẩm
đánh giá cảm quan thực phẩmđánh giá cảm quan thực phẩm
đánh giá cảm quan thực phẩm
 
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
 
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
 
Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...
Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...
Khảo sát quy trình sản xuất bánh snack jojo vị gà nướng tại công ty tnhh phạm...
 
ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...
ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...
ảNh hưởng của loại bao và ẩm độ hạt đến khả năng nảy mầm của hạt lúa (oryza s...
 
Tcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc phamTcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc pham
 
Nghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdf
Nghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdfNghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdf
Nghiên cứu, xây dựng quy trình sản xuất cơm thập cẩm ăn liền.pdf
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
 
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nướcĐề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
 
Sấy đối lưu
Sấy đối lưuSấy đối lưu
Sấy đối lưu
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộc
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộcNghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộc
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước rong biển và thảo mộc
 
Đồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năng
Đồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năngĐồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năng
Đồ án công nghệ sinh học sản xuất chế biến thực phẩm chức năng
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
 
quá trình thiết bị cô đặc
quá trình thiết bị cô đặcquá trình thiết bị cô đặc
quá trình thiết bị cô đặc
 

Similar to Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...
Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...
Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
uftai-ve-tai-day28008.pdf
uftai-ve-tai-day28008.pdfuftai-ve-tai-day28008.pdf
uftai-ve-tai-day28008.pdf
hphan70
 
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
https://www.facebook.com/garmentspace
 

Similar to Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum (20)

Tính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAY
Tính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAYTính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAY
Tính chất, thành phần monosaccharide của exopolysaccharide, HAY
 
Tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide
Tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharideTính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide
Tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide
 
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
 
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tốLuận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
 
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
 
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
 
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đKháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
Kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, 9đ
 
Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...
Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...
Nghiên cứu xác định mức protein thích hợp trên cơ sở cân bằng một số axit ami...
 
Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn
Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạnPhân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn
Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn
 
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
 
Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng
Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cángThành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng
Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng
 
Đột biến của hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, 9đ
Đột biến của hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, 9đĐột biến của hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, 9đ
Đột biến của hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, 9đ
 
Khoá luận hóa hữu cơ.
Khoá luận hóa hữu cơ.Khoá luận hóa hữu cơ.
Khoá luận hóa hữu cơ.
 
uftai-ve-tai-day28008.pdf
uftai-ve-tai-day28008.pdfuftai-ve-tai-day28008.pdf
uftai-ve-tai-day28008.pdf
 
Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...
Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...
Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...
 
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
 
Đề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằm
Đề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằmĐề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằm
Đề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằm
 
Phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp. từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản ...
Phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp. từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản ...Phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp. từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản ...
Phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp. từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản ...
 
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAYLuận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
 
Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trên môi trường bán rắn đ...
Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trên môi trường bán rắn đ...Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trên môi trường bán rắn đ...
Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trên môi trường bán rắn đ...
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc
200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc
200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc
 
Danh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểmDanh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểm
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểmDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểm
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏiDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểmDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểm
 
danh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhua
danh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhuadanh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhua
danh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhua
 
Kinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay Nhất
Kinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay NhấtKinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay Nhất
Kinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay Nhất
 
Kho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểm
Kho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểmKho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểm
Kho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểm
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại họcKho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại học
 
Kho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tử
Kho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tửKho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tử
Kho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tử
 
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểmKho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểm
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu HọcKho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu Học
 
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhất
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhấtKho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhất
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhất
 
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểmKho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểm
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin HọcKho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin Học
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập Khẩu
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập KhẩuKho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập Khẩu
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập Khẩu
 

Recently uploaded

Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
mskellyworkmail
 

Recently uploaded (20)

Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...
Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...
Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...
 
Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3
Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3
Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3
 
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
 
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...
 
PHIẾU KHẢO SÁT MỨC ĐỘ HÀI LÒNG VỀ CHẤT LƯỢNG DỊCH VỤ VẬN CHUYỂN HÀNG KHÁCH BẰ...
PHIẾU KHẢO SÁT MỨC ĐỘ HÀI LÒNG VỀ CHẤT LƯỢNG DỊCH VỤ VẬN CHUYỂN HÀNG KHÁCH BẰ...PHIẾU KHẢO SÁT MỨC ĐỘ HÀI LÒNG VỀ CHẤT LƯỢNG DỊCH VỤ VẬN CHUYỂN HÀNG KHÁCH BẰ...
PHIẾU KHẢO SÁT MỨC ĐỘ HÀI LÒNG VỀ CHẤT LƯỢNG DỊCH VỤ VẬN CHUYỂN HÀNG KHÁCH BẰ...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
 
NHKTS SLIDE B2 KHAI NIEM FINTECH VA YEU TO CUNG CAU DOI MOI TRONG CN_GV HANG ...
NHKTS SLIDE B2 KHAI NIEM FINTECH VA YEU TO CUNG CAU DOI MOI TRONG CN_GV HANG ...NHKTS SLIDE B2 KHAI NIEM FINTECH VA YEU TO CUNG CAU DOI MOI TRONG CN_GV HANG ...
NHKTS SLIDE B2 KHAI NIEM FINTECH VA YEU TO CUNG CAU DOI MOI TRONG CN_GV HANG ...
 
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
 
22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...
22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...
22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...
 
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdfGiáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
 
TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...
TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...
TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...
 
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
 
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft WordTrích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
 
CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA NGÂN HÀNG THƯƠNG MẠI CỔ PHẦN...
CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA NGÂN HÀNG THƯƠNG MẠI CỔ PHẦN...CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA NGÂN HÀNG THƯƠNG MẠI CỔ PHẦN...
CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA NGÂN HÀNG THƯƠNG MẠI CỔ PHẦN...
 
Nhân vật người mang lốt cóc trong truyện cổ tích thần kỳ Việt Nam
Nhân vật người mang lốt cóc trong truyện cổ tích thần kỳ Việt NamNhân vật người mang lốt cóc trong truyện cổ tích thần kỳ Việt Nam
Nhân vật người mang lốt cóc trong truyện cổ tích thần kỳ Việt Nam
 
Kỹ năng khởi nghiệp Đổi mới sáng tạo cho sinh viên
Kỹ năng khởi nghiệp Đổi mới sáng tạo cho sinh viênKỹ năng khởi nghiệp Đổi mới sáng tạo cho sinh viên
Kỹ năng khởi nghiệp Đổi mới sáng tạo cho sinh viên
 
Giới Thiệu Về Kabala | Hành Trình Thấu Hiểu Bản Thân | Kabala.vn
Giới Thiệu Về Kabala | Hành Trình Thấu Hiểu Bản Thân | Kabala.vnGiới Thiệu Về Kabala | Hành Trình Thấu Hiểu Bản Thân | Kabala.vn
Giới Thiệu Về Kabala | Hành Trình Thấu Hiểu Bản Thân | Kabala.vn
 
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
 
Quản trị cơ sở Giáo dục nghề nghiệp
Quản trị cơ sở Giáo dục nghề nghiệpQuản trị cơ sở Giáo dục nghề nghiệp
Quản trị cơ sở Giáo dục nghề nghiệp
 

Cấu trúc, tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

  • 1. FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HUẾ - NĂM 2019
  • 2. ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy HUẾ - NĂM 2019
  • 3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Nghiên cứu sinh Trần Thị Ái Luyến
  • 4. ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt BMM basal minimum medium Môi trường tối ưu cơ bản C Carbon Cacbon CFU/mL colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL COSY Correlated Spectroscopy DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl EPS Exopolysaccharide EPS-TC13 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC13 EPS-TC16 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC16 EPS-TC21 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC21 EPS-MC3 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 EtOH Ethanol Cồn etylic FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ Fruc Fructose FTF fructosyltransferase HePS heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp HMBC Heteronuclear multiple - Bond Correlation HoPS homopolysaccharide Polysaccharide thuần HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSQC Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence Gal galactose GalNAc N-acetyl-D-galactosamine GalT galactose 1-phosphate- uridyltransferase GC-MS Gas Chromatrography Mass Spectometry Sắc ký khí ghép khối phổ GDP guanosine diphosphate Glc glucose Glc-1-P glucose-6-phosphate Glc-6-P glucose-1-phosphate GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • 5. iii GlcA glucuronic acid GRAS Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn GTF glycosyltransferase La. Lactococcus LAB Lactic Acid bacteria Vi khuẩn lactic Lac Lactose Lb. Lactobacillus Leu. Leuconostoc Man-6-P Mannose-6-Phosphate Man-1-P Mannose-1-Phosphate MeOH Methanol MRS Man Rogosa Sharpe MTTH Môi trường thích hợp N Nitrogen Nitơ NDP diphosphate nucleoside NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy P. Pediococcus PEP-PTS phosphoenolpyruvate- phosphotransferase PGM phosphoglucomutase PMM phosphomannomutase PS Polysaccharide Rha Rhamnose S. Streptococcus Suc Sucrose TCA trichloroacetic acid TDP tyrosine diphosphate TFA Trifluoroacetic acid TGP TDP-glucose pyrophosphorylase TMS Tetramethylsilan UDP Uridine diphosphate WPC whey protein concentration
  • 6. iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.....................................................................................................................i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU.........................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH....................................................................................................vii CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3 1.1. Tổng quan về polysaccharide...........................................................................3 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide..........................................................3 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide...................................................................4 1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum...........................................................5 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic........................................6 1.3.1. Khái niệm..................................................................................................6 1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa ..........................................6 1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng...........................................................14 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB ....................................20 1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS.......................................................20 1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS..................................................23 1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc .. ...........................................................................................................................24 1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe ................................34 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................37 3.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................37 3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ.......................................................................37 2.2.1. Hóa chất...................................................................................................37 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................37 3.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................38 2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD)...................................................................................................38 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] ........................................38 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS ........................................................39 2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum................................................................40 2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37]........43 2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] ........44
  • 7. v 2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.................................................................................................45 2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS ...........................................................................................................................47 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN.........................................52 3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum..............................................................................................................52 3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao. ...........................................................................................................................52 3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn ...................................54 3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3........................................66 3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men ............................82 3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước..................................................................89 3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu..................................................91 3.2.3. Khả năng chống oxy hóa.........................................................................95 3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3...........................................................99 3.3.1. Khối lượng phân tử .................................................................................99 3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3.....................................................103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................128 1. Kết luận ...........................................................................................................128 2. Kiến nghị.........................................................................................................130 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ .................................................................................................................................................131 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................133 PHỤ LỤC
  • 8. vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các loài Lactobacillus đã được công bố ..........................................................................22 Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng...................27 Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố.............................................................................................................29 Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố...........................................................................................35 Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS ..........50 Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong luận án .......................................................................................................................81 Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb. fermentum trong luận án............................................................................................89 Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum .................90 Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum ................92 Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum.........................93 Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) ....................................................................96 Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 ......................................................................................................103 Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3...................................................................................103 Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3...................110 Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1 H –NMR và 13 C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO .....................................................................................................................118 Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC .................................................................................................................................119 Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án....................................................................123
  • 9. vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose (b) của fructose............................................................................................................3 Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum ..........................................................5 Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS ..............7 Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan ..............................7 Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB.....9 Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS ............10 Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB ...........................11 Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP- glactose......................................................................................................................12 Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB ...................................................................................................................................14 Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB....15 Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối ...........................................................38 Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS .....................................................................39 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS...................40 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.......................................................................................45 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside ...................................................................................................................................48 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS........................................49 Hình 3-1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic..............53 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum.................55 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum.............................................61 Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ............................................................................66 Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ...........................................................................................................69 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum.................................................................................................72
  • 10. viii Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum.................................................................................................77 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 .............................................83 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 .............................................83 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 .............................................83 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 ..............................................84 Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS ...................................................................................................................................87 Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS .......88 Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel...........................................................................................................100 Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR...................................................111 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ...............................................................112 Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3..............................................................113 Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3.......................................................116 Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 ...............................................................117 Hình 3020. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3.............................................................118 Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 ............................................................119 Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần.........................................................................................................................120
  • 11. 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, ... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…. Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình
  • 12. 2 lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”. Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được: 1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; 2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm; 3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học.
  • 13. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về polysaccharide 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật),... [29]. Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside. Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan. Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy, hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng α và β. Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a). Ngoài ra, vòng 5 cạnh (furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình 1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật. (b)(a) a) b) Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose (b) của fructose [29]
  • 14. 4 Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật. Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh. Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học,... Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan thương mại từ nấm men bia [67]. 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,… Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt, từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67]. Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114]. Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film, tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất
  • 15. 5 chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography (HPLC)) [67], [114]. Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136]. Một trong những nguồn cung cấp các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS. 1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose... Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …), các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…). Lb. fermentum có thể tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm. Hình dạng khuẩn lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.2a). Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc Lb. fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1.2b). Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không di động [143]. a) b) Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum [143]
  • 16. 6 Từ lâu, Lb. fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. Bên cạnh đó, cũng giống như các loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là acid lactic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59]. Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132]. Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung đặc biệt là từ các loài Lb. fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên và an toàn. Nhờ những tính chất ưu việt độc đáo và mới lạ riêng biệt, gần đây các chế phẩm PS thương mại được khai thác từ vi sinh vật đã và đang nhận được sự quan tâm nhiều hơn. Trong luận án này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về EPS từ các chủng LAB thuộc loài Lb. fermentum. 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.3.1. Khái niệm Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều loại PS khác nhau. Tùy theo vị trí của chúng trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào hoặc ngoại bào. Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt và được gọi là PS dạng màng bao hoặc cũng có thể được gắn lỏng lẻo hoặc được bài tiết hoàn toàn ra môi trường như là các chất nhờn gọi là EPS [19], [87], [91]… Chúng là những PS chuỗi dài, phân nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của chúng [87]. 1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa
  • 17. 7 Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các EPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và các homopolysaccharide (HoPS) [13], [91], [115]. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào. Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme [69], [90]. - Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS) HoPS là những PS được cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) như D- glc hoặc D-fruc (Hình 1.3). Các chi thuộc LAB như Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.), Streptococcus (S.) được biết đến như là nguồn sinh tổng hợp HoPS. a) b) Màng plasmid Phần ngoại bào Tế bào chất Chất xúc tác Tín hiệu xuất Glc Fruc Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS [13] Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan [13]
  • 18. 8 Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyltransferase (FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ tín hiệu xuất. Sau đó chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc và fruc và tạo ra liên kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan hoặc fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào (EPS) (Hình 1.4) [13], [59]. Như vậy, sucrose chính là cơ chất được LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS. Trong quá trình này, sucrose được thủy phân thành glc và fruc như là những cơ chất mới. Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp nên các PS [27]. Các HoPS từ LAB thường có sự khác nhau về loại liên kết, mức độ phân nhánh, độ dài của chuỗi glycan, khối lượng phân tử và cấu tạo của chúng [59], [106]. Tùy vào thành phần monosaccharide tạo thành trong cấu trúc của HoPS là glc hoặc fruc mà các HoPS có thể được phân thành hai nhóm chính: glucan và fructan (Hình 1.5) [13], [92], [106]. Tóm lại, hai phân nhóm glucan và fructan là các HoPS được cấu tạo bởi các monome là các phân tử glc và fruc. Sự khác nhau giữa chúng được thể hiện qua các liên kết đặc trưng, khối lượng phân tử, độ dài và cấu tạo hóa học [28].
  • 19. 9 HoPS 105 – 106 Da Fructan: liên kết β - Lb. panis - Lb. pontis - Lb. frumenti Glucan Các liên kết α Các liên kết β - Lb. suebicus - Lb. G77 Mutan α-(1,3) - Lb. reuteri ML1 Dextran α-(1,6) - Lb. fermentum - Lb. sakei - Lb. parabuchneri - Lb. hilgardii Reuteran α-(1,4) - Lb. reuteri 121 - Lb. reuteri ATCC 55730 Fructosyltransferase Glucansucrase Inulin: liên kết β- (1,2) Mạch thẳng hoặc phân nhánh - Lb. reuteri Levan: liên kết β-(2,6) Mạch thẳng - Lb. reuteri 121 - Lb. sanfranciscensis Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB [13]
  • 20. 10 - Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS) Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểm cấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 1.6). Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lactococcus (La) lactis subsp. lactis, La. lactis subsp. cremoris, Lb. casei, Lb. sake, Lb. rhamnosus, v.v.) và các chủng ưa nhiệt (Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus và S. thermophilus) được biết đến như là nguồn tổng hợp nên các HePS từ LAB [18], [27] [29]. Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào (Hình 1.7). Đó là một chuỗi phức tạp của các phản ứng liên quan đến hệ enzyme nội bào của LAB và thường trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đường trung gian và (c) quá trình tổng hợp PS [59], [66]. (1) Sự hấp thụ cơ chất từ môi trường vào trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.7a) Đây là quá trình vận chuyển các nguồn C, chủ yếu là các monosaccharide và disaccharide, từ bên ngoài môi trường vào tế bào chất. Sau khi vào trong tế bào, hầu hết các nguồn C đều được chuyển thành glc. Quá trình này được thực hiện lặp đi lặp lại. Tùy thuộc vào loại cơ chất mà nó có thể được đưa đến các tế bào thông qua một hệ thống vận chuyển thụ động hoặc chủ động. Các hệ thống tham gia vào quá trình vận chuyển đường thường là phosphoenolpyruvate - phosphotransferase (PEP-PTS) của LAB [98]. (2) Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian (Hình 1.7b): Quá trình chuyển hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đường. Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS [13]
  • 21. 11 Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB [59]
  • 22. 12 - Sự tổng hợp glucose-1-phosphate Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa. Đây là chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp EPS và các quá trình dị hóa của sự phân giải đường. Trước hết, dưới tác dụng của hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P). Sau đó, dưới tác dụng của phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P được chuyển thành Glc-1P. - Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường: Glc-1P tiếp tục được chuyển hóa thành các nucleotide-đường (NDP) như Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDP- glc) (Hình 1.8) nhờ xúc tác của các enzyme tương ứng là UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP). Sau đó, các loại đường này tiếp tục chuyển hóa tạo nên các NDP khác bao gồm Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) do UDP-Glc chuyển thành dưới tác dụng của UDP-Gal-4-epimerase (UGE) và TDP Rhamnose (TDP-Rha) do sự chuyển hóa từ TDP-Glc dưới tác dụng xúc tác bởi TDP-glc dehydratase. Bên cạnh đó, Glc-1P cũng có thể được chuyển hóa theo hướng tạo thành Mannose-6P (Man-6P) nhờ xúc tác của enzyme phosphomannomutase (PMM). Từ Man-6P tiếp tục hình thành các TDP-glucoseUDP-glucose TDP-rhamnose UDP-galactose Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP- glactose [27]
  • 23. 13 hợp chất Man-1P, GDP-Man và Guanosine di phosphate fructose (GDP-Fruc) nhờ sự xúc tác lần lượt của các enzyme tương ứng là, man-1P guanylyltransferase, GDP- mannose pyrophosphorylase (GMP) và GDP-mannose dehydratase; hoặc từ Glc-1P thông qua bước gian là tạo thành fructose-6P (fruc-6P) dưới tác dụng của hexokinase. Man-6P được hình thành từ fruc-6P nhờ sự xúc tác của enzyme phosphomannoisomerase (PMI) và cuối cùng là GDP-fructose. Sự tạo thành các NDP này (UDP-glc, TDP-Rha, UDP-Gal và GDP-Fruc) có vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp EPS. Chúng chính là tiền thân của các đơn vị lặp lại góp phần tạo nên sự đa dạng trong cấu trúc của các PS từ vi khuẩn. Bên cạnh đó, Glc-6P còn được đồng phân hóa và hướng tới các sản phẩm của quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí. Pyruvate này theo chu trình Kreps và hình thành ATP (Adenosin Triphosphate) để cung cấp năng lượng cho quá trình sinh tổng hợp các nucleotide-đường trong tế bào. (3) Quá trình tổng hợp EPS (Hình 1.7c). Đây là sự lắp ráp của các đơn vị lặp đi lặp lại monosaccharide. Dưới sự xúc tác của hệ enzyme GTF, các NDP gồm UDP- glc, UDP-gal, TDP-rha, GDP-fruc kết hợp lại với nhau tạo thành một đơn vị lặp đi lặp lại trong phân tử HePS. Các phân tử lặp đi lặp lại này được đẩy lên từ bề mặt tế bào sau đó được polyme hóa để tạo thành một chất nhờn lỏng hoặc PS dạng periplasmic gắn xung quanh các tế bào và chiết xuất ra bên ngoài. Như vậy, quá trình sinh tổng hợp các HePS trước hết đòi hỏi sự tổng hợp nên các tiền chất đã được kích hoạt. Đó là các monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu là các loại NDP [42]. Các chủng thuộc LAB có thể sử dụng các monosaccharide và các disaccharide khác nhau như nguồn năng lượng trong quá trình sinh tổng hợp của chúng [27], [59]. Sự hình thành các HePS gồm một bộ khung của các đơn vị monosaccharide, các dẫn xuất của monosaccharide và luôn luôn có sự phân nhánh. Nhìn chung, sự phân nhánh cao trong HePS một phần là do các đơn vị lặp đi lặp lại tạo nên, một phần là do số lượng các monosaccharide ở các mạch bên tạo thành (có thể là một, hai, hoặc ba monosaccharide). Các monosaccharide trong HePS thường phân nhánh rất lớn với các loại liên kết khác nhau (dạng α- hoặc β-) để tạo nên bộ khung khác nhau (có thể
  • 24. 14 là vòng 6 cạnh – pyranose hoặc vòng 5 cạnh – furanose). Trong đó, D-galactose (Gal) có tần suất xuất hiện lớn nhất ở cả hai dạng pyranose và furanose. D-Glc chỉ có ở dạng pyranose (Hình 1.9) [13], [27], [28], [29]. Như vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn được cấu tạo bởi các monome đa dạng hơn như D-gal, L-rham, man, dạng acetyl,… và có sự phân nhánh nhiều hơn. Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấu trúc của các đơn vị lặp lại thường không cố định, trong đó, D-gal, D-glc và L-rham hầu như luôn luôn có mặt, nhưng ở tỷ lệ khác nhau [29]. Sự khác biệt giữa HoPS và HePS không chỉ thể hiện qua tính chất hoá học, bản chất của các mối liên kết mà nó còn thể hiện thông qua các enzyme tổng hợp và vị trí tổng hợp nên chúng [18]. 1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng HePS Khối lượng phân tử: từ 1x104 – 6x106 Da- Phân nhánh liên kết α, β nhánh (ở vị trí C2, C3, C4, C6) - Không phân nhánh Gồm 3 – 8 phân tử monosaccharide cấu tạo thành Các monosaccharide dạng: pyranose hoặc furanose Được tổng hợp từ các loài Lactobacillus ưa nhiệt và ưa ẩm Các monosaccharide chủ yếu gồm: - D-Glucose - D-Galactose - L-Rhamnose Ngoài ra: + Mannose, fructose, glucuronic acid + Phosphate, glucosamine, dạng acetyl, galactosamine Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB [13]
  • 25. 15 Do có sự đa dạng trong cấu trúc, các EPS từ vi sinh vật, đặc biệt là từ LAB đã tạo ra được những tiềm năng ứng dụng có giá trị cao, chất lượng sản phẩm hoàn toàn vượt trội so với các PS từ thực vật, tảo [87]. Bên cạnh những tác dụng nổi bật liên quan đến việc hỗ trợ về sức khỏe, các tính chất chức năng công nghệ, các ứng dụng của EPS ngày càng được mở rộng trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, dinh dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Chính vì vậy, chúng có tiềm năng để phát triển và khai thác làm phụ gia thực phẩm hoặc thành phần của thực phẩm chức năng về cả sức khỏe và lợi ích kinh tế [27]. 1.3.3.1. Chức năng liên quan đến sức khỏe Việc sử dụng các thực phẩm chứa EPS hoặc các vi khuẩn có khả năng tổng hợp nên các EPS mang lại rất nhiều lợi ích khác nhau. Trong phạm vi tổng quan của luận án này, một số chức năng liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB được giới thiệu chủ yếu như có tính probiotic và prebiotic; hoặc có hoạt tính chống ung thư, chống viêm loét dạ dày, kích thích miễn dịch, hoặc các hoạt động làm giảm cholesterol (Hình 1.10) [106], [107]. - EPS có chức năng như là prebiotic và probiotic Ruột Prebiotic và probiotic Hoạt động chống khối u (ung thư) Tham gia hệ miễn dịch - Kích thích hoạt động của đại thực bào - Giúp tăng nhanh tế bào bạch huyết - Sản sinh tế bào Chống viêm, loét dạ dày Làm giảm cholesterol trong máu Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB [106]
  • 26. 16 Prebiotic được biết đến là những thành phần không phải dạng sống và không tiêu hóa được, có tác dụng kích thích vi khuẩn trong ruột. Chúng thường là các oligosaccharide với mức độ polyme hóa trong phạm vi giữa 2 và 20 monome; được chuyển hóa bởi các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe và cải thiện khả năng miễn dịch để chống lại những mầm bệnh [13]. EPS là hợp chất PS. Vì vậy sự có mặt của EPS trong đường ruột có vai trò như là prebiotic. Bên cạnh tính năng prebiotic, nhiều chủng vi khuẩn thuộc LAB cũng đã được nghiên cứu và công bố về tiềm năng probiotic của chúng bao gồm Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. lactis, Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus, Lb. parasei, Lb. fermentum và Lb. helveticus. Đây cũng chính là nguồn sinh tổng hợp nên các EPS [13], [90]. Như vậy, khi sử dụng các chủng LAB trong các sản phẩm lên men lactic, một mặt chúng sinh ra EPS để làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm, mặt khác chúng cũng góp phần tạo nên tính probiotic cho sản phẩm. Bên cạnh đó, sự có mặt của các EPS này còn mang lại tính năng prebiotic giúp hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa [131]. - Chống viêm, loét dạ dày và tác động làm giảm cholesterol Tác động chống viêm loét dạ dày trên chuột của các sản phẩm sữa lên men từ các chủng S. thermophilus (CRL 1190 và CRL 804) có khả năng sinh tổng hợp EPS đã được công bố khi so sánh với sản phẩm lên men bởi các chủng không sinh tổng hợp EPS [105]. Tương tự, khả năng chống loét nhất định của EPS được sinh tổng hợp từ các chủng Bifidobacteria, Lactobacilli, và Streptococcus cũng được công bố bởi Nagaoka và cộng sự (1994) [84]; EPS tổng hợp từ Lb. rhamnosus GG có tác dụng chống lại các yếu tố miễn dịch bẩm sinh trong ruột [70]. Sự hấp thụ cholesterol của các PS đã được ghi nhận trong điều kiện in vitro bởi nhiều nhóm nghiên cứu độc lập khác nhau như Soh và cộng sự (2003) [113]; Tok và Aslim (2010) [117]… - Hoạt tính chống ung thư (kháng u), kích thích hệ miễn dịch Một số LAB và các hợp chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của chúng được chứng minh là có tác động làm tăng hệ miễn dịch của cơ thể nhờ khả năng sản sinh tế bào T (là tế bào trung gian của miễn dịch tế bào) và hoạt động tiêu diệt khối u [24], [50]. Tác động điều hòa hệ miễn dịch của các phân đoạn EPS gồm EPS trung tính và
  • 27. 17 EPS acid (APS) sinh tổng hợp bởi La. delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 lên chuột đã được Makino và cộng sự (2006) nghiên cứu [78]. Oda và cộng sự (1983) đã kết luận rằng EPS sinh tổng hợp bởi Lb. helveticus ssp. jugurti có khả năng chống ung thư khi thực hiện thử nghiệm trên chuột bằng cách tiêm các chế phẩm EPS vào màng bụng của chuột đã xuất hiện tế bào ung thư. Kết quả cho thấy, tuổi thọ của loài chuột này đã được tăng lên 144% khi tiêm 20 mg EPS/kg trong chín ngày liên tiếp. Khi tăng liều lượng EPS tiêm tương ứng với 40 hoặc 80 mg EPS/kg, tuổi thọ của chuột đã tăng lên hơn 233% [88]. Tương tự, kết quả nghiên cứu của Kitazawa và cộng sự (1992) đã cho thấy rằng chất nhờn được tổng hợp từ La. Lactis ssp. cremoris KVS20 có hoạt tính chống ung thư [64]. Như vậy, thông qua một số nghiên cứu trên động vật và trong thử nghiệm in vitro đã gợi ý về tác dụng có lợi đến sức khỏe liên quan đến việc sử dụng thường xuyên các EPS sinh tổng hợp từ LAB. Những nghiên cứu này đã cho thấy EPS xứng đáng là mục tiêu nghiên cứu về tiềm năng ứng dụng nhằm phục vụ về sức khỏe của con người cũng như các ứng dụng liên quan như về y tế, mỹ phẩm và dược phẩm,… Đồng thời, các EPS từ LAB có thể mở ra một hướng mới cho việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng góp phần mở rộng thị trường tiêu thụ các thực phẩm với những đặc tính tự nhiên do chính các vi khuẩn này mang lại. 1.3.3.2. Tính chất chức năng công nghệ của EPS trong thực phẩm Các polyme từ thực vật, động vật là những thành phần không thể thiếu trong một số loại thực phẩm. Từ lâu, chúng đã được sử dụng như là những thành phần giúp hoàn thiện kết cấu cho các sản phẩm thực phẩm như sự tạo gel, sự ổn định, sự nhũ tương hóa, ngăn ngừa sự kết tinh. So với các PS phân lập từ nguồn thực vật (như carrageenan, guar gum, tinh bột biến tính, glucan v.v), các PS từ vi sinh vật có lợi thế hơn với quy trình kiểm soát tốt, được sản xuất với một quy mô lớn trong một không gian và thời gian tương đối hạn chế, các đặc tính hóa học thu được ổn định và đặc biệt là đáp ứng được những yêu cầu về tính an toàn của thị trường. Việc định hướng sử dụng EPS từ LAB với mục đích làm phụ gia bổ sung vào thực phẩm hay sử dụng trực tiếp LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS làm giống khởi động cho quá trình sản xuất sản phẩm thực phẩm lên men được coi là an toàn, thành phẩm thu được là tự
  • 28. 18 nhiên [90]. Bên cạnh đó, các EPS cũng có những tác động quan trọng đến sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm mới (cả về thực phẩm lên men và không lên men), trong đó phải kể đến các sản phẩm thực phẩm cần được tăng cường các đặc tính lưu biến, cải thiện kết cấu và sự ổn định cũng như khả năng giữ nước [29]. Đây là những vấn đề cần giải quyết trong cấu trúc của thực phẩm và EPS từ LAB có thể giải quyết được các vấn đề này. - EPS là tác nhân tạo kết cấu Các EPS được sử dụng trong thực phẩm với chức năng chính là tác nhân làm đặc sinh học tạo nên sự ổn định và hạn chế hiện tượng tách nước của các thành phẩm trong thực phẩm lỏng phổ biến nhất là sữa chua. Khả năng này của EPS có được là nhờ sự tương tác của chúng với protein, các ion và những thành phần khác trong sản phẩm do đó giúp làm giảm hiện tượng tách nước, tăng tính ổn định cho sản phẩm, từ đó giúp thực phẩm có tính đồng nhất cao và tăng giá trị cảm quan. Bên cạnh đó, các EPS từ một số chủng LAB cũng được kết luận là góp phần cải thiện kết cấu của bột nhào trong quá trình chế biến các loại bánh sản xuất từ bột mì [16], [90]. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học đã quan tâm đến việc nghiên cứu một số tính chất hóa lý của EPS có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo nên tính chất lưu biến cho sản phẩm thực phẩm. - EPS giúp hoàn thiện tính lưu biến của các sản phẩm lên men [13]. Độ đàn hồi và độ nhớt là hai biến quan trọng trong tính chất lưu biến của thực phẩm. Chúng có ảnh hưởng lớn đến các tính chất lý hóa của sản phẩm thực phẩm đặc biệt là sản phẩm lên men. Việc sử dụng EPS nhằm cải thiện các tính chất lưu biến của sản phẩm là điều rất cần thiết. Trong các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động quá trình lên men sữa, nhiều chủng LAB đặc biệt là các loài Lactobacilli được biết đến là có khả năng sinh tổng hợp EPS. Do đó, dù lượng EPS sinh tổng hợp bởi LAB là không cao, tuy nhiên chúng cũng đủ để tạo kết cấu cho sản phẩm sữa lên men mà không cần bổ sung thêm các chất ổn định trong quá trình sản xuất [29]. Tác động hỗ trợ tích cực trong việc cải thiện kết cấu và giảm khả năng tách nước của sản phẩm sữa chua tạo thành bởi các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB sử dụng để lên men sữa đã được kết luận như EPS từ Lb. delbrueckii bulgaricus và S. thermophilus [14]; EPS từ L. lactis subsp. cremoris LC330 [79]; EPS từ Lb
  • 29. 19 delbrueckii ssp. bulgaricus [60]. Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các EPS được giải phóng ra bởi các loài Lactobacilli như Lb. delbrueckii bulgaricus, Lb. helveticus và Lb. casei có tác dụng thúc đẩy khả năng giữ nước và cải thiện kết cấu tổng thể của các loại pho mát khác nhau trong giai đoạn chín tới do đó giúp cấu trúc sản phẩm tạo thành ổn định hơn [13], [92], [144]. Coeuret và cộng sự (2003) kết luận rằng, quá trình hình thành pho mát phụ thuộc vào sự liên hệ giữa các chủng Lactobacilli với nhau cũng như sự hiện diện hay vắng mặt của các EPS sinh tổng hợp được [23]. Từ các công bố trên cho thấy rằng, có thể sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp EPS cao làm tác nhân vi sinh vật gây lên men trong chế biến thực phẩm. Quá trình này được thực hiện trong điều kiện in situ. EPS được sử dụng theo điều kiện này sẽ có tác động như là các tác nhân ổn định tự nhiên, có khả năng làm đặc, tạo độ nhớt cao và giảm khả năng tách nước. Công nghệ này sẽ tạo ra những sản phẩm bảo đảm tính an toàn thực phẩm cao do đó sẽ không cần sử dụng các chất phụ gia tổng hợp từ bên ngoài vào. 1.3.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa Các gốc tự do như O.- , OH. và ROS được coi là các tác nhân oxy hóa mạnh, chúng có thể phản ứng với tất cả các phân tử lớn trong tế bào dẫn đến gây ra các đột biến và ung thư. Đặc tính chống oxy hóa của các PS từ thực vật, nấm đã được nghiên cứu khá phổ biến và được sử dụng như các chất chống oxy hóa tự nhiên. Trong những năm gần đây, EPS từ các vi khuẩn thuộc LAB đã nhận được nhiều sự quan tâm hơn về tính chống oxy hóa. Các vi khuẩn có tiềm năng probiotic sinh tổng hợp EPS có thể làm giảm ung thư bằng nhiều cơ chế khác nhau thông qua hoạt động quét các gốc tự do và một phần của cơ chế đó có thể liên quan đến các EPS tổng hợp được. Chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic tổng hợp các PS ngoại bào (EPS) với những tác động sinh lý khác nhau có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp. Hoạt tính sinh học quan trọng của EPS này được đặc trưng bởi khả năng loại bỏ các phản ứng oxy hóa (ROS) - là dạng được hình thành trong ruột bởi các phản ứng trao đổi chất khác nhau, chính vì vậy chúng đã thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính chống oxy hóa của EPS từ chủng vi khuẩn này được so sánh với chất chống oxy hóa
  • 30. 20 là vitamin C. Kết quả cho thấy, EPS sinh từ chủng này có hoạt tính loại bỏ gốc tự do và chống oxy hóa đáng kể [65]. Khả năng loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl và chuỗi các gốc oxide của EPS sinh tổng hợp bởi hai chủng Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B-EPS) và Lactobacillus plantarum R315 (L-EPS) và cả sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được đánh giá. Kết quả cho thấy, cả B-EPS và L-EPS đều có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và các chuỗi phản ứng ROS rất tốt ở nồng độ cao. Sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được ghi nhận. Với các khả năng này, cả hai EPS tổng hợp được đều có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như là các tác nhân chống oxy hóa tự nhiên [72]. Như vậy, bên cạnh khả năng chống ung thư, giảm cholesterol, chống viêm loét dạ dày cùng các chức năng tạo cấu trúc, giúp hoàn thiện tính lưu biến đối với các sản phẩm lên men từ sữa, các EPS từ LAB cũng được biết đến với khả năng chống oxy hóa cao. Với các tính chất chức năng quan trọng này, EPS sinh tổng hợp từ LAB xứng đáng là nguồn nguyên liệu mới, tự nhiên, an toàn trong các ứng dụng công nghiệp trọng yếu liên quan đến sức khỏe con người. 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB Trong những thập kỷ qua, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về EPS sinh tổng hợp từ LAB được công bố [18], [22], [29]. Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và điều kiện thu nhận EPS; một số đặc tính lý hóa của EPS như khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu trúc cũng như một số tính chất chức năng liên quan đến ứng dụng của chúng trong công nghiệp. 1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS Mặc dù có vai trò quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn còn có nhược điểm là năng suất tạo thành thấp. Đây là lý do khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ LAB nói riêng còn khá hạn chế. Một phương pháp hữu ích để quá trình sinh tổng hợp EPS đáp ứng về phương diện ứng dụng trong thực phẩm nếu LAB có thể được lên men trong môi trường ăn được và an toàn là cải thiện quá trình lên men sinh tổng hợp EPS [59]. Năng suất của EPS từ LAB chịu tác động bởi các yếu tố vật lý (nhiệt độ, pH, thời gian lên men,…), các yếu tố hóa
  • 31. 21 học (nguồn C, N, tỉ lệ C/N,…) do đó có thể điều chỉnh các điều kiện lên men nhằm tăng quá trình hình thành các polyme sinh học này [19], [31], [66]. Grobben và cộng sự (1996) đã kết luận rằng, hàm lượng và thành phần của các EPS sinh tổng hợp bởi Lb. delbruckii. subsp. bulgaricus NCFB 2772 trong các môi trường chứa nguồn C khác nhau là không giống nhau [55]. Trong khi đó, công bố của Degeest và De Vuyst (1999) chỉ ra rằng, thành phần EPS tổng hợp từ S. thermophilis không có sự thay đổi khi chủng này được nuôi cấy trên các nguồn carbohydrate khác nhau [32]. Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của LAB cũng được tăng lên khi bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitrogen (N) khác nhau. Việc sử dụng các nguồn N hữu cơ dẫn đến những tác động tích cực trong việc tạo EPS có thể liên quan đến tỷ lệ carbon /nitrogen (C / N) [83]. Bên cạnh những nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn C và N lên quá trình sinh tổng hợp EPS của LAB, nhiều công bố liên quan đến sự tác động của nhiệt độ và pH lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khác nhau cũng được đề cập. Garcia-Garibay và Marshall (1991) đã kết luận rằng, sự tổng hợp EPS bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus tăng lên khi tăng nhiệt độ [48]. Ngược lại, quá trình sinh tổng hợp EPS bởi chủng S. thermophilus BN1 đạt được ở 37o C là cao hơn so với 42o C [99]. Đã có nhiều công bố về giá trị pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng LAB khác nhau là không giống nhau, tuy nhiên đa phần quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng này đều xảy ra tốt hơn ở khoảng pH gần 6,0 [44], [51], [140], [141]. Trong những năm gần đây, số lượng các nghiên cứu về điều kiện lên men sinh tổng hợp EPS có xu hướng tăng. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung cải thiện sản lượng EPS sinh tổng hợp từ LAB và tối ưu hóa các điều kiện lên men tương ứng với các nguồn vi khuẩn từ LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS cao [44], [52], [124], [136], [139],…. Đây cũng được coi là cơ sở quan trọng để làm nền tảng cho việc sử dụng chúng một cách rộng rãi vào các mục đích công nghiệp khác nhau [115]. Các thông tin về kết quả nghiên cứu cụ thể liên quan đến sự tác động của các yếu tố như thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ loài thuộc chi Lactobacillus thuộc LAB được tóm tắt ở Bảng 1.1.
  • 32. 22 Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các loài Lactobacillus đã được công bố STT Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Thành phần môi trường Nhiệt độ và pH của môi trường Thời gian nuôi cấy (giờ) Hàm lượng EPS (µg/ml) Tác giả (năm) [TLTK] 1 helveticus ATCC 15807 MRS có bổ sung đường lactose pH=4,5 30 280 Torino và cộng sự (2005) [118] 2 fermentum TDS030603 MRS có chứa frucose 1% 30o C, pH=6,5 72 97,1 Fukuda và cộng sự (2010) [44] 3 johnsonii 142 MRS 37o C 48 Gorska và cộng sự (2010) [52] 4 plantarum KF5 MRS bổ sung whey 30o C, pH=6,3 30 95,58 Wang và cộng sự (2010) [130] 5 fermentum F6 MRS bổ sung 10% sữa gầy, 2% glucose 370 C pH=6,5 32 44,49 Zhang và cộng sự (2011) [141] 6 fermentum CFR 2195 MRS 370 C, pH=6,7 24 28820 Yadav và cộng sự (2011) [136] 7 confusus TISTR 1498 nước dừa, 20 g/L sucrose, 5 g/L pepton, 2,5 g/L cao thịt, 2,5 g/L cao nấm 350 C, pH=5,5 24 38200 Seesuriyachan và cộng sự (2011) [111] 8 rhamnosus KL37B MRS 37o C 48 Gorska và cộng sự (2011) [54]
  • 33. 23 STT Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Thành phần môi trường Nhiệt độ và pH của môi trường Thời gian nuôi cấy (giờ) Hàm lượng EPS (µg/ml) Tác giả (năm) [TLTK] 9 johnsonii 151 MRS 37o C 48 Gorska và cộng sự (2013) [53] 10 plantarum YW32 MRS 37o C, pH=6,6 32 90 Wang và cộng sự (2015) [124] 11 delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 MRS bổ sung 10% sữa gầy 37o C 18 Calsteren và cộng sự (2015) [17] Từ kết quả tổng hợp ở Bảng 1.1 chúng tôi nhận thấy rằng, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn thuộc LAB. Hàm lượng EPS tổng hợp từ LAB phụ thuộc vào thành phần môi trường (nguồn C, N) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy. Mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB đều có khả năng phát triển và sinh tổng hợp EPS trong những điều kiện khác nhau. Với sự đa dạng của các nguồn cơ chất khác nhau được bổ sung thêm vào môi trường MRS thì tương ứng sẽ có sự thay đổi tương ứng về các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian. Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn có thể giống nhau về loài nhưng được phân lập từ các nguồn khác nhau thì quá trình thu nhận EPS cũng được thực hiện với các nguồn dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy không giống nhau. Như vậy, không có quy trình với những chỉ số duy nhất về điều kiện nuôi cấy để đảm bảo hiệu suất thu nhận EPS cao. 1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS Quá trình thu nhận các PS ngoại bào của vi khuẩn từ môi trường lỏng thường được thực hiện qua nhiều công đoạn: (1) Loại bỏ protein, tế bào bằng cách ly tâm hoặc lọc. Việc sử dụng acid tricloroacetic (TCA) để loại bỏ protein hoặc peptide trong môi trường lên men đã
  • 34. 24 được đề xuất bởi Garcia- Garibay và Marshall (1991) [48]. Phương pháp này có ưu điểm là nhanh hơn so với các kỹ thuật đã đề cập trước đó. Tuy nhiên, một tỷ lệ lớn của EPS sẽ đồng kết tủa trong TCA và do đó cần phải rửa kết tủa ít nhất một hoặc hai lần để thu nhận EPS được tốt nhất [19]; (2) Các polyme kết tủa từ dịch nổi được thu nhận bằng cách cho thêm tác nhân kết tủa. Đó là một dung môi hòa tan được trong nước trong đó các polyme là không hòa tan (chẳng hạn như methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetone). Tỉ lệ dung môi sử dụng có thể là một, hai hoặc ba so với dịch nuôi cấy; (3) Thu polyme kết tủa bằng cách sấy đông khô (quy mô phòng thí nghiệm) hoặc sấy trống (quy mô công nghiệp). Đầu tiên, các EPS kết tủa được thu nhận bằng cách ly tâm, sau đó hòa tan lại với nước cất và tiến hành thẩm tích để loại bỏ các loại đường còn lại hoặc các thành phần hòa tan khác trong môi trường. Các EPS này sau đó được đông khô ở nhiệt độ lạnh và bảo quản ở 4 °C [66]. Các phương pháp tinh chế EPS này có thể làm giảm hiệu suất thu nhận sản phẩm, vì thế việc lựa chọn quy trình thu nhận thích hợp đặc biệt là các hóa chất cần dựa vào mối tương quan giữa mức độ thu nhận sản phẩm, độ tinh khiết của sản phẩm và các tác động đến tính chất của nó [42]. Các thông số liên quan cụ thể áp dụng trong từng phương pháp tách chiết và tinh chế EPS từ LAB đã được nhiều nhóm tác giả sử dụng để thu nhận nhằm nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, về các đặc điểm lý hóa và cấu trúc của EPS như Doco và cộng sự (1990) [36], Harding và cộng sự (2005) [58], Yuksekdag và cộng sự (2008) [138], Rabha và cộng sự (2011) [99], Seesuriyachan và cộng sự (2011) [111]. 1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc Để xác định một cách đầy đủ về các đặc tính lý hóa của một PS cụ thể, việc xác định các thông tin về khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu hình các monomer và các dạng liên kết của các monome đó trong phân tử đó là điều rất cần thiết. Đây được xem là yếu tố quan trọng để hiểu rõ hơn về hoạt tính của các polyme sinh học trong các môi trường khác nhau [42], [68]. Về khối lượng phân tử trung bình Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của PS thường chỉ thể hiện là giá trị trung bình của khối lượng phân tử. Có rất nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử
  • 35. 25 dụng để xác định khối lượng phân tử trung bình của các polymer thuộc PS như phương pháp sắc ký trao đổi ion [21], sắc ký rây phân tử [91], phương pháp sắc ký thẩm thấu gel [10], [32],… Nguyên tắc chung của các phương pháp là dựa vào thời gian lưu của các PS được rửa giải kết hợp với mức độ khúc xạ của nó. Những phương pháp này cũng tạo điều kiện cho việc ước tính được ngay khối lượng phân tử của PS. Về thành phần hóa học Việc đánh giá thành phần hóa học của EPS liên quan đến việc xác định các phân tử đường, sự lặp lại của chúng và các nhóm phức đi kèm (nhóm acyl, nhóm phosphate,…). Sắc ký khí là phương pháp truyền thống đã được sử dụng để xác định thành phần monosaccharide, trong đó bao gồm các quá trình methyl hóa của tất cả các nhóm hydroxyl, sau đó là sự thủy phân PS thành các monosaccharide, tiếp đến quá trình alditol và acetyl hóa để tạo thành dẫn xuất alditol acetate và phân tích bằng GC-MS [58], [126]. Về cấu trúc hóa học Sự kết hợp nhiều đơn vị monome, cùng với các dạng stereo cụ thể của liên kết glycoside (α hoặc β- anome), dẫn đến các cấu trúc hóa học rất phức tạp bao gồm từ sự tuyến tính của các HoPS đến sự phân nhánh cao của các HePS. Phương pháp phân tích và xác định cấu trúc của các PS hoàn chỉnh đã được tóm tắt bởi Kamerling và Gerwig (2007) [62]. Các mô hình liên kết của các monome được phân tích bởi quá trình methyl hóa tất cả các nhóm hydroxyl, sau đó thực hiện thủy phân PS thành monosaccharide bằng acid (như TCA hoặc acid trifloroacetic (TFA)), tiếp đến là quá trình khử, acetyl hóa và phân tích GC-MS. Kết quả của GC-MS không chỉ đưa ra được thông tin về vị trí hình thành liên kết mà còn chỉ ra cấu hình hoặc các monosaccharide trong chuỗi oligosaccharide [9]. Sự suy thoái Smith (Smith degradation) cũng có thể được sử dụng để phân mảnh một cách có chọn lọc các PS. Quá trình này dựa trên ba bước liên tiếp là: oxy hóa, tiếp theo là giảm đến một polyalcohol với borohydride, và cuối cùng là thủy phân bằng acid yếu. Hơn nữa, việc làm giảm khối lượng phân tử và độ phân nhánh và làm tăng khả năng hòa tan trong dung môi của các chất cần phân tích có thể đạt được bằng cách thủy phân một phần với acid không đặc hiệu, hoặc sử dụng các enzyme đặc hiệu cho các mối liên kết
  • 36. 26 glycoside khác nhau. Những phân đoạn có khối lượng phân tử thấp này sau đó có thể được phân tích bằng một số kỹ thuật như GC-MS, MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight - Mass Spectometry) và NMR [42]. Trong tất cả các phương pháp phân tích cấu trúc của các oligosaccharide, NMR là phương pháp rất nhạy và có khả năng đưa ra những thông tin chi tiết về cấu trúc của chất cần phân tích. Do đó, đây cũng là phương pháp được sử dụng phổ biến để xác định về cấu hình anome của monosaccharide, loại liên kết, nhóm thế và cả những thành phần có bản chất phi-carbohydrate mà cho đến nay chưa có một phương pháp nào có thể so sánh được [9]. Phổ 1D-1 H và 13 C NMR thường được ghi lại ở nhiệt độ khoảng từ 70o C trở lên với các PS hòa tan trong D2O hoặc trong DMSO. Độ chuyển dịch hóa học được biểu diễn theo ppm với việc sử dụng acetone làm chất nội chuẩn ( của 1 H là 2,225 và của 13 C là 31,55) hoặc TMS làm chất nội chuẩn ( 0 ppm). Trong phổ proton, vùng từ trường thấp bao gồm các cộng hưởng từ của các nguyên tử anomer và các proton khác trong cấu trúc dạng vòng ở vùng có từ trường cao [68]. Sự kết hợp các kết quả từ phổ 1 H và 13 C – NMR cho phép xác định số lượng các phân tử monosaccharide trong cấu trúc phân tử. Các phổ 2D-NMR cho phép đánh giá mức độ tương tác của mỗi C hoặc H với các nguyên tử lẫn cận hoặc xa nhau trong không gian và xác định được các vị trí liên kết của chúng trong cấu trúc PS. Phổ COSY và TOCSY được sử dụng để gán các hạt nhân proton trong cấu trúc vòng. Trong khi đó, với phổ 2D HSQC và HMBC, 13 C – 1 H lại được sử dụng để gán các nguyên tử C và cung cấp các thông tin về dạng liên kết trong cấu trúc của phân tử, cấu hình anomer (như phổ HMBC, NOESY, ROESY). Mô hình liên kết của các monome được xác định bằng sự kết hợp của quá trình methyl hóa và sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Kết quả về cấu trúc của các PS này được xác định bằng cách đối chiếu với các dữ liệu phổ thư viện đã được công bố [42], [68]. Thông tin về cấu trúc và các phổ tương ứng giúp xác định chi tiết về cấu trúc PS được cụ thể hóa ở Bảng 1.2 [9].
  • 37. 27 Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng Thông tin về cấu trúc Các phương pháp NMR tương ứng Số lượng phân tử đường Phổ một chiều 1 H – NMR Phổ 13 C – NMR Phổ tương tác hai chiều 1 H – 1 H giúp phân tích kết nối Phổ tương quan hai chiều 1 H – 13 C Các monosaccharide cấu thành Độ chuyển dịch hóa học của 1 H – NMR Hằng số ghép JH,H trong 1 H – NMR Phổ tương quan của các hạt nhân trong cùng phân tử (COSY) Độ chuyển dịch hóa học của 13 C – NMR Phổ tương quan giữa 1 H – 13 C Cấu hình anomer Độ chuyển dịch hóa học 1 H – NMR và hằng số ghép cặp Độ chuyển dịch hóa học 13 C – NMR và hằng số ghép cặp JH,H Tương tác trong phổ NOESY Vị trí liên kết và chuỗi lặp lại Độ chuyển dịch hóa học trong 1 H và 13 C – NMR Tương tác trong phổ NOESY Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử Vị trí của các nhóm thế Độ chuyển hóa học trong 1 H và 13 C – NMR Tương tác trong phổ NOESY Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử Có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng kết hợp quá trình methyl hóa và NMR trong quá trình phân tích các đặc điểm cấu trúc của PS [11], [39], [74], [104],… Kết quả công bố về các đơn vị monosaccharide chủ yếu thường gặp trong thành phần của EPS là glc, gal và rha với tỷ lệ khác nhau [29], [87], [91]. Sự liên kết giữa các đơn vị monome trong EPS đã tạo nên bộ khung của các polyme với sự thay đổi của các loại liên kết 1,4-β- hay liên kết 1,3-β- và 1,2-α- hay các liên kết 1,6-α-glycoside. Đây cũng là cơ sở chủ yếu được sử dụng để phân loại EPS [87]. Bằng phương pháp kết hợp phân tích các mối liên kết và giải phổ NMR 1D/2D (1 H và 13 C), cấu trúc của một số EPS sinh tổng hợp bởi các chủng khác nhau thuộc loài Lb. helveticus là khác nhau là kết quả được công bố bởi Yang và cộng sự (2000) [137], Robijn và cộng sự (1995) [103]. EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. helveticus 776 có cấu trúc lặp lại của các hexasaccharide D-gal và D-glc với tỷ lệ
  • 38. 28 phân tử là 1:2. Trong khi đó, EPS của chủng TY1-2 là một heptamer có chứa N- acetyl-D-glucasamine. Nhóm tác giả này cũng đã công bố rằng EPS của Lb. helveticus Aki4 và Lb161 chứa các hexa- và heptasaccharide và có lần lượt 1 và 2 mạch nhánh. Nhóm tác giả này cũng cho thấy rằng chủng Lb. helveticus K16 sinh tổng hợp EPS ngoại bào là một hexasaccharide lặp lại và là một hetero-EPS của các đường gal và glc và có cấu tạo mạch nhánh. EPS từ LAB có thể là sự tổng hợp của các hỗn hợp và có cấu trúc khác nhau. Bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp các phổ 1 H, 13 C, 1D và 2D NMR, cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lactobacillus spp. G-77 được kết luận gồm hai PS có cấu trúc đơn vị monosaccharide lặp lại khác nhau [38]. Grobben và cộng sự (1996) đã sử dụng một môi trường xác định để nuôi cấy Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus NCFB 2772. Khi nuôi cấy với glc hoặc fruc, có hai EPS đã được tách chiết: một PS có khối lượng phân tử cao và một PS có khối lượng phân tử thấp nhờ phương pháp sắc ký trao đổi ion. Thành phần monome và các liên kết trong PS có khối lượng phân tử lớn thu nhận từ glc và fruc đều tương tự và xấp xỉ nhau (± 5%) đã được xác định nhờ phương pháp GC-MS. Tuy nhiên, các PS có khối lượng phân tử thấp, được sinh tổng hợp với số lượng nhỏ, và xuất hiện một thành phần monome khác nhau [55]. Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, quá trình sinh tổng hợp các EPS có cấu trúc tương tự nhau nhưng có khối lượng phân tử khác nhau. Degeest và de Vuyst (1999) công bố kết quả về việc sinh tổng hợp một phân tử EPS có khối lượng cao (1,8x 106 ) và một phân tử EPS có khối lượng thấp (4,1x105 ) từ S. thermophilus LY03 [32]. Quá trình sinh tổng hợp hai PS bởi Lb. rhamnosus cũng đã được công bố bởi Pham và cộng sự (2000). Các EPS có khối lượng phân tử thấp tạo thành được lý giải là từ quá trình thủy phân các sản phẩm có khối lượng phân tử cao do enzyme glycosyl- hydrolase xúc tác [95]. Sự đa dạng về đặc điểm lý hóa của các EPS từ các chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB từ các công trình nghiên cứu đã công bố được tóm tắt ở Bảng 1.3
  • 39. 29 Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. acidophilus LMG9433 D-glc: D-gal: D-glcA :2- acetamido-2- deoxy-D-glc = 2:1:1:1 β-D-GlcpNAc 4)-β-D-GlcpA-(16)-α-D-Glcp-(14)- β-D-Galp-(14)- β- D-Glcp-(1 Robijn và cộng sự (1996) [102] Lb. helveticus K16 D-glc:D-gal = 2:1 β-D-Galp β-Glcp-(12- β-D-Glcp 4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1 Yang và cộng sự (2000) [137] 1  4 1  6 1  3
  • 40. 30 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 291 1,4 x 106 β-D-Galp-(14)- β-D-Glcp 4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1 Faber và cộng sự (2001) [39] Lb. rhamnosus KL37C D-glc:D-gal = 1:3 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D- Glcp-(13)-β-D-Galf(1 Lipin’ski (2003) [74] Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus LBB.B332 D-glc:D-gal:L-rha = 1:2:2 3)-α-D-Glcp-(13)-α -D-Galp-(13)-α-L-Rhap -(12)-α-L- Rhap 12)- α-D-Galp-(1 Sanchez- Medina (2007) [108] Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus LBB.B26 D-glc:D-gal = 2:3 α-D-Glcp 3)-α-Galp-(13)-β-Galp-(14)- β-D-Glcp-(13)- β-D-Galf- (1 Sanchez- Medina (2007) [108] 1  6 1  6
  • 41. 31 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. pentosus LPS26 2,0 x 106 D-glc:D-GlcA:L- rha = 1:2:2 4)-α-D-Glcp-(13)-α -D-GlcpA4Ac-(13)-α-L-Rhap- (14)-α-D-GlcpA-(13)-β-L-Rhap2Ac-(1 Rodríguez- Carvajal và Gil-Serran (2008) [104] Lb. johnsonii 142 1,0 x 105 D-glc:D-gal = 1:4 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D- Glcp-(13)-β-D-Galf(1 Górska và cộng sự (2010) [52] Lb. rhamnosus KL37B 4)-α-D-Galp-(16)- α-D -Galp-(16)- β- D-Galp-(16)- β -D-Galf-(1 3)- β -Glcp-(1 6)- β -Galf- (16)- β -Galf-(1 α-D-Glcp-(12)- β -Glcp Górska-Fra˛ czek và cộng sự (2011) [54] Lb. johnsonii FI9785 6)-α-Glcp-(13)- β -Glcp-(15) β -Galf-(16)- α -Glcp-(1 4)- β -Galp-(1 4)- β -Glcp-(1 Dertli và cộng sự (2013) [33] 3  1
  • 42. 32 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. fermentum TDS030603 D-glc:D-gal = 2,6:1,0 [3)-β-D-Glcp-(13)-α -D-Glcp-(1]n Gerwig và cộng sự (2013) [49] Lb. plantarum 70810 r-EPS1: D-glc:D- man:D-gal = 18,21:78,76:3,03 r-EPS2: D-glc:D- man:D-gal = 12,92:30, 89:56,19 Wang và cộng sự (2014) [126] Lb. plantarum YW32 D-man:D-fruc: D- gal: D-glc = 8,2:1,0:4,1:4,2 Wang và cộng sự (2015) [124] 2  1 α-D-Galp 6  1 α-Glcp
  • 43. 33 Chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (Lb.) Khối lượng phân tử (Da) Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm) [TLTK] Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 5,0 x 106 D-glc:D-gal = 1,0:1,5 β-D-Galp [2)-α-D-Glcp-(13)-β-D-Glcp-(13) β-D-Galp-(14)- α-D- Galp-(1]n Calsteren và cộng sự (2015) [17] Lb. fermentum Lf2 D-glc:D-gal = 2:1 Ale và cộng sự (2016) [12] 1  4
  • 44. 34 Từ kết quả tổng hợp trên Bảng 1.3 cho thấy các EPS được sinh tổng hợp từ các chủng thuộc LAB có sự đa dạng về thành phần, mối liên kết, tỉ lệ các monosaccharide trong cấu trúc của chúng. Cùng một loài vi khuẩn giống nhau nhưng khả năng sinh tổng hợp EPS có thể khác nhau (có thể là HoPS hoặc là HePS). Sự khác nhau giữa các EPS tổng hợp được có thể do nguồn thu nhận các vi khuẩn này khác nhau, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy không giống nhau. Trong luận án này, để xác định cấu trúc của EPS thu được chúng tôi cũng tiến hành sử dụng phương pháp phân tích GC-MS để xác định thành phần monosaccharide, dạng liên kết và các phổ NMR nhằm khẳng định lại một số thông tin chi tiết trong cấu trúc như cấu hình anomer, thành phần monosaccharide, loại liên kết,… Ở Việt Nam, các công bố về EPS từ LAB nói chung và từ chủng Lb. fermentum nói riêng còn rất hạn chế. Đa số các nguồn cung cấp PS trong các nghiên cứu tại Việt Nam mà chúng tôi đã cập nhật được chủ yếu là từ các loài nấm [1], [8], [3], tảo [4], các loại rong [7],.. Các công trình này nghiên cứu đa phần tập trung vào điều kiện tách chiết, thu nhận, các tính chất hóa lý,…Chính vì vậy, để góp phần tạo nên sự đa dạng và phong phú hơn về nguồn thu nhận các PS, đặc biệt là các PS từ LAB, trong các nội dung của luận án, chúng tôi đã tiến hành thực hiện các nghiên cứu về điều kiện thu nhận, quá trình tách chiết cùng các tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm cũng như xác định một số đặc điểm lý hóa về cấu trúc của các EPS mới thu nhận được này. 1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe Xuất phát từ nhu cầu ngày càng tăng về các polyme tự nhiên sử dụng với nhiều ứng dụng khác nhau đã dẫn đến sự quan tâm và nghiên cứu về EPS từ vi sinh vật nói chung và từ LAB nói riêng được phát triển mạnh mẽ. Bên cạnh những tác dụng chức năng trong thực phẩm như tạo gel, tạo độ đặc, ổn định cấu trúc sản phẩm, hạn chế sự tách nước…đã được ứng dụng từ lâu, một khía cạnh khác của EPS từ LAB cũng đã được nghiên cứu phổ biến trong những năm trở lại đây như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, kích thích khả năng miễn dịch và làm giảm cholesterol. 1.4.4.1. Các tác động liên quan đến sức khỏe của EPS
  • 45. 35 Hoạt động chống oxy hóa của EPS (LPC-1) tách chiết từ Lb. plantarum C88 đã được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2013). Kết quả nghiên cứu cho thấy, EPS từ Lb. plantarum C88 có khả năng loại bỏ tốt đối với các gốc hydroxyl. Mặt khác, hiệu quả bảo vệ của LPC-1 đối với H2O2 – là tác nhân gây ra sự tổn thương do oxy hóa tế bào Caco-2 đã được khảo sát. Kết quả cũng đã chỉ ra rằng tổng hoạt lực chống oxy hóa (T-AOC) của LPC-1 phụ thuộc vào nồng độ; tác dụng chống oxy hóa liên quan đến khả năng làm tăng hoạt lực của enzyme và các hoạt động chống oxy hóa phi enzyme cũng như giảm sự hình thành peroxy của lipid [139]. Hoạt động chống oxy hóa của EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB cũng được công bố bởi Kodali và cộng sự (2008) [65], Li và cộng sự (2014) [73], Polak và cộng sự (2013) [96] … Một số tác động khác liên quan đến sức khỏe cũng được tổng hợp ở Bảng 1.4. Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố EPS từ các chủng vi khuẩn thuộc LAB Tác động liên quan đến sức khỏe Tác giả (năm) [TLTK] Lb. lactis subsp. cremoris SBT 0495 Hỗ trợ quá trình chuyển hóa cholesterol Nakajima và cộng sự (1992) [85] Lb. acidophilus - Giúp làm giảm sự hình thành màng sinh học từ E. coli O157:H7 Kim và cộng sự (2009) [63] Lb. reuteri Ức chế enterotoxigenic Escherichia coli gây ra sự ngưng kết hồng cầu Wang và cộng sự (2010) [129] Lb. plantarum 70810 - Ức chế chống lại các tế bào ung thư HepG-2, BGC-823 và HT-29 Wang và cộng sự (2014) [125]. Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B- EPS) và Lb. plantarum R315 (L- EPS) - Chống oxy hóa - Có hoạt tính kháng khuẩn chống lại tác nhân gây bệnh như Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Candida albicans, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, và Shigella sonnei,… Li và cộng sự (2014) [72]
  • 46. 36 1.4.4.2. Các tác dụng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm Trong thời gian qua, đã có rất nhiều nghiên cứu khai thác tác dụng có lợi của EPS sinh tổng hợp từ LAB được tiến hành trong điều kiện in vitro. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung quanh sữa và các sản phẩm từ sữa với vai trò của EPS tác động lên những tính chất chức năng của sản phẩm: EPS từ S. thermophiles giúp làm tăng độ ẩm, cải thiện được những đặc tính tan chảy của pho mát Mozzarella [93], làm tăng khả năng giữ ẩm [76], [92]; EPS từ S. thermophilus, S. cremoris, và Lb. bulgaricus giúp làm giảm khả năng tách nước, giảm độ cứng tương đối và độ nhớt biểu kiến [110]. Những tính chất chức năng được tạo nên nhờ có sự có mặt của các EPS (có thể được bổ sung vào hoặc được tổng hợp trực tiếp trong quá trình sản xuất sản phẩm) đã góp phần hạn chế được việc sử dụng các phụ gia tổng hợp. Từ đó giúp duy trì tính chất tự nhiên, nâng cao chất lượng sản phẩm đáp ứng được yêu cầu về mức độ an toàn cần thiết và nâng cao lòng tin của người tiêu dùng khi sử dụng những sản phẩm có sự có mặt của hợp chất này. Tóm lại, các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB đã mang lại rất lớn những tiềm năng quan trọng trong các ngành công nghiệp và đối với sức khỏe con người. Tuy nhiên, với sự đa dạng về các chủng loài các vi khuẩn, cũng như sự phong phú về nguồn phân lập các vi khuẩn này, sẽ không có sự giống nhau về điều kiện thu nhận, các đặc tính lý hóa giữa các EPS tổng hợp được. Do đó, để quá trình tổng hợp EPS từ mỗi vi khuẩn hiệu quả hơn, việc tìm ra các thông số lý hóa thích hợp như thành phần môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy là hết sức cần thiết. Bên cạnh đó, việc xác định các điều kiện tách chiết, các tính chất lý hóa tương ứng với mỗi loại EPS thu nhận khác nhau cũng như các đặc điểm về cấu trúc của các EPS này sẽ là cơ sở và nền tảng giúp chúng ta có thể sử dụng chúng trong thực tiễn tốt hơn. Đây cũng là những nội dung chính sẽ được nghiên cứu và làm sáng tỏ trong luận án.
  • 47. 37 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn lactic được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: Lb. fermentum TC12, Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC14, Lb. fermentum TC15, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum TC18, Lb. fermentum TC19, Lb. fermentum TC20, Lb. fermentum TC21, Lb. fermentum MC2, Lb. fermentum MC3, Lb. fermentum N9 và Lb. fermentum N10. Các chủng này được cung cấp bởi phòng thí nghiệm vi sinh, Đại học Ghent, Bỉ (BCCM/LMG: Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms/ Laboratory for Microbiology). - Các EPS được sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum được chọn. 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.2.1. Hóa chất - MeOH, CHCl3,, NaBH4, TFA, TCA (hãng Merck - Đức). - (CH3)2SO, (CH3CO)2O, C6H6, CH3COOC2H5 (hãng Daejung Chemicals & Metals - Hàn Quốc). - NaOH, HCl, NH3 đậm đặc, CH3COOH, D-glucose, H2SO4 đậm đặc, (CH3)2SO4 (Trung Quốc). - EtOH tuyệt đối 99,9% của công ty cổ phần hóa chất Đức Giang (Việt Nam). - MRS lỏng (hãng Scharlau – Tây Ban Nha) (Phụ lục 2.1) và môi trường MRS agar: có thành phần là môi trường MRS có bổ sung 10 – 15 g agar/l. 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ Máy quét phổ tử ngoại - khả kiến mẫu lỏng (UV-Vis DRS-Jacos V630, Nhật Bản). Thiết bị Bruker Avance 500MHz. Thiết bị GC-MS (Shimadzu, Nhật Bản, 2010). Hệ thống sắc ký lỏng của hãng Agilent (USA). Máy ly tâm Universal R320, Máy li tâm để bàn K241R (Hettich-Đức). Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật khác: tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng,…
  • 48. 38 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) Nguyên tắc: Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ lửng sẽ bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với cường độ tia sáng đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ phản ánh một cách tương đối lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường. Ngoài ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng. Do đó, lượng ánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môi trường lỏng. Để đánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế bào như các hạt rắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch tế bào nuôi cấy, đối chiếu với môi trường lỏng không có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của sinh khối vi khuẩn. Để xác định mật độ tế bào vi khuẩn, canh trường được đo OD ở bước sóng 600nm. Tham chiếu giá trị OD 600nm = 1 tương ứng với mật độ tế bào là 8*108 CFU/ml (http://www.genomics.agilent.com/biocalc…/calcODBacterial.jsp). Số ml môi trường cần hút = Số ml môi trường lên men x mật độ tế bào cần bổ sung 𝑂𝐷𝑐𝑎𝑛ℎ 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔 x 8 x 108 Đo mật độ quang trên thiết bị Thermo Spectronic Genesys 10 UV/Vis. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] Chủng Lb. fermentum từ ống giống gốc MRS agar - Cấy ria Khuẩn lạc thuần - Ủ ở 37o C, 24 giờ MRS lỏng - Ủ ở 37o C, 24 giờ - Ly tâm 5000 vòng/phút, 4o C, 5 phút - Rửa hai lần bằng 1% pepton + 0,85% NaCl (tái huyền phù) Sinh khối (điều chỉnh OD600nm = 1) (1) Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối
  • 49. 39 Các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 từ ống giống gốc được cấy ria trên môi trường MRS agar, và ủ trong tủ ấm ở 37o C, 24 giờ. Khuẩn lạc thuần sau đó được cấy vào môi trường MRS lỏng, ủ trong tủ ấm ở 37o C, 24 giờ. Sinh khối được thu nhận sau khi ly tâm 5000 vòng/phút ở 4o C, trong 5 phút và rửa lại 2 lần bằng dung dịch 1% pepton + 0,85% NaCl được tái huyền phù và xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm. 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS Quá trình thu nhận và tách chiết EPS được thực hiện như Yuksekdag và Aslim có sửa đổi [138]. Sinh khối tế bào thu nhận theo sơ đồ Hình 2.1 của các chủng Lb. fermentum được bổ sung vào các môi trường cần khảo sát. Tiến hành lên men ở 37o C trong 24 giờ sau đó tủa protein bởi acid trichloroacetic 30% (TCA). Dịch nổi thu được sau khi ly tâm, kết tủa EPS bởi ethanol lạnh lần 1 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Hòa tan tủa trong nước cất 50o C (khoảng 2 ml). EPS trong dịch nổi thu được sau khi ly Dịch lên men từ các chủng Lb. fermentum - Xử lý nhiệt (1000 C, 15 - 20 phút) - Làm nguội - Bổ sung 30% TCA, giữ trong 24 giờ - Ly tâm (13000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) Dịch nổi chứa EPS EPS tủa Phương pháp phenol-sulfuric - Nước cất 50o C - Bổ sung ethanol lạnh, giữ ở 4o C - Ly tâm (6000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) Môi trường dinh dưỡng - Bổ sung sinh khối tế bào - Ủ ở 37o C trong 24 giờ Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS
  • 50. 40 tâm được kết tủa bởi ethanol lạnh lần 2 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Kết tủa được tiếp tục hòa tan trong nước cất 50o C. Dung dịch này được xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – sulfuric. 2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum Các chủng Lb. fermentum khác nhau từ ống giống gốc Nuôi cấy thu nhận sinh khối - Điều chỉnh OD600nm=1 - Lên men trong môi trường MRS, 37o C, 48 giờ Thu nhận và tách chiết EPS Phương pháp phenol-sulfuric Chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS cao - Nuôi thu nhận sinh khối - Lên men trong các điều kiện khác nhau Làm lạnh - Bổ sung TCA ở các nồng độ khác nhau - Giữ 24 giờ Ly tâm (13000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) - Bổ sung ethanol lạnh với các tỉ lệ khác nhau, - Giữ ở 4o C Protein Ly tâm (6000 vòng/phút, 10 phút, 4o C) EPS tủa Phương pháp phenol-sulfuric Phương pháp kjeldahl Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS