NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH

1. VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN
CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN
TÊN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN
POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE
TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM
CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH
Mã số: VAST03.04/15-16
Hướng KHCN: Khoa học vật liệu (Mã hướng: VAST03)
Đơn vị chủ trì:Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân
NHA TRANG, 2017

2. VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN
CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN
TÊN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN
POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE
TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM
CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH
Mã số: VAST03.04/15-16
Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài
NHA TRANG, 2017

3. MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ vii
Mở đầu 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4
1.1. Sulfate polysaccharide từ rong lục 4
1.2. Rong lục chi Ulva và Ulvan 4
1.2.1. Rong lục chi Ulva. 4
1.2.2. Ulvan : Thành phần hóa học, cấu trúc và ứng dụng 5
1.3. Nanogel 11
1.3.1. Định nghĩa nanogel 11
1.3.2.Cơ chế hình thành nanogel 12
1.3.3. Phương pháp điều chế nanogel 13
1.4. Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài 17
1.4.1. Ngoài nước. 17
1.4.2. Trong nước. 25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu: 28
2.2. Phương pháp nghiên cứu. 28
2.2.1. Phân tích thành phần hóa học chính của các mẫu rong thu thập
được
28
2.2.2. Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ một loài
rong lục thuộc chi ulva.
29
2.2.3. . Xây dựng quy trình chuyển hóa các ulvan polysaccharide thành
nano ulvan polysaccharide.
31
2.2.4. Nghiên cứu cấu trúc hóa học và cấu hình không gian các sản phẩm
ulvan polysaccharide và nano ulvan polysaccharide.
33
2.2.5. Thử hoạt tính sinh học của các ulvan polysaccharide và nano ulvan
thu được
34
2.2.6. Đánh giá hiệu quả của việc nano hóa định hướng cho khả năng dẫn 37

4. thuốc
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 38
3.1. Thu thập một số loài rong lục thuộc 02 chi ulva hoặc chi
Enteromorpha và phân tích thành phần hóa học chính của các mẫu rong
thu thập được.
38
3.2. Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ một loài rong
lục thuộc chi ulva.
43
3.2.1. Phân tích thành phần nguyên liệu 44
3.2.2. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết polysaccharide 44
3.2.3. Tối ưu hóa điều kiện chiết ulvan 47
3.2.4. Đề xuất quy trình 50
3.3. Xây dựng quy trình chuyển hóa các ulvan polysaccharide thành
nano ulvan polysaccharide từ một loài rong lục thuộc chi ulva làm
nguyên liệu điều chế chất dẫn thuốc.
53
3.3.1. Thủy phân ulvan polysaccharide 54
3.3.2. Axetyl hóa ulvan polysaccharide thủy phân 57
3.3.3. Phân tích phổ huỳnh quang của AcU và EU 59
3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ polyme amphiphilic (AcU) lên kích thước
hạt nanogel và thế zeta
62
3.3.5. Thử nghiệm nanogel ulvan mang curcumin 63
3.4. Nghiên cứu cấu trúc hóa học và cấu hình không gian các sản phẩm
ulvan polysaccharide và nano ulvan polysaccharide.
71
3.5. Hoạt tính sinh học của ulvan và Acetyl ulvan (AcU). 84
3.5.1.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. 84
3.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào. 86
3.5.3.. Hoạt tính chống oxy hóa. 89
3.6.Đánh giá hiệu quả của việc nano hóa định hướng cho khả năng dẫn
thuốc.
90
CHƯƠNG 4. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC. 94
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 97
TÀI LIỆU THAM KHẢO 100
PHỤ LỤC

5. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13
C- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13
C
1
H- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H
AOAC : Hiệp hội hóa học phân tích
COSY : Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1
H-1
H
CS% : % tế bào sống sót
DA : Mức độ acetyl hóa
DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
ESI -MS : Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử
Gal : Galactose
GlcA : Glucuronic acid
GPC : Sắc ký thẩm thấu gel
Hela :Ung thư cổ tử cung
Hep-G2 : Ung thư gan người
HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
HSQC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết
IC50 : Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm
IdoA : Iduronic acid
IR : Phổ hồng ngoại
J (Hz) : Hằng số tương tác
MALDI-MS : Phổ khối lượng ion hóa hấp thụ nền laze
Man : Mannose
MBC : Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
MCF-7 : Ung thư vú người
MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu
NCI : Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ
NOESY : Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1
H-1
H
OD : Mật độ quang học
PIC-NGs Polyion complex nanogels
Rha : Rhamnose
SAXS : Tán xạ tia X góc nhỏ
SEM : Hiển vi điện tử quét

6. SP : Sulfate polysaccharide
TFA : Trifluoroacetic acid
TMS : Tetramethylsilane
UL : U lvan chiết từ rong lục Ulva lactuca
AcU : Ulvan acetyl hóa từ UL
UR : Ulvan chiết từ rong lục Ulva reticulata
UroA : Uronic acid
WHO : Tổ chức y tế thế giới
Xyl : Xylose
δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học

7. DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
01 Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của polysaccharide dạng ulvan chiết
từ một số loài rong lục thuộc 2 chi rong Ulva và Chaetomorpha.
21
02 Bảng 2.1. Danh sách loài rong địa điểm và thời gian lấy mẫu 28
03 Bảng 2.2: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết
polysaccharide
30
04 Bảng 3.1. Các loài rong lục sử dụng làm nguyên liệu sinh học để
điều chế SPs
38
05 Bảng 3.2 Thành phần hóa học chính của rong lục 41
06 Bảng 3.3 Thành phần polysaccharide của rong lục. 42
07 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết
polysaccharide.
45
08 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hiệu
suất chiết polysaccharide.
45
09 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết
polysaccharide
46
10 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết polysaccharide 47
11 Bảng 3.8. Các yếu tố khảo sát điều kiện chiết tối ưu. 47
12 Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo phương án CCF. 48
13 Bảng 3.10 Phân tích phương sai kết quả thí nghiệm tối ưu hóa. 49
14 Bảng 3.11. Kết quả xác định khối lượng phân tử của các ulvan 55
15 Bảng 3. 12 Ảnh hưởng của nồng độ polyme amphiphilic lên kích
thước hạt và thế zeta của hạt .
62
16 Bảng 3.13. Các đỉnh đặc trưng trên phổ IR của AcU và AcU-Cur. 67
17 Bảng 3.14 Kết quả phân tích phổ IR của ulvan chiết từ rong ulva
lactuca
72
18 Bảng 3.15. Kết quả phân tích phổ 1
H và 13
C-NMR của UL. 79
19 Bảng 3.17. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của
ulvan chiết từ 02 loài rong Ulva reticulata (UR) và Ulva lactuca
85

8. (UL) và AcU.
20 Bảng 3.17 Kết quả thử độc tính trên các dòng tế bào ưng thư của
ulvan chiết từ rong lục Ulva lactuca.
88
21 Bảng 3.18. Kết quả thử độc tính trên các dòng tế bào ưng thư của
ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata.
88
22 Bảng 3.19 Kết quả thử độc tính trên các dòng tế bào ưng thư của
AcU.
89
22 Bảng 3.20. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của ulvan 90

9. DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
STT Tên hình và đồ thị Trang
01 Hình 1.1. Sơ đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate
polysaccharide
4
02 Hình 1.2. Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan 6
03 Hình 1.3. Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua a) Ca2+
của borate ester
hoặc một phần của b) carboxylate và c) sulfate
8
04 Hình 1.4. Nanogel điều chế dựa vào các tương tác tĩnh điện giữa các
polymer
13
05 Hình 1.5. Hai phương pháp điều chế nanogel. 14
06 Hình 1.6 Nanogel được điều chế từ polymer được biến tính chứa các
gốc kỵ nước
15
07 Hình 1.7. Quá trình hình thành nanogel CHPOA-PEGSH 16
08 Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa. 20
09 Hình 1.9. Cấu trúc sợi nano được hình thành bởi tác dụng của Ulvan
với PVA poly(vinyl alcohol) / H3BO3/Ca2+
thông qua các liên kết
hydrogel.
24
10 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình tách chiết polysaccharide điện tích. 29
11 Hình 3.1. Hình ảnh một số loài rong lục 40
12 Hình 3.2. Bề mặt đáp ứng của hàm mục tiêu Y (X1=6,0, X4 = 25) 50
13 Hình 3.4. Quy trình tách chiết ulvan từ loài rong Ulva lactuca 51
14 Hình 3.5. Quá trình tự kết tụ tạo michelle cấu trúc lõi-vỏ 53
15 Hình 3.6. Quá trình tự kết tụ tạo nanogel 54
16 Hình 3.7 Phổ GPC ulvan thủy phân ở trong thời gian 2 giờ. 56
17 Hình 3.8: Phổ GPC ulvan thủy phân ở trong thời gian 6 giờ. 56
18 Hình 3.9.Sơ đồ phản ứng axetyl hóa ulvan 57
19 Hình 3.10. Phổ 1
H NMR mẫu ulvan thủy phân (UL) và ulvan thủy
phân được acetyl hóa (AcU).
58
20 Hình 3.11. Phổ 1
H NMR mẫu ulvan thủy phân (U) và ulvan thủy 59

10. phân được ester hóa (EU).
21 Hình 3.12. Phổ huỳnh quang kích thích pyrene mẫu Ac.U và EU 61
22 Hình 3.13. Phổ huỳnh quang phát xạ pyrene mẫu AcU và EU 61
23 Hình 3.14. Kích thước hạt nanogel tại các nồng độ Polyme
amphiphilic (AcU) khác nhau.
63
24 Hình 3.15 Phổ IR của AcU (xanh), AcU-Cur (đỏ) và Cur (vàng) 65
25 Hình 3.16. .Phổ huỳnh quang của curcumin trong nước (Cur-water) và
Curcumin trong nanogel (Cur-Au).
66
26 Hình 3.17. Thế zeta của hệ AcU-Cur. 67
27 Hình 3.18. Kích thước hạt nanogel AcU-Cur. 68
28 Hình 3.19. . Đặc điểm hình thái của nanogel AcU-Cur . a. Ảnh
FESEM. B. Phân bố kích thước hạt curcumin từ ảnh chụp FESEM . C.
ảnh chụp TEM.
69
29 Hình 3.20 Phổ IR của ulvan chiết từ rong ulva lactuca 72
30 Hình 3.21. Phổ 1
H-NMR của ulvan chiết từ rong ulva lactuca. 73
31 Hình 3.22. Phổ 13
C-NMR của UL 74
32 Hình 3.23. Phổ COSY của UL 75
33 Hình 3.24. Phổ HSQC của UL 77
34 Hình 3.25. Phổ HMBC của UL 78
35 Hình 3.26. Phổ ESI-MS của ulvan UL 80
36 Hình 3.27. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]-
với m/z 243 81
37 Hình 3.28. Đồ thị Kratky của dung dịch UR 1% trong nước và trong
NaCl 0,5 M
83
38 Hình 3.29. Biểu đồ Guinier của dung dịch UR 1% trong nước 84
39 Hình 3. 30 Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng vi khuẩn A) E. coli
and B) Pseudomonas aeruginosa và C) Enterobacter cloace của
ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata trên đĩa thạch.
85
40 Hình 3..31 Hình ảnh thể hiện sự ức chế các dòng tế bào ung thư a)
HepG2, b) MCF7 và c) Hela của ulvan UL với các nồng độ khác
nhau.
87
41 Hình 3.32. Hình chụp curcumin tan trong dung dịch AcU (Au-Cur) và
curcumin tan trong nước (Cur).
91
42 Hình 3.33. Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng giải phóng 91

11. curcumin.
43 Hình 3.34. . Hiệu quả gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) của
DMSO-Cur và AcU-Cur tại các nồng độ curcumin khác nhau
92
44 Hình 3.35. Hình ảnh thể hiện sự ức chế các dòng tế bào ung thư
HepG2 của AcU-cur với các nồng độ curcumin khác nhau
93

12. MỞ ĐẦU
Ulvan là dạng sulfate polysaccharide được tách chiết từ một số loài rong lục
thuộc 02 chi rong là Ulva và Enteromorpha. Chúng hòa tan trong nước và được
tạo bởi các thành phần chủ yếu là rhamnose, glucuronic, iduronic acid, xylose và
nhóm sulfate để tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là
ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng A (β-D-GlcA (1 →4) α-L-Rha 3S →1) và
ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng B (α-L-IdoA (1 →4) α-L-Rha 3S →1). Tùy
theo các loài rong khác nhau mà các thành phần trên biến đổi khác nhau và tên gọi
các ulvan theo tên các gốc đường khác nhau như sulfated glucuronoxylorhamnan,
glucuronoxylorhamnogalactan và xyloarabinogalactan.
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của ulvan cho thấy tất cả các ulvan chiết
từ các loài rong lục khác nhau thuộc 02 chi rong Ulva và Enteromorpha đều thể
hiện các hoạt tính sinh học sau: chống đông máu, chống oxy hóa, hạ mỡ máu,
chống ung thư, kháng nấm, tăng cường hệ miễn dịch...
Hiện nay, trong lĩnh vực y sinh học các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm các
vật liệu sinh học mới với các tính năng đặc biệt để phục vụ cho việc chữa bệnh và
phục vụ cuộc sống con người. Một trong những vật liệu được quan tâm nghiên cứu
nhiều nhất là các polymer sinh học có nguồn gốc thiên nhiên do khả năng tương
thích sinh học cao và dễ phân hủy sinh học của chúng. Đặc biệt là các
polysaccharide từ các loài rong biển. Trong một vài năm trở lại đây, các nhà khoa
học đã phát hiện ra các sulfated polysaccharide dạng ulvan chiết từ các loài rong
lục, có cấu trúc hóa học tương tự như các glycosaminoglycan (GAGs) của động
vật có vú và chúng có tính chất hóa học tương tự các hyaluronan và choidrotin
sulfate do trong phân tử của chúng có chứa đồng thời nhóm sulfate và glucuronic
acid. Sự có mặt 02 nhóm điện tích này tại các gốc đường khác nhau làm cho các
sulfate polysaccharide dễ dàng tham gia biến đổi hóa học tạo thành các sản phẩm
ulvan có cấu trúc rỗng dạng sợi nano, hạt nano và cấu trúc mạng lưới polymer
hydrogel, tạo nhiều kiểu liên kết ngang khác nhau. Vì vậy chúng có khả năng được

13. sử dụng nhiều trong lĩnh vực vật liệu dẫn thuốc. Chính vì vậy các nano ulvan
polysaccharide thu nhận từ một số loài rong lục được coi như là nguyên liệu ban
đầu để tạo ra các hệ chất dẫn thuốc khác nhau.
Việc nghiên cứu sử dụng các polyme y sinh có cấu trúc nano làm chất phân
phối thuốc là một trong những ý tưởng có tính đột phá khoa học tuy nhiên mới chỉ
là những nghiên cứu bước đầu nhưng theo dự đoán khả năng áp dụng các nghiên
cứu này bắt đầu có thể triển khai trong tương lai gần.
Nước ta có hơn 3200 km bờ biển với nguồn tài nguyên rong biển rất phong phú
và đa dạng trong đó rong lục mà chủ yếu là các loài thuộc chi Ulva, Caulerpa,
Chaetomorpha, Enteromorpha, Cladophora là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn
nhất với trữ lượng ước tính lên tới hàng ngàn tấn khô/năm. Nguồn tài nguyên này
dường như bị quên lãng và một số loài rong thuộc chi ulva được coi như là một
trong những rác thải của biển gây ô nhiễm môi trường ven biển.
Trong những năm gần đây đã có các công trình nghiên cứu qui trình tách chiết,
thành phần, cấu trúc, hoạt tính, của các chất có hoạt tính sinh học từ một số loài
rong biển Việt Nam, tuy nhiên đối tượng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các loài
rong thuộc 02 ngành rong nâu và rong đỏ trong khi các nghiên cứu về rong lục rất
ít ỏi. Đặc biệt là các nghiên cứu về về sulfated polysaccharide từ rong lục hầu như
chưa được nghiên cứu. Với sản lượng lên đến 42.000 tấn khô/năm trong đó hàm
lượng sulfated polysaccharide chiếm tới 10 % rong khô, vì vậy rong lục sẽ là
nguyên liệu tiềm năng để sản xuất sulfate polysaccharide ứng dụng trong trong
công nghiệp dược phẩm, thực phẩm. Để có thể khai thác nguồn rong lục nhằm
tăng giá trị kinh tế của nguồn lợi rong biển định hướng cho việc khai thác sử dụng
nguồn lợi rong biển hợp lý ở nước ta thì một trong những yêu cầu cấp thiết được
đặt ra và cần được tiến hành đó là nghiên cứu tách chiết các ulvan có hoạt tính sinh
học từ rong lục cho mục đích ứng dụng trong vật liệu y sinh.
Mục tiêu của đề tài:
- Xây dựng được quy trình tách chiết ulvan Polysaccharide từ loài rong lục thuộc
chi rong Ulva hoặc chi Enteromorpha .
- Đưa ra quy trình chuyển hóa Ulvan polysaccharide thành dạng nano
polysaccharide hướng đến ứng dụng làm chất dẫn thuốc.

14. Phạm vi nghiên cứu.
a.Đối tượng nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số loài rong xanh sinh trưởng tại vùng
biển Nha Trang –Khánh Hòa.
b. Địa điểm nghiên cứu.
Các thí nghiệm được tiến hành tại Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ
Nha Trang, 2A Hùng Vương – Nha Trang – Khánh Hòa.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
1. Thu thập một số loài rong lục thuộc 02 chi ulva hoặc chi Enteromorpha và phân
tích thành phần hóa học chính của các mẫu rong thu thập được.
2. Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ một loài rong lục thuộc
chi ulva.
3. Xây dựng quy trình chuyển hóa các ulvan polysaccharide thành nano ulvan
polysaccharide từ một loài rong lục thuộc chi ulva làm nguyên liệu điều chế chất
dẫn thuốc.
4. Nghiên cứu cấu trúc hóa học và cấu hình không gian các sản phẩm ulvan
polysaccharide và nano ulvan polysaccharide
5. Thử hoạt tính sinh học của các ulvan polysaccharide và nano ulvan thu được
(tập trung vào hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thư và kháng vi sinh vật kiểm
định)
6. Tạo sản phẩm ulvan Polysaccharide từ rong lục
7. Tạo sản phẩm nano ulvan polysaccharide từ ulvan Polysaccharide
8. Đánh giá hiệu quả của việc nano hóa định hướng cho khả năng dẫn thuốc
Ý nghĩa khoa học của đề tài:
Đưa ra số liệu khoa học về hàm lượng, hoạt tính sinh học và một vài dạng cấu
trúc của ulvan và quy trình chiết tách chúng từ một loài rong lục sinh trưởng tại
vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa.

15. Đưa ra quy trình chuyển hóa Ulvan polysaccharide thành dạng nano
polysaccharide hướng đến ứng dụng làm chất dẫn thuốc.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở dữ liệu góp phần mở ra hướng nghiên
cứu và ứng dụng các sulfate polysaccharide từ rong lục ứng dụng làm chất dẫn
thuốc. Các dữ liệu này chính là cơ sở khoa học định hướng cho việc sử dụng hợp
lý nguồn tài nguyên rong biển để tạo ra những sản phẩm có giá trị gia tăng.

16. Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Sulfate polysaccharide từ rong lục
Trên thế giới, các loài rong lục cho sulfate polysaccharide được chia thành
4 nhóm chính [68]:
- Nhóm rong cho ulvan: Bao gồm các loài rong lục thuộc 2 chi Ulva và
Enteromorpha. Từ năm 2000, nhóm rong cho ulvan được gọi chung là chi Ulva
[http://www.algaebase].
- Nhóm rong cho sulfate rhamnan: Gồm các loài thuộc chi Monostroma,
trong đó có 2 loài đáng chú ý là M. latissimum và M. nitidum.
- Nhóm rong cho sulfate arabinogalactan: Bao gồm các loài rong lục thuộc
chi Codium như C. fragile, C. adhaerens, C. cylindricum…
- Nhóm rong cho sulfate galactan: Bao gồm các loài thuộc chi Caulerpa,
chủ yếu là loài C. cupressoides và C. racemosa.
Theo sơ đồ ở Hình 1.1 cho thấy: nhóm rong lục chứa số lượng lớn các loài
cho SP bao gồm các chi Ulva (38%), Enteromorpha (nay gọi là Ulva) (14%),
Monostroma (14%), Codium (16%), và Caulerpa (11%). Các chi còn lại bao gồm
Capsosiphon, Chaetomorpha, Bryopsis, và Halimeda, chỉ chiếm 7% trong tổng số
(Hình 1.1).

17. Hình 1.1. Sơ đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate polysaccharide
[68]
1.2. Rong lục chi Ulva và Ulvan
1.2.1. Rong lục chi Ulva.
Rong lục là một trong 3 ngành rong chính đã biết hiện nay, chúng tồn tại
trong tự nhiên với số lượng lớn và rất đa dạng về thành phần loài, bao gồm những
chi chủ yếu sau: Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora, Valonia,
Boergessenia, Caulerpa, Bryopsis, Codium... Trong đó các loài được sử dụng như
là nguồn thức ăn phổ biến thuộc các chi rong lục là Ulva, Enteromorpha,
Caulerpa, Codium [68].
Ở nước ta, nguồn lợi rong lục rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các
chi rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm
69 loài trong tổng số 100 loài đã được định danh trên thế giới [2].
Rong lục chi Ulva được cho là rất giàu protein, carbohydrate, vitamins và
các khoáng chất. Trong đó, polysaccharides ngày càng được quan tâm nhiều nhất
do chúng có những tính chất vật lý và hóa học đáng chú ý và có nhiều tiềm năng
ứng dụng trong y sinh học.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có 4 dạng polysaccharide được tìm thấy từ
rong lục chi Ulva bao gồm dạng tan trong nước là Ulvan, dạng không tan trong
nước là cellulose, dạng tan trong kiềm là xyloglucan mạch thẳng và lượng nhỏ
glucuronan [61].
1.2.2. Ulvan : Thành phần hóa học, cấu trúc hóa học và ứng dụng

18. * Thành phần hóa học và cấu trúc của ulvan
Theo công trình [72], bốn nhóm polysaccharide đặc trưng đã được xác định từ
sinh khối của các loài rong thuộc chi Ulva bao gồm: polysaccharide không tan là
cellulose, hàm lượng thấp hai loại polysaccharide tan trong kiềm là xyloglucan và
glucuronan, và polysaccharide tan trong nước là ulvan. Ulvan được phân bố trong
không gian các thành tế bào tạo nên bởi hệ mạng các sợi cellulose. Trong thân
rong, ulvan đóng vai trò là polymer sinh học duy trì chức năng thẩm thấu cho rong
và độ bền vững thành tế bào rong. Polysaccharide ulvan được cho là tương tác với
các nhóm polysaccharide khác và protein bằng các kiểu liên kết khác nhau [61].
Lahay M. và các CS đã nghiên cứu về ulvan và đã xác định được các đơn vị
lặp đi lặp lại trong cấu trúc của ulvan như sau: [92] [60]
- Cấu trúc ulvanobiuronic được tạo thành bởi các glucuronic acid, iduronic
acid liên kết với sulfated rhamnose, ký hiệu là A3S và B3S:
A3S : →4)β-D-GlcAp(1→4)-α-L-Rhap3S(1→
B3S : →4)α-L-IdoAp(1→4)- α-L-Rhap3S(1→
- Cấu trúc ulvan cũng có thể là các ulvanobiose với xylose thay thế các
biuronic liên kết với rhamnose, ký hiệu là U3S vầ U2S,3S:
U3S : →4)β -D-Xylp(1→4)-α-L-Rhap3S(1→
U2S,3S : →4)β-D-Xylp2S(1→4)-α-L-Rhap3S(1→
p là vòng pyranoside của hợp chất.
Tùy vào loài rong Ulva, địa điểm phân bố, điều kiện sinh thái mà trong
thành phần rong còn chứa hàm lượng ít đa dạng các loại saccharide khác. Các
saccharide này ra theo sản phẩm ulvan trong quá trình chiết, làm ảnh hưởng đến
độ tinh sạch cũng như hoạt tính của sản phẩm [20]. Manose, galactose và
arabinose là các saccharide tạp thường xuất hiện trong ulvan. [34] [59] [96, 108]

19. Hình 1.2. Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan [60]
Như vậy, ulvan từ chi rong lục Ulva được tạo nên bởi các các thành phần
chính chủ yếu là Rha, GlcA, IdoA, Xyl và sulfate tạo thành chuỗi các disaccharide
lặp lại với tỉ lệ khác nhau. Cấu trúc chi tiết của các phân tử ulvan từ các loài rong
lục Ulva đã được các nhà khoa học công bố, bao gồm, kiểu liên kết glycoside, sự
sắp xếp các phân tử đường, cách phân nhánh và/hoặc kiểu sulfate hóa. Các chuỗi
oligosaccharide ulvan khác nhau này được tìm thấy trong những polysaccharide có
nguồn gốc từ các loài rong Ulva khác nhau, được giải thích là do chúng bị tác
động bởi các nhân tố sinh lý môi sinh làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
của rong. Ví dụ, 2 mẫu ulvan từ rong lục Ulva rigida thu hái được ở quần đảo
Canary-Spain, và Brittany-France, cùng có chung cấu trúc chuỗi dạng -A3s-A3s-, -
A3s-U3s-, -A3s-U2s,3s- ; khác nhau ở cấu trúc dạng -A3s-U3s-U3s-, -A3s-U2s,3s-U3s-, và
-A3s-U2s,3s-U3s-U3s- đối với mẫu xuất xứ từ quần đảo Canary; còn mẫu từ Brittany
chuỗi cấu trúc có dạng -A2g,3s-U3s và -A2g3s-U2s,3s-. Trong đó U2s,3s là ulvanobiose
2,3-disulfate và A2g,3s gán cho dạng A ulvanobiouronic acid 3-sulfate bị thế ở vị trí
C-2 của Rha 3-sulfate bởi một GlcA (Hình 1.2).
* Các tính chất hóa lý của ulvan
Các nhà khoa học đã chỉ rằng ulvan có cấu trúc đa dạng là do thành phần
hóa học của ulvan rất phức tạp [80]. Tính đều đặn cục bộ của ulvan tự nhiên dựa

20. vào sự lặp lại của các đơn vị aldobiuronic, được đặt tên là A3s và B3s (Hình 1.2),
tồn tại trong thời gian ngắn gây ra sự tạo thành gel yếu [79]. Cấu trúc đều đặn của
ulvan bền là do tương tác hút và đẩy sinh ra giữa các nhóm chức của ulvan, đặc
biệt là lực tĩnh điện. Ulvan là một polymer mang điện tích âm do trong cấu trúc
của nó chứa nhóm carboxylic và sulfate, độ bền của ulvan phụ thuộc vào độ pH và
nồng độ ion trong dung dịch. Điện tích thực trong ulvan tác động đến hình dạng
của chuỗi polymer và điều khiển quá trình chuyển từ dạng này sang dạng khác của
chuỗi [80]. Về phương diện hóa học, khả năng thay đổi của ulvan là rất rõ ràng
phụ thuộc vào hiệu lực tự nhiên của các nhóm chức. Độ tan và hình thái học của
ulvan tác động sâu đến khả năng phản ứng của nó trong môi trường làm việc.
Ulvan được biết đến là chỉ tan trong nước do nó mang điện tích và bản chất
là có khả năng hút nước cao. Tuy nhiên, dung dịch thu được không trong suốt, cho
thấy dạng tập hợp cực nhỏ của vật liệu polymer không phân tán hoàn toàn trong
dung môi. Chính vì vậy, khi phân tích mẫu ulvan trong dung dịch nước, người ta
thấy sự có mặt của các tập hợp dạng hình cầu được nối với nhau bởi các sợi rất
nhỏ [99]. Chuỗi hạt có cấu trúc siêu vi này thường được tạo thành bởi chất điện
phân cao phân tử trong điều kiện không đủ dung môi [31, 95 ], hoặc là do sự có
mặt nhóm methyl ở monomer rhamnose trong phân tử ulvan với hàm lượng lớn
được cho là nguyên nhân của tính chất kị nước khác thường của polysaccharide
mang điện tích cao [95]. Sự hình thành các tập hợp siêu nhỏ trong dung dịch cũng
không cho phép phân tích được khối lượng chính xác của ulvan, dạng tập hợp
khác nhau ảnh hưởng mạnh đến sự phân bố píc, điều này thường biểu hiện rất rõ
trên sắc đồ của phương pháp đo sắc ký thẩm thấu gel GPC [61].
Ulvan còn có khả năng tạo gel trong nước giống với alginate, khả năng tạo
gel này đặc biệt liên quan đến borate ester, điều kiện tối ưu cho sự tạo thành
hydrogel là khi có mặt của axit boric và ion canxi trong dung dịch với pH = 7,5,
hydrogel tạo thành với độ đàn hồi (storage modulus) khoảng 250Pa. Cơ chế của sự
tạo gel là không tạo mạng hoàn toàn, bắt nguồn từ việc tạo thành borate ester với
ulvan 1,2-diol tiếp theo bằng liên kết ngang qua ion Ca2+
. Ion canxi sẽ làm cầu nối
của phức và/hoặc làm cho borate ester trở nên bền hơn (Hình 1.3.a), nhóm sulfate
và carboxylic acid cũng có thể tạo liên kết với ion Ca2+
(Hình 1.3.b,c) góp phần
vào quá trình tạo gel của ulvan [61]

21. Hình 1.3. Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua a) Ca2+
của borate ester hoặc một
phần của b) carboxylate và c) sulfate [61]
Không phải cấu trúc nào của ulvan cũng có khả năng tạo gel. Trong công trình
[60], nhóm các nhà khoa học đã phân tích phổ 11
B và 13
C NMR của các mảnh gel
ulvan đã được thủy phân tự động. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở giá trị pH=7.5
(giá trị được cho là tối ưu để hình thành gel ulvan), các đỉnh của phức ulvan-boron
không được quan sát thấy, tương ứng với gel ulvan không được hình thành. Khi
tăng giá trị pH từ 9 trở lên, ta chỉ quan sát thấy phức ulvan-boron đối với ulvan có
cấu trúc A3S. Do đó, ta có thể khẳng định rằng cấu trúc ulvan A3S tham gia vào quá
trình cố định acid boric trong sự hình thành gel ulvan (cấu trúc B3S với đơn vị cấu
trúc lặp lại chứ iduronic acid không tham gia vào quá trình tạo gel) [60].
Các vùng liên kết trong gel gồm bao gồm các liên kết yếu (ví dụ liên kết kém
bền giữa nhóm ester borate và các cation) rất dễ bị bẻ gãy khi xử lý bằng nhiệt. Do
đó, gel tạo thành dễ biến đổi theo nhiệt, chảy thành dung dịch nhớt khi nâng nhiệt
độ lên cao và tái hình thành gel khi hạ thấp nhiệt độ xuống. Cơ tính của gel này
biểu hiện kém khi tiếp xúc với các chất dịch trong cơ thể do quá trình trao đổi
cation Ca2+
(đóng vai trò duy trì mạng lưới liên kết giữa các anionic
polysaccharide) với các cation Na+
, K+
có mặt trong các dịch trong cơ thể. Do đó,
ứng dụng gel này trong kỹ thuật mô tương đối hạn chế bởi tính bất ổn cơ học và
khó có thể kiểm soát được khả năng hòa tan của ulvan ở các điều kiện sinh lý khác
nhau của cơ thể [9, 23].

22. *Ứng dụng của ulvan.
Với cấu trúc polysaccharide đặc biệt, ulvan là đối tượng polymer mới mang
nhiều hoạt tính sinh học và chức năng thú vị, có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh
vực: thực phẩm, y dược, hóa học nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản [59].
Đối với ngành sản xuất hóa chất, sinh khối ulvan là nguồn cung cấp các gốc
đường hiếm, tiền chất để sản xuất các hóa chất tinh sạch [122]. Polysaccharide
ulvan được cấu thành chủ yếu bởi các monomer rhamnose và biuronic acid.
Rhamnose là loại monomer tương đối khó tìm trong các hợp chất tự nhiên.
Rhamnose từ ulvan chiết từ Monostroma (Codiolales) là tiền chất để tổng hợp
hương thơm. Rhamnose còn được thêm vào mỹ phẩm chăm sóc da với tác dụng
tăng cường tổng hợp collagen, tăng độ đàn hồi, độ sáng của làn da. Trong ứng
dụng y dược, L-rhamnose là thành phần thiết yếu của kháng nguyên bề mặt của
nhiều loại vi khuẩn, được nhận diện bởi các lectin động vật có vú. Ulvan còn là
nguồn cung cấp tiềm năng acid iduronic, dạng đường được tìm thấy trong tổng
hợp heparin (có hoạt tính chống huyết khối), một loại glycosaminoglycan ở động
vật có vú. Quá trình tổng hợp iduronic acid phải qua nhiều bước rất tốn kém. Do
đó, tách chiết iduronic acid từ tự nhiên như ulvan là hướng đi đầy tiềm năng cần
khai thác.
Bên cạnh monomer, ulvan oligomer và polymer cũng đã được nghiên cứu về
những ứng dụng tương ứng với hoạt tính sinh học của chúng. Nhiều công trình
khác nhau đã cho thấy ulvan dạng oligomer và polymer thể hiện các hoạt tính
chống ung thư, hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch, hoạt tính kháng một số chủng
virus cúm, hoạt tính chống đông tụ máu. Trong nghiên cứu [14], rhamnan,
rhamnose, oligomer từ các desulfated polysaccharide có cấu trúc tương tự như
ulvan chiết từ Monostroma đã được sử dụng trong điều trị loét dạ dày. Hoạt tính
tương tự ở ulvan đã được thử nghiệm trên chuột. Kết quả kiểm nghiệm phát hiện
sự tiết ra các hợp chất mucin (glycoprotein cao phân tử) trong ruột của chuột nhằm
bảo vệ niêm mạc ruột. Ulvan cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, thuyên giảm
sự nhiễm độc gan khi kháng acetaminophen, chất gây độc gan khi thử nghiệm trên
chuột bạch tạng.
Nhiều công trình đi vào nghiên cứu tác dụng của ulvan lên hệ tiêu hóa con
người. Ulvan thuộc nhóm chất xơ tiêu hóa, cấu trúc của chúng không bị phân hủy
bởi các enzyme nội sinh của con người. Là một chất xơ tiêu hóa có đặc điểm trữ

23. nước ấn tượng, ulvan đóng vai trò là chất tạo khối phân, ngăn ngừa các bệnh lý
liên quan đến rối loạn các chức năng vận chuyển đường ruột [74]. Ulvan còn tham
gia điều chỉnh các quá trình chuyển hóa lipid khi cho thấy tác dụng hạ thấp nồng
độ mỡ trong máu ở chuột. Nồng độ lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao giảm, nồng
độ lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp và triglyceride tăng là những nguy cơ gây
ra các bệnh về tim mạch như xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não. Ulvan và
các oligosaccharide dẫn xuất làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol tổng,
cholesterol tỷ trọng thấp và triglyceride cũng như tăng nồng độ cholesterol tỷ
trọng cao trong máu.
Mặc dù các nghiên cứu được tiến hành với mục đích điều chế thức ăn dinh
dưỡng cho con người, các kết quả cũng đã được ứng dụng làm thực phẩm bổ sung
chức năng trong chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thủy sản. Quá trình xử lý sinh
khối các rong lục thuộc bộ Ulvales bằng enzyme đã hỗ trợ thủy phân ulvan thành
oligosaccharide, tăng hàm lượng protein trong sản phẩm, mang đến hiệu quả kích
thích hệ miễn dịch động vật, giúp kháng nhiều loại bệnh. Ulvan chiết từ rong Ulva
rigida kích thích các đại thực bào, tăng sức chống chịu ở cá. Một sáng chế trong
thời gian gần đây mô tả kết hợp ulvan dạng nano với đất sét, tạo ra sản phẩm khử
độc thức ăn cho gia súc. [56]
Trong trồng trọt, không nhiều các công trình về ứng dụng của ulvan được
công bố. Bên cạnh làm phân bón, ulvan còn được nhắc đến làm thuốc xịt phòng
trừ bệnh ở cây. Cây họ đậu Medicago truncatula sau khi được phun xử lý bằng
dịch chiết ulvan, đã kháng lại loài nấm gây bệnh Colletrichum trifolii. Một số tài
liệu khác công bố hiệu quả của ulvan lên khả năng cố định đạm ở rễ cây, thúc đẩy
tăng trưởng. Với đặc tính trao đổi ion kim loại nhờ có các gốc anion sulfate và
carboxylic, ulvan đang được nghiên cứu làm chất chỉ thị sinh học, xác định mức
độ ô nhiễm kim loại nặng ở các vùng biển duyên hải. Các nhà khoa học đang
nghiên cứu khả năng trao đổi ion một cách có chọn của polysaccharide nhằm tăng
hiệu quả xử lý kim loại nặng trong nước thải công nghiệp cũng như tăng hàm
lượng khoáng chất trong đất trồng, thức ăn chăn nuôi [35].
Tính chất tạo gel đặc biệt của ulvan mang đến tiềm năng ứng dụng đa dạng.
Để duy trì cấu trúc, gel cần được kiểm soát duy trì hàm lượng cation, pH và nhiệt
độ. Gel ulvan đã được nghiên cứu biến tính nhằm tăng cường độ bền cơ học, tăng
khả năng bắt dính phân tử chất mang. Với các ứng dụng làm chất dẫn thuốc, băng

24. vết thương nhả thuốc, gel ulvan biến tính cần được nghiên cứu sâu hơn để kiểm tra
độ ổn định, độ chính xác trong nhả thuốc [62].
1.3. Nanogel.
Nhiều năm trở lại đây, công nghệ nano được ứng dụng rộng rãi trong
nghiên cứu điều chế các hệ mang thuốc. Ngành công nghệ này đã đưa ra các
phương pháp hữu hiệu giúp mang tải các tác nhân có hoạt tính sinh học đến các vị
trí cần thiết và trong thời gian mong muốn. Kích thước nano của các hệ mang
thuốc thể hiện nhiều ưu điểm có thể kể đến như: thúc đẩy khả năng hòa tan của
thuốc có tính chất kỵ nước, hiệu quả trong truyền dẫn thuốc đến tế bào ung thư,
tăng cường độ ổn định và tính bền vững của thuốc điều trị trước sự phân hủy do
các tác nhân hóa học hay enzyme cũng như là thuyên giảm các tác dụng phụ trong
gây độc tế bào. Nhiều loại hệ mang thuốc có kích thước nano khác nhau đã được
báo cáo bao gồm micelle của các polymer, liposome, sol-gel, hydrogel … [51]. Kể
từ khi hydrogel được tìm thấy, nhiều nỗ lực nghiên cứu trên hệ gel này nhằm nhân
rộng khả năng ứng dụng của nó trong đời sống, đặc biệt trong các lĩnh vực y sinh.
Gel ở đây được xem như là một dạng vật liệu mềm, mang tính chất của cả chất rắn
lẫn dịch lỏng. Độ tương thích sinh học của chúng được cho là đến từ thành phần
nước trong gel khá lớn và sức căng bề mặt thấp trong khi cấu trúc lỗ xốp cho tính
tải cao và đặc tính trương nở giúp kiểm soát khả năng nhả thuốc.
1.3.1. Định nghĩa nanogel [ 51]
Nanogel là một mạng lưới ba chiều có kích thước dưới micrometer được
tạo thành bởi các polymer liên kết đan xen với nhau. Theo một định nghĩa khác,
nanogel là 1 dạng hydrogel cụ thể chứa các không gian có kích thước nanometer,
nên chúng sở hữu đồng thời tính chất của một hydrogel và của một hạt nano. Các
hạt nanogel này được phân loại trong ngành vật liệu thuộc hạt nanopolymer, bên
cạnh các hạt nano lipid và hạt nano vô cơ. Nanogel có thể được điều chế từ trực
tiếp polymer hoặc bằng cách polymer hóa hỗn hợp các monomer. Yếu tố tiên
quyết trong quy trình điều chế nanogel đó là công đoạn tạo các liên kết ngang, bao
gồm liên kết vật lý và liên kết hóa học. Nanogel có một tính chất đặc biệt đó là khả
năng hấp thụ một lượng lớn nước và các dịch sinh học trong khi vẫn duy trì cấu
trúc của mình. Điều này được lý giải là do sư có mặt của các nhóm ưa nước như -
OH, CONH-, -CONH2- và SO3H trên polymer và các liên kết ngang trong thành

25. phần nanogel giúp chúng chỉ bị trương nở thay vì bị hòa tan trong nước. Với tính
chất đặc biệt này, nanogel là ứng cử viên đầy hứa hẹn, mang tính ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực. Nhiều công trình cho thấy nanogel là chất mang thuốc lý
tưởng nhờ hiệu suất mang thuốc cao, ổn định bền vững trước các tác nhân môi
trường tiếp xúc (ví dụ như các lực tương tác ion, pH, nhiệt độ).
1.3.2.Cơ chế hình thành nanogel
Tương tác vật lý
Tương tác vật lý giữa các polymer bao gồm 2 loại tương tác: tương tác Van
der Waals và tương tác tĩnh điện. Nanogel được hình thành bằng tương tác vật lý
giữa các chuỗi polymer cung cấp một hệ bề mặt có khả năng bắt lấy các hợp chất
có hoạt tính sinh học khác nhau, đặc biệt là các thuốc điều trị có tính kỵ nước và
các đại phân tử sinh học. Việc hình thành các liên kết ngang vật lý của nanogel
thường được diễn ra trong dung môi nước trong điều kiện phản ứng thường. Các
yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành nanogel như giá trị pH, lực tương tác ion,
nhiệt độ nên được kiểm soát chặt chẽ để quá trình điều chế đạt kích thước hạt
nanogel như mong muốn. Một số yếu tố ảnh hưởng khác không thể không kể đến
như cấu trúc của vật liệu polymer, bản chất các block trên polymer, chiều dài các
block. [129]
Liên quan đến tính chất amphiphilic
Như chúng ta đã biết, đối với các polymer vừa có cả phần ưa nước vừa có
cả phần kỵ nước, chúng có khả năng tự kết tụ ở các điều kiện thích hợp để tạo nên
các micelle với cấu trúc lõi-vỏ. Lớp vỏ ưa nước bên ngoài giúp kéo dài khả năng
tuần hoàn của hạt nanogel trong dịch thể trong khi lõi kỵ nước cho phép chúng
mang tải hiệu quả các loại thuốc. Để giải thích chi tiết hơn, lớp vỏ ưa nước bên
ngoài không những có chức năng như một rào cản ngăn cản sự tác động từ các
protein và các mô của cơ thể mà còn bảo vệ nanogel tránh bị nhận ra và opsonine
hóa bởi các hệ thống thực bào. [21, 76]. Trong khi đó, nhân kỵ nước cho phép tải
thuốc điều trị thông qua các tương tác kỵ nước và các tương tác tĩnh điện, và các
nhân này thể hiện tính chất động dược học như hiệu quả mang thuốc và nhả thuốc
[65,66, 25]. Tuy nhiên, cấu trúc lõi-vỏ của nanogel hình thành dựa trên các tương
tác kỵ nước thông thường thì tương đối kém bền, đặc biệt khi chúng được đưa vào
trong cơ thể con người. Còn các nanogel hình thành do các amphiphilic polymer

26. tự kết tụ thì thường không còn các khuyết điểm này trong khi vẫn duy trì ưu điểm
của micelle.
Tương tác tĩnh điện
Polyampholyte thể hiện tính chất amphiphilic bởi trên mạch có sự xuất hiện
của cấu trúc mạch hydrocarbon và có cả các nhóm điện tích. Chúng có thể tự kết
tụ dễ dàng với nhau và trương nở trong dung môi nước (hình 1.4) [44]. Takeo và
cộng sự [109] đã điều chế nanogel đa điện tích (PIC-NGs) sử dụng dextran được
biến tính có mặt các nhóm điện tích dương và điên tích âm. Các nhà khoa học này
đã đưa vào dextran các tetramine có bốn nhóm amino và các tetracarboxylic acid
có bốn nhóm carboxyl. PIC-NCs được hình thành dựa vào các liên kết chéo vật lý
là các cầu muối giữa các nhóm cation và anion khi trộn các hỗn hợp lại với nhau.
Hình 1.4. Nanogel điều chế dựa vào các tương tác tĩnh điện giữa các polymer
Tuy nhiên, polyampholyte với các liên kết ngang hóa học tồn tại một số
khuyết điểm. Ví dụ như, các phản ứng liên kết hóa học có khả năng làm giảm hiệu
quả điều trị của thuốc được mang, đặc biệt là các protein và gen [49].
Liên kết hóa học
Liên kết ngang hóa học bao gồm hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa
các polymer tan trong nước trong dung môi hòa tan để hình thành nên mạng lưới
polymer không tan [90, 102]. Đa dạng phương thức hình thành liên kết ngang hóa
học đã được báo cáo, bao gồm sử dụng hợp chất amoni bậc bốn, phản ứng quang
hóa, phản ứng click… [110,52, 19].
1.3.3. Phương pháp điều chế nanogel

27. Như đã đề cập ở trên, trương nở là một trong những đặc tính quan trọng
nhất của nanogel, tính chất có được do các liên kết ngang hóa học hoặc vật lý giữa
các polymer. Nói cách khác, bản chất của việc hình thành nanogel là phải tạo các
liên kết ngang phù hợp giữa các polymer [90].
Dựa trên tính chất của các vật liệu được sử dụng để hình thành nanogel,
phương pháp điều chế nanogel được chia làm 2 con đường chính: một là điều chế
nanogel từ vật liệu polymer, hai là nanogel được hình thành từ quá trình polymer
hỗn hợp các monomer. Cả 2 cách tiếp cận được diễn giải trên hình 1.5
Hình 1.5. Hai phương pháp điều chế nanogel [102]
Phương pháp 1: Điều chế nanogel từ vật liệu polymer
Trong phương pháp này, polymer sử dụng có thể là các polymer
amphiphilic (polymer vừa có nhóm kỵ nước vừa có nhóm ưa nước) hoặc các
triblock copolymer (polymer chứa 3 nhóm thành phần khác nhau) có khả năng
hình thành gel bằng cách tự kết tụ lại với nhau. Polymer amphiphilic thường có
mạch chính ưa nước với nhiều nhóm kỵ nước phân bố trên mạch chính như hình

28. 1.6. [102]. Chính các nhóm kỵ nước này đã tạo nên một số lượng lớn các liên kết
ngang để hình thành nên nanogel thay vì hình thành các cấu trúc tương tự như
micelle, do đó giúp cho nanogel bền hơn [8].
Gần đây, các amphiphilic polymer mới đã được tổng hợp rộng rãi với mục
đích tạo nên các vật liệu mới phục vụ điều chế nanogel. Park và cộng sự [81] đã
điều chế nanogel dựa trên chondroitin sulfate ưa nước được biến tính với acetic
anhydride. Hằng số cân bằng hóa học của nanogel này khi được phân tích bởi
phương pháp huỳnh quang thì tương đương với polymeric micelle, chứng tỏ các
nhóm acetyl có thể đóng vai trò là nhân kỵ nước mang và nhả thuốc, với hiệu quả
mang thuốc doxorubicin lên đến 90%. Nghiên cứu in vitro cho thấy nanogel này
có khả năng xâm nhập vào nội bào Hela nhờ vào các thụ thể đường, thể hiện tiềm
năng phát triển làm hệ mang thuốc chống ung thư hiệu quả. Maeda và cộng sự
[69] đã đưa nhóm naphthalene vào các mạch nhánh của β-1,3-glucan
schizophyllan (nSPG). nSPG này được cho là dễ bị phát hiện bởi các thụ thể tế
bào miễn dịch Dectin-1, có khả năng tạo liên kết chéo vật lý và mang thuốc
doxorubicin (Dox) thông qua các tương tác kỵ nước. Từ các phương pháp kiểm tra
in vitro, so với SPG/Dox và chỉ riêng Dox, nSPG/Dox cho thấy hiệu quả tiêu diệt
các tế bào dRAW ở cùng nồng độ Dox.

29. Hình 1.6. Nanogel được điều chế từ polymer được biến tính chứa các gốc kỵ nước
[102]
Phương pháp 2: nanogel được hình thành từ quá trình polymer hỗn hợp các
monomer
Trong phương pháp này, nanogel được tạo thành từ monomer phải trải qua
2 công đoạn: quá trình polymer hóa và quá trình hình thành nanogel, thông thường
2 quá trình diễn ra đồng thời với nhau. So với phương pháp 1, điều chế nanogel
xuất phát từ monomer cho thấy hiệu suất cao hơn., trong đó, liên kết ngang hóa
học đóng vai trò thiết yếu của quy trình. Zhou và cộng sự [131] đã phát triển thành
công phương pháp trợ giúp quá trình tự kết tụ, tổng hợp nên nanogel từ quá trình
polymer hóa các monomer sử dụng dextran, 3-acrylamidophenylboronic acid
(AAPBA) và N,N′-methylene bisacrylamide (MBA). Nhóm carboxyl của AAPBA
và nhóm nhận proton của dextran tạo điều kiện cho việc kết tụ thông qua liên kết
hydro. So với các phương pháp đã báo cáo trước đây, điểm đặc biệt từ phương
pháp SAA đó là chuỗi poly AAPBA trở nên không tan trong môi trường phản ứng
bởi vì AAPBA monomer mang tính kỵ nước trong dung môi acid, nghĩa là hiệu
ứng kỵ nước này tạo điều kiện cho sự kết tụ của các polymer để hình thành
nanogel chứ không phải là do liên kết hydro. Thành công trong điều chế nanogel
dextran-PAAPBA chứng tỏ rằng phương pháp tiếp cận SAA có thể điều chế
nanogel từ các monomer kỵ nước, cho phép tổng hợp đa dạng các nanogel trên
nền dextran.

30. Hình 1.7. Quá trình hình thành nanogel CHPOA-PEGSH
Liên kết disulfide là nhóm chức mang tính kích thích-đáp ứng bởi vì nó có
thể bị phân hủy sinh học dưới tác dụng của chất khử hóa sinh như glutathione
(GSH), thioredoxin, và peroxiredoxin [45]. Nanogel hình thành dựa trên các liên
kết chéo cho thấy tiềm năng to lớn ứng dụng tải thuốc đến nội tế bào. Li et al. [67]
điều chế nanogel dựa trên dẫn xuất dextran–lipoic acid. Nanogel này được hình
thành liên kết dần dần bằng cách sử dụng một lượng xúc tác dithiothreitol (DTT),
chất này bền trong các dung môi pha loãng và dung môi có nồng độ muối cao.
Nanogel của công trình có hiệu suất mang thuốc lên đến 84%, khả năng tải thuốc
Dox nhanh chóng và hiệu quả đến hạt nhân tế bào. Liên kết disulfide không những
được sử dụng để liên kết chéo các polymer mà còn được sử dụng để đưa các nhóm
chức năng thiol lên polymer [36]. Liên kết chéo hóa học và vật lý cần các kỹ thuật
tổng hợp tối ưu khác nhau. Với việc ứng dụng nanogel làm hệ mang thuốc ngày
càng được mở rộng, nhiều nỗ lực to lớn nhằm thiết kế và điều chế các nanogel.
Phương pháp polymer hóa kết tủa là phương pháp đặc thù phù hợp để hình thành
các liên kết ngang vật lý giữa các nguyên liệu điều chế nanogel có khả năng tan
trong nước. Phương pháp này là phương pháp tối ưu để bắt lấy các thuốc kỵ nước
và các đại phân tử sinh học. Nanogel có các liên kết ngang hóa học thường được
điều chế từ các nhũ tương micro hoặc bằng cách polymer hóa các nhũ tương nano.
Tuy nhiên, các phương pháp này tương đối phức tạp và đòi hỏi nhiều bước tinh

31. sạch nhằm loại bỏ các monomer dư không phản ứng và chất hoạt động bề mặt
được sử dụng trong quá trình phản ứng nhằm duy trì tính ổn định của hệ nhũ
tương. Chính vì vậy, đã có nhiều công trình nhằm xây dựng các phương pháp thay
thế, điều chế nanogel trong các môi trường khác nhũ tương, một trong những
phương pháp cụ thể đó là sử dụng disulfide kém bền [100]. Polymer chứa 30%
oligoethyleneglycol methacrylate (đóng vai trò nhóm ưa nước, cho phép polymer
tan được trong nước) và 70% dẫn xuất pyridyl disulfide (PDS)-
thioethylmethacrylate (điều chế bằng phương pháp RAFT, reversible addition –
fragmentation chain transfer) polymer hóa tại các nhóm chức năng có khả năng
liên kết ngang. Một lượng vừa đủ DTT, chất làm đứt gãy liên kết PDS được thêm
vào dung dịch polymer. Tiếp theo đó, một phần trăm nhỏ nhóm PDS sẽ được
chuyển hóa thành thiol tự do, phản ứng với một lượng tương ứng các nhóm chức
năng PDS để tạo liên kết disulfide, liên kết ngang các chuỗi polymer. Tuy nhiên,
các nhóm chức năng PDS có thể bị bẻ gãy bởi thuốc lipophilic trong dung môi
nước do tính kỵ nước tương tự nhau. Các nanogel được tạo thành không qua hệ
nhũ tương có cấu trúc hình cầu với kích thước ~190 nm, quan sát rõ rang bằng
phương pháp TEM (transmission electron microscopy) và dynamic light
scattering. Nile red, chất nhuộm kỵ nước, được bọc bên trong các nanogel, được
giải phóng ở nồng độ thấp GSH (10 μM, tương ứng với lượng chất thấy được bên
ngoài tế bào và bên trong plasma máu) trong khi một lượng lớn thuốc nhuộm được
nhả ra ở nồng độ cao GSH (10 mM, tương ứng với lượng chất tìm thấy bên trong
tế bào). Kết quả cho thấy nanogel có thể nhả chất mang theo liều lượng kiểm soát
được bằng chất kích hoạt sinh học tương ứng. Ngoài ra, phản ứng trao đổi thiol–
disulfide với nhóm PDS giúp chức năng hóa khác nhau bề mặt nanogel. Nanogel
phản ứng với lượng dư fluoresceinisothiocyanate (FITC) hay FITC-SH (1 mg/ml),
và phổ phát xạ của nanogel được xử lý bởi thiol-modified FITC (FITC-SH) và
FITC cho thấy sự khác biệt đáng kể.
1.4. Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài.
1.4.1. Ngoài nước
Trên thế giới, hướng nghiên cứu áp dụng Công nghệ Nanô vào lĩnh vực Y-
Sinh-Dược như chẩn đoán, chữa trị bệnh, bào chế thuốc và các sản phẩm y dược
khác là một trong những hướng nghiên cứu mũi nhọn, thu hút được sự quan tâm

32. của đông đảo các nhà khoa học hàng đầu trong các lĩnh vực liên nghành (Vật liệu,
Hoá học, Sinh học phân tử, Điện tử...) với sự đầu tư mạnh mẽ của các Viện nghiên
cứu, phòng thí nghiệm, các hãng sản xuất....
Việc kiểm soát quá trình phân phối thuốc/protein để điều trị những căn bệnh
hiểm nghèo như HIV, Ung Thư, bệnh tiểu đường ….là một trong những thử thách
trong lĩnh vực Y dược. Hiện có nhiều loại dược phẩm (thuốc /protein) chứng tỏ
được khả năng chữa bệnh tốt, tuy nhiên các phương pháp sử dụng dược phẩm
truyền thồng như uống, tiêm, xạ trị, hóa trị để điều trị các loại bệnh trên có những
nhược điểm lớn như: sự tập trung đột ngột của thuốc/protein tại một điểm, lúc đó
thuốc/protein trở thành chất độc hại cho cơ thể ; Vì dược phẩm dược dẫn truyền
theo đường máu, chỉ khi gặp tế bào mầm bệnh (ung thư) thì mới thể hiện chức
năng chữa trị, nhưng trong quá trình vận chuyển dược phẩm này còn tác dụng lên
tất cả các tế bào khác mà nó gặp. Do đó chỉ có một lượng nhỏ dược phẩm có tác
dụng hữu hiệu cho việc điều trị, còn phần lớn dược phẩm lại tạo ra các phản ứng
phụ khác trong quá trình điều trị; Thêm vào đó, sự suy giảm hình thức (profile)
của thuốc/protein đến dưới khoảng liều dùng trong quá trình điều trị đòi hỏi một
liều thuốc/protein mới. Tất cả các nhược điểm trên hoàn toàn được khắc phục nếu
sử dụng hệ dẫn thuốc là các polyme y sinh có cấu trúc nano particle. Nhờ chúng có
ưu điểm vượt trội sau: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều.
Việc nghiên cứu sử dụng các polymer y sinh có cấu trúc nano làm chất dẫn
thuốc là một trong những ý tưởng có tính đột phá khoa học tuy nhiên mới chỉ là
những nghiên cứu bước đầu nhưng theo dự đoán khả năng áp dụng các nghiên cứu
này bắt đầu có thể triển khai trong tương lai gần.
Hiện nay, trong lĩnh vực y sinh học các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm
các vật liệu sinh học mới với các tính năng đặc biệt để phục vụ cho việc chữa bệnh
và phục vụ cuộc sống con người. Một trong những vật liệu được quan tâm nghiên
cứu nhiều nhất là các polymer sinh học có nguồn gốc thiên nhiên do khả năng
tương thích sinh học cao và dễ phân hủy sinh học của chúng. Một số
polysaccharide có nguồn gốc thiên nhiên thường được sử dụng làm nguyên liệu
ban đầu để điều chế các hạt nano là Cellulose, Alginate, Chitosan, Pullulan and
dextran, Hyaluronic acid, Ulvan và Polyhydroxyalkanoate ứng dụng trong y sinh
[22]. Trong số các polysaccharide kể trên chỉ có duy nhất ulvan là chưa có sản

33. phẩm được thương mại hóa. Chúng mới được nghiên cứu trong thời gian một vài
thập kỷ trở lại đây với quy mô trong phòng thí nghiệm.
Cấu trúc hóa học của ulvan
Trên thế giới, ulvan từ rong lục đã được các nhà khoa học quan tâm
nghiên cứu từ những năm 1950. Thời gian đầu, các nghiên cứu chủ yếu tập
trung vào việc chiết tách và xác định thành phần đường trong ulvan từ các loài
rong lục khác nhau. Brading [17] và Percival [83] đã xác định sulfate,
rhamnose, xylose, và glucuronic acid là các thành phần hóa học có trong ulvan.
Tuy nhiên, phải đến năm 1997, Quemener và CS [89], nhờ vào phương pháp
cắt mạch hóa học kèm enzyme, mới phát hiện ra iduronic acid cũng là một đơn
vị đường trong ulvan. Các tác giả cũng khẳng định rằng, thành phần đường, tỉ
lệ đường đơn, hàm lượng sulfate trong ulvan phụ thuộc rất nhiều vào loài rong,
vị trí địa lý nơi rong thu hái và thời điểm thu hái.
Lahaye, Robic và các CS [57, 58, 63] là nhóm nghiên cứu rất mạnh về
cấu trúc của ulvan trên thế giới hiện nay. Các công trình của nhóm nghiên cứu
này cho thấy rằng cấu trúc ulvan rất phức tạp và phụ thuộc nhiều vào loài rong
nghiên cứu. Các tác giả cũng đã quan tâm đến các sulfate đường hiếm như
rhamnose 3-sulfate và xylose 2-sulfate trong ulvan và cho rằng: Rhamnose,
thành phần chủ yếu của ulvan, được sử dụng như là tiền chất để tổng hợp các
hợp chất thơm tạo tiền đề cho khả năng ứng dụng L-rhamnose trong lĩnh vực
công nghiệp dược phẩm.
Ulvan là sulfate polysaccharide có điện tích cao hòa tan được trong nước
và được tạo bởi các thành phần chủ yếu là rhamnose, glucuronic, iduronic acid,
xylose và nhóm sulfate để tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide
chính là ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng A (β-D-GlcA (1→ 4) α-L-Rha 3S
→ 1) và ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng B (α-L-IdoA (1 → 4) α-L-Rha
3S → 1) (Hình 1.5) [68].
Lahaye, Robic và các CS [65, 99] đã nghiên cứu cấu trúc của ulvan từ
Ulva rigida bằng cách thủy phân tạo oligosaccharide và desulfate hóa. Cấu
trúc hóa học và chuỗi đường của những oligomer này được xác định bằng phổ
NMR. Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi liên kết glycoside có dạng sau: α-
L-rhamnosyl-(1→4)-D-xylose, β-D-glucuronosyluronic acid-(1→2)-α-L-

34. rhamnosyl-(1→4)-D-xylose, β-D-glucuronosyluronic acid-(1→4)-α-L-
rhamnose 3sulfate, β-D-glucuronosyluronic acid-(1→4)-[β-D-
glucuronosyluronic acid (1→2)]α-L- rhamnosyl -(1→4)-D-xylose và β-D-
glucuronosyluronic acid-(1→4)-[β-D-glucuronosyluronic acid-(1→2)]-α-L-
rhamnose. Sự phân nhánh ở các chuỗi liên kết thường xảy ra ở vị trí O-2 của
liên kết (1→4)-α-L-rhamnose là β-D-glucuronic acid; tác giả cũng khẳng định
lại rằng nhóm sulfate nằm ở vị trí O-3 của rhamnose. Các nghiên cứu sau đó
cho thấy các liên kết glycoside và vị trí sulfate này trong cấu trúc ulvan là phổ
biến cho các loài Ulva khác nhau.
Masakuni Tako và CS [72] đã thành công trong việc xác định cấu trúc hóa
học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa thu thập ở vùng biển Okinawa – Nhật Bản,
bằng các phương pháp phổ IR và NMR. Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi
liên kết glycoside có dạng sau: β-D-glucuronic acid hoặc α-L- iduronic acid
[(1→3)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-L-rhamnose, (1→4)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-L-
rhamnose-(1→4)-α-L-rhamnose-(1→4)-β-D-xylose. Sự phân nhánh ở các chuỗi
liên kết thường xảy ra ở vị trí O-2 của liên kết (1→4)-α-L-rhamnose là β-D-
glucuronic acid; tác giả cũng khẳng định nhóm sulfate nằm ở vị trí C-3 và C-2
của rhamnose; ở vị trí C-3 của xylose, chuỗi liên kết trong cấu trúc của ulvan có
dạng như ở Hình 1.8 dưới đây.
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa
You S. G. và CS [128] đã chiết tách ulvan từ Ulva pertusa ở biển Hàn
Quốc, bằng việc sử dụng các phương pháp GC/MS và NMR, các tác giả đã
khẳng định rằng, mạch chính của phân tử polysaccharide được tạo thành bởi
liên kết của α-(1→4)-L-rhamnose hoặc β-(1→4)-D-glucuronic acid với β-
(1→2)-L-rhamnose và β-(1→4)-D-xylose với sự phân nhánh ở vị trí O-2 của

35. (1→4)-rhamnose và nhóm sulfate hầu hết được tìm thấy trên glucuronic acid ở
vị trí O-3.
Costa, Alves và CS [26] đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva lactuca bằng
dung môi nước, mẫu ulvan thu được được đo khối lượng phân tử, xác định thành
phần hóa học và phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ NMR. Kết quả cho
thấy, mẫu ulvan thu được được tạo thành bởi các thành phần chính là rhamnose
(22.4%), glucuronic acid (22.5%), xylose (3.7%), iduronic acid (3.1%) và glucose
(1.0%); hàm lượng sulfate trong phân tử ulvan cũng rất cao (32.2%); khối lượng
phân tử của ulvan chiết tách được là rất cao (790 kDa). Cấu trúc của phân tử SP từ
rong lục Ulva lactuca được tạo thành chủ yếu bởi disaccharide ulvanobiuronic
acid 3-sulfate dạng A: [→4)-β-D-GlcA-(1→ 4)-α-L-Rha 3S-(1→] và một lượng
nhỏ của ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng B [→4)-α-L-IdoA-(1→ 4)-α-L-Rha
3S-(1→]. Lahaye Marc [65] đã nghiên cứu thành phần và cấu trúc của 2
oligosaccharide từ loài rong lục Ulva rigida được thu thập từ 2 vùng biển khác
nhau (Tây Ban Nha và Pháp). Kết qủa chỉ ra rằng thành phần đường của 2 ulvan
tách chiết được là giống nhau nhưng với tỷ lệ khác nhau; cấu trúc hóa học và
chuỗi polysaccharide trong 2 phân tử ulvan được nghiên cứu bằng phương pháp
phổ NMR, kết quả đã khẳng định rằng, cả 2 ulvan đều có cấu trúc mạch chinh
dạng ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng A3s [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha 3-
sulfate-(1→] nhưng chúng khác nhau ở mạch nhánh và vị trí phân nhánh. Như
vậy, thành phần và cấu trúc của ulvan từ cùng một loài rong phụ thuộc vào vị trí
địa lý nơi rong sinh sống.
Hoạt tính sinh học
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của ulvan cho thấy tất cả các ulvan chiết từ
các loài rong lục khác nhau thuộc 02 chi rong Ulva và Enteromorpha đều thể hiện
các hoạt tính sinh học sau: Hoạt tính chống oxi hóa, chống đông máu, hạ mỡ máu
và chống đọc gan, hoạt tính điều hòa miễn dịch và chống ung thư, kháng nấm, tăng
cường hệ miễn dịch [68] (Bảng 1)
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của polysaccharide dạng ulvan chiết từ một số loài
rong xanh thuộc 2 chi rong Ulva và Chaetomorpha
Hoạt tính sinh học Nguồn gốc rong Tài liệu trích dẫn

36. Hoạt tính chống oxi hóa
(Antioxidant)
Enteromorpha
intestinalis, Ulva pertusa,
U. lactuca
[27, 33, 87]
Hoạt tính chống đông tụ
máu
Enteromorpha clathrata,
E. compressa, Ulva
lactuca, Ulva lactuca
U. fasciata, U. reticulata
[70,104]
Hoạt tính hạ mỡ máu Ulva pertusa, U. lactuca [103]
Hoạt tính kháng virut Ulva.sp, U. lactuca, U.
fasciata
[33, 75]
Hoạt tính chống ung thư Enteromorpha
intestinalis, Ulva lactuca,
ulva fasciata
[53, 106]
Các kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của các polysaccharide chiết từ 02 chi
rong Ulva và Enteromorpha cho thấy hàm lượng sulfat, khối lượng phân tử và sự
phân nhánh đóng vai trò quan trọng đến hoạt tính sinh học của polysaccharide
chiết từ rong lục.
Phương pháp tách chiết ulvan.
Ulvan là thành phần polysaccharide được phân bố trên thành tế bào của rong
lục [64, 94], phương pháp chiết ulvan dựa trên đặc tính của một anion
polysaccharide và các thành phần khác của rong lục, bao gồm 2 giai đoạn chiết
sau.
Giai đoạn tiền xử lý rong : các chất được chiết trong dung môi hữu cơ, mục
đích của giai đoạn này là nhằm loại bỏ các chất chuyển hóa thứ cấp như
polyphenol, lipite….Dung môi thường dùng alcohol, cloroform... Mới đây để thu
hồi các nhóm sản phẩm chuyển hóa thứ cấp khác nhau Shonima Govindan M, năm
2012 đưa ra phương pháp tiền xử lý rong bằng các dung môi hữu cơ lần lượt như
petroleum ether, chloroform và acetone, sau đó mới chiết như các công bố khác
[106]. Nhìn chung, để loại bỏ lipid và các hợp chất màu trước khi chiết, các nhà
khoa học thường sử dụng dung môi chủ yếu là ethanol. Như công trình [48], bột

37. rong được đun sôi trong ethanol 70o
trong 1 tiếng, sau đó được ly tâm để thu bột
rong và loại ethanol.
Giai đoạn chiết ulvan polysaccharide. Trong thành phần của ulvan có chứa
các axit aldobiouronic và nhóm sulfat, chúng tồn tại trong thành tế bào của cây
rong chủ yếu dưới dạng muối ít tan của kim loại hóa trị 2 là Canxi (Ca). Vì vậy để
chiết ulvan cần phải hòa tan muối của Ca. Chính vì vậy phương pháp chiết ulvan
thường sử dụng là phương pháp chiết nước nóng và bổ xung các chất tạo phức
chelat với Ca như sodium oxalate, ammonium oxalate [61, 96], và các tác nhân
hòa tan muối canxi khác Kiềm, sodium chlorite, DMSO, acetic acid, nước hoặc
axit (HCl) [94, 98, 97, 46]. Điều thú vị là tùy điều kiện chiết khác nhau mà hàm
lượng axit uronic, các gốc đường trung tính và khối lượng phân tử là hoàn toàn
khác nhau. Để thu được hiệu suất chiết ulvan cao nhất, khi sử dụng hệ chiết nói
trên các thông số tối ưu tương ứng là sodium oxalate (50 mM, pH 6.5, 2 h, 85 0
C),
ammonium oxalate (20 mM, pH 4.6, 1 h, 85 0
C) và HCl (50 mM HCl, 0.5 h or 1 h
at 85 0
C). Phụ thuộc vào loài rong và cấu trúc hóa học của ulvan mà các điều kiện
chiết tối ưu là hoàn toàn khác nhau. Tùy theo mục đích sử dụng của sản phẩm chiết
ulvan mà phương pháp chiết có thay đổi. Với mục đích thu nhận các nhóm ulvan
có cấu trúc gần nhau, Ray B. và M. Lahaye năm 1995 [94], đã chiết ulvan tuần tự
trong môi trường Na oxalate, nước, sau đó là môi trường kiềm nồng độ khác nhau
và phân đoạn sản phẩm trên nhựa trao đổi ion, đây là phương pháp chiết tổng quát
hơn. Trên cở sở các sản phẩm chiết nhận được, Ray B. và M. Lahaye đã đưa ra
định nghĩa chung cho ulvan là “sulfated glucuronorhamnoxyloglycans”. Tập thể
tác giả này, đã chiết các polysaccharide từ thành tế bào của rong Ulva bằng dung
dịch acid oxalic nóng, nước nóng, dung dịch KOH 1M, KOH 4M ở nhiệt độ phòng,
thành phần hóa học của các chất tan và không tan trong nước, các phân đoạn của
chất chiết tan trong nước trên DEAE-Sepharose CL-6B được xác định. Như vậy có
thể cho rằng tùy theo mục đích của việc sử dụng ulvan và phụ thuộc vào từng loài
rong mà có thể lựa chọn phương pháp chiết khác nhau.
Một phương pháp khác hỗ trợ cho quá trình chiết polysaccharide từ rong khi
sử dụng các enzyme như cellulase để thủy phân cellulose, proteinase để thủy phân
protein, amylase để thủy phân tinh bột [20]. Dung môi chiết có bổ sung enzyme có

38. giá trị pH đỡ “khắc nghiệt” hơn, giảm sự thủy phân ulvan nhưng cần xử lý enzyme
sau khi chiết.
Mặc dù có rất nhiều công trình về quy trình tách chiết polysaccharide dạng
ulvan từ rong lục nhưng tất cả các quy trình đều có điểm chung là các quy trình đều
có quy mô phòng thí nghiệm với lượng rong nguyên liệu sử dụng ban đầu tư 5-100
g và tất cả giai đọan chiết ulvan đều tiến hành chiết nhiều lần với các dung môi
chiết khác nhau. Đây là thách thức không nhỏ trong việc xây dựng quy trình tách
chiết ulvan đơn giản, hiệu quả và ổn định từ rong lục sinh trưởng tại Việt Nam.
Ứng dụng ulvan trong y sinh
Trong một vài năm trở lại đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra các sulfate
polysaccharide dạng nano ulvan chiết từ các loài rong lục, có cấu trúc hóa học
tương tự như các glycosaminoglycans (GAGs) của động vật có vú và chúng có
tính chất hóa học tương tự các hyaluronan và choidrotin sulfate do trong phân tử
của chúng có chứa đồng thời nhóm sulfate và glucoronic acid. Sự có mặt 02 nhóm
điện tích này tại các gốc đường khác nhau làm cho các sulfate polysaccharide dễ
dàng tham gia biến đổi hóa học tạo thành các sản phẩm ulvan có cấu trúc rỗng
dạng sợi nano [114], hạt nano và cấu trúc mạng lưới polyme hydrogel [12], tạo
nhiều kiểu liên kết ngang khác nhau [11, 78]. Hơn nữa sự có mặt của 03 nhóm ưa
nước trong phân tử của chúng là hydroxyl, cacbonyl và sulfat làm tăng khả năng
bám dính với mô sinh học giống như biểu mô và màng sử dụng nhiều trong lĩnh
vực vật liệu dẫn thuốc. Chính vì vậy các nano ulvan polysaccharide thu nhận từ
một số loài rong lục được coi như là nguyên liệu ban đầu để tạo ra các hệ chất dẫn
thuốc khác nhau.
Một ưu điểm vượt trội của ulvan so với một số polysaccharide tự nhiên khác
có thể sử dụng làm hệ dẫn thuốc, đó là chúng có hoạt tính sinh học và quan trọng
hơn cả là nguyên liệu sản xuất chúng là loài rong lục. Đây là loài thực vật biển có
sinh khối phát triển nhanh và có thể tự tái tạo trong tự nhiên. Vì vậy chi phí sản
xuất chúng sẽ thấp có thể cạnh tranh với các polyme tổng hợp. Kết quả này mở ra
khả năng ứng dụng ulvan trong y sinh đầy triển vọng và có thể ứng dụng trong
thực tế.

39. Hình 1.9. Cấu trúc sợi nano được hình thành bởi tác dụng của Ulvan với PVA
poly(vinyl alcohol) / H3BO3/Ca2+
thông qua các liên kết hydrogel. [114]
Mặc dù vậy theo tài liệu tham khảo mà chúng tôi nhận được thì các nghiên
cứu về nano ulvan mới bắt đầu được tiến hành trong thập kỷ trở lại đây. Toskas
cùng các cộng sự là một trong nhóm khoa học đầu tiên công bố về điều chế và ứng
dụng ulvan ở kích thước nano. Năm 2011, nhóm đã công bố công trình điều chế
sợi nano ulvan bằng phương pháp quay điện hóa [114]. Gel ulvan ban đầu được
hình thành bằng cách bổ sung vào dung dịch ulvan H3BO3 và CaCl2. Dung dịch gel
đồng nhất tiếp tục được phối trộn với Polyvinylalcohol ở các tỷ lệ khác nhau trước
khi được đưa vào quy trình quay điện hóa. Sợi nano sản phẩm có đường kính trung
bình dưới 84 nm, cấu trúc tinh thể có độ trật tự cao, tiềm năng ứng dụng cao trong
y sinh. Năm 2012, Toskas và công sự tiếp tục công bố về tạo ra màng micro ulvan-
chitosan mà trên bề mặt xuất hiện các lỗ xốp kích thước đo được là từ 23 đến 58
nm [116]. Màng nano này có tác dụng thúc đẩy sự bám dính và nhân sinh của các
tế bào xương 7F2. Kết quả nghiên cứu này đã được đăng ký patent [115]. Gần đây,
nhóm tác giả này tiếp tục công bố về tạo biocomposite nanofibres dựa trên nền
ulvan/PCL và ulvan/PEO hướng tới ứng dụng trong vật liệu y sinh [55]. Ngoài ra
còn có các nghiên cứu của nhóm tác giả Alaves và Công sự về tạo ulvan dạng nano
để phục vụ cho việc nghiên cứu cấu trúc 2 D của hạt nano ulvan, dự báo khả năng
ứng dụng trong vật liệu y sinh và có một công bố đưa ra ứng dụng cụ thể hơn. Đó
là sử dụng ulvan-PDLLA có cấu trúc 3D rỗng để làm cố định xương [11, 12]. Như
vậy các nghiên cứu gần đây về ulvan được biết như là polyme đầy tiềm năng cho
sự phát triển vật liệu gel cho mục đích ứng dụng y sinh. Việc tạo liên kết ngang
vật lý hay hóa học đều liên quan đến việc điều chế ulvan hydrogel và sau đó là
dạng nano ulvan bằng cách nghiên cứu tạo phức poly điện ly (polyelectrolyte) với

40. chitosan, tạo hydride nanofibre bằng khuấy trộn vật lý với các polyme tương thích
sinh học hoặc tạo mạnh lưới liên kết cộng hóa trị .[116, 55, 15, 12, 11, 78 ]. Tất cả
các liên kết kể trên đều liên quan đến các nhóm ưa nước trong phân tử ulvan là
sulfate, hydroxyl và nhóm cacboxyl.
Qua tham khảo tài liệu cho thấy chưa có quy trình cụ thể nào để điều chế hạt
nano làm chất dẫn thuốc từ polysaccharide dạng ulvan chiết từ rong lục trong khi
có rất nhiều nghiên cứu công bố về việc điều chế hạt nano từ các polysacchride tự
nhiên hướng đến làm chất dẫn thuốc như alginate, chitosan, tinh bột, … Tùy theo
cấu trúc của polysaccharide mà quy trình điều chế sẽ thay đổi. Tuy nhiên quy trình
chung để điều chế hạt nano thường chia là 02 bước chính sau. Đầu tiên là thực
hiện việc chuyển hóa polysaccharide nhằm thu được các copolymer dạng
amphiphilic hoặc các chất có thể tạo gel kiểu liên kết cộng hóa trị, liên kết ion và
sau đó thực hiện một số các kỹ thuật khác nhau để thu được các hạt nano polymer.
Các kỹ thuật chủ yếu hay dùng là bay hơi dung môi nhũ tương hóa, khuyếch tán
dung môi trong hệ nhũ tương, phân tử tự lắp ghép và kỹ thuật thẩm tách trong hệ
dung môi không hòa tan và hòa tan polymer.
1.4.2. Trong nước
Với thông tin không nhiều về quy trình tạo vật liệu nano ulvan từ rong xanh
thì việc đưa ra quy trình với quy mô phòng thí nghiệm là 2g/mẻ, chúng tôi sẽ phải
đưa ra quy trình với những thay đổi về tác nhân chuyển hóa polysaccharide dạng
ulvan thích hợp với cấu trúc phân tử của chúng gồm 3 nhóm chức ưa nước là
hydroxyl, sulfate và nhóm carboxylic từ những thông tin chủ yếu là các chuyển
hóa của các polysaccharide chỉ có từ 1 đến 02 nhóm chức ưa nước như alginate,
chitosan, tinh bột...... Đây là khó khăn khi thực hiện đề tài cần phải giải quyết để
đưa ra quy trình ổn định thu được sản phẩm hạt nano.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về polysaccharide sinh học có nguồn gốc từ tài
nguyên biển đã được nghiên cứu từ những năm 90 của thế kỷ trước tại một số cở
sở nghiên cứu như Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện
Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học
Nha Trang nhưng chủ yếu tập trung vào xây dựng quy trình tách chiết, xác định
cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số polysaccharide như chitosan, alginate,
carrageenan, agar, fucoidan trong đó sản phẩm fucoidan đã được thương mại hóa.

41. Tuy nhiên việc nghiên cứu ứng dụng những polysaccharide ứng dụng trong y sinh
cụ thể là ứng dụng dẫn thuốc còn ít được quan tâm nghiên cứu. Cho đến những
năm 2000 đã có những nghiên cứu bước đầu về polime phân hủy sinh học [3, 4]
tại Trung tâm Vật liệu Polime- Composit, Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Hóa
học Công nghiệp VN (Bộ Công thương).
Trong vài năm trở lại đây đã có một số cơ sở nghiên cứu về vật liệu nano y
sinh của Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, ĐH KHTN Hà Nội, Khu công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh. Các đối
tượng của các nghiên cứu trên là về hệ Fe3O4, về hạt từ nano ứng dụng đính kháng
nguyên kháng thể và về hạt từ nanô cho chụp ảnh Cộng hưởng từ hạt nhân MRI
[42, 84]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam có thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế “Nghiên
cứu chế tạo các cấu trúc polime nano ứng dụng y sinh trong hệ dẫn thuốc (mục
tiêu điều trị) và cảm biến miễn dịch (mục tiêu chẩn đoán)” mà đối tượng nghiên
cứu là một số polymer sinh học có nguồn gốc tự nhiên là chitosan/ carrageenan/
alginate. Tuy nhiên nhóm tác giả chỉ sử dụng các polyme sinh học này dưới dạng
thương phẩm.
Nước ta có hơn 3200 km bờ biển với nguồn tài nguyên rong biển rất phong
phú và đa dạng trong đó rong lục mà chủ yếu là các loài thuộc chi Ulva, Caulerpa,
Chaetomorpha, Enteromorpha, Cladophora là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn
nhất với trữ lượng ước tính lên tới hàng ngàn tấn khô/năm. Nguồn tài nguyên này
dường như bị quên lãng và một số loài rong thuộc chi ulva được coi như là một
trong những rác thải của biển gây ô nhiễm môi trường ven biển.
Trong những năm gần đây đã có các công trình nghiên cứu qui trình tách
chiết, thành phần, cấu trúc, hoạt tính, của các chất có hoạt tính sinh học từ một số
loài rong biển Việt Nam, tuy nhiên đối tượng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào
các loài rong thuộc 02 ngành rong nâu và rong đỏ trong khi các nghiên cứu về
rong lục rất ít ỏi. Đặc biệt là các nghiên cứu về về polysaccharide dạng ulvan từ
rong lục hầu như chưa được nghiên cứu. Với sản lượng lên đến 42.000 tấn
khô/năm trong đó hàm lượng polysaccharide chiếm tới 10 % rong khô, vì vậy rong
lục sẽ là nguyên liệu tiềm năng để sản xuất polysaccharide ứng dụng trong trong
công nghiệp dược phẩm, thực phẩm.

42. Qua tổng quan tình hình nghiên cứu về polysaccharide dạng ulvan chiết từ
rong lục cho thấy rằng chúng là nguyên liệu tiềm năng để chế tạo chất dẫn thuốc
trong y sinh học mà các nhà nghiên cứu mới phát hiện trong thập kỷ trở lại đây
nhờ khả năng tương thich sinh học cao, ổn định, an toàn, không độc hại, ưa nước
và có phân hủy sinh học. Hơn thế nữa chúng lại có phổ hoạt tính sinh học rộng bao
gồm các hoạt tính sinh học như chống đông tụ máu, chống oxy hóa , chóng khối
u...
Từ những nhận định trên chúng tôi cho rằng đây là đề tài nghiên cứu cơ bản
định hướng ứng dụng, có ý nghĩa Khoa học và thực tiễn cao.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
Các mẫu rong biển được thu thập tại vùng biển Nha Trang và vào tháng 1 và
tháng 4 năm 2015. Mẫu rong biển sau khi thu thập về được rửa sạch rác, cát, mùn
bằng nước biển rồi đem phơi khô trong bóng râm, sau đó nghiền mịn thành bột rồi
đem cất trong bao bì để lạnh dùng cho các nghiên cứu. Danh sách các loài rong,
địa điểm và thời gian lấy mẫu được đưa ra trên Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách loài rong địa điểm và thời gian lấy mẫu
Stt Họ Chi Loài Địa điểm và thời
gian lấy mẫu
01 Ulvaceae Ulva Ulva lactuca (Linnaeus) Hòn Một- Nha
Trang 4-2015

43. 02 Ulva reticulata (Forsskål.) Hòn chồng – Nha
Trang 4-2015
03 Enteromorpha Enteromorpha intestinalis
(Linnaeus)
Hòn đỏ - NHa
Trang. n1-2015
04 Enteromorpha
torta(Mertens & Trevisan)
Vĩnh Thái Nha
Trang 1-2015
05 Cladophoraceae Chaetomorpha Chaetomorpha linum
(Kütz.)
Vĩnh Thái Nha
Trang. 1-2015
06 Cladophora Cladophora socialis
(Kütz.)
Vĩnh Thái Nha
Trang. 1-2015
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phân tích thành phần hóa học chính của các mẫu rong thu thập được.
- Xác định độ ẩm, độ tro theo phương pháp AOAC, các thí nghiệm được thực
hiện 03 lần sau đó lấy giá trị trung bình [13]
- Xác định hàm lượng polysaccharide trung tính và polysaccharide điện tích
theo phương pháp của Zvyagintseva T. N và cs sử dụng bột cột teflon kỵ nước
[133].
- Phân tích thành phần đường polysaccharide theo theo phương pháp của
Bilan và cộng sự sau khi thủy phân polysaccharide bằng acid trifloacetic (TFA)
[71].
- Phân tích hàm lượng sulfate bằng phương pháp đo độ đục [32].
- Phân tích hàm lượng acid uronic bằng phương pháp carbazol [16] .
2.2.2. Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ một loài rong lục
thuộc chi ulva.
- Chiết tách polysaccharide điện tích sử dụng dung môi nước
Rong tươi Rửa Loại màu, lipid Sấy, nghiền
Bột rong
Chiết 2 lần bằng H2O
Dịch chiết
Ethanol
Cô quay, lọc
Kết tủa
50
o
C
Vcồn
: Vdịch
= 4 : 1

44. Hình 2.1: Sơ đồ quy trình tách chiết polysaccharide điện tích
Chiết 10g bột rong trong dung dịch chiết ở điều kiện cơ sở là nước có pH=6,0
tỷ lệ dung môi:nguyên liệu là 20:1 (mL/g), thời gian chiết là 2 giờ, nhiệt độ chiết
là 80o
C. Ở các thí nghiệm sau đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố là
pH dung dịch chiết, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, thời gian chiết và nhiệt độ chiết
lên quá trình chiết bằng cách thay đổi các giá trị của mỗi yếu tố trong khi giữ ba
yếu tố còn lại ở giá trị cơ sở.
Lọc dịch chiết lần 1 bằng giấy lọc whatman. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở
điều kiện tương tự rồi lọc thu dịch chiết. Dịch chiết 2 lần được ly tâm với tốc độ
quay 10.000 vòng/phút để thu dịch trong. Cô quay dịch trong đến thể tích 100 mL,
sau đó cho vào 400 mL ethanol để tủa polysaccharide.
Tủa polysaccharide được rửa 3 lần bằng ethanol 80o
, 3 lần bằng ethanol tuyệt
đối rồi hòa tan vào nước khử ion. Đem đông khô thu sản phẩm polysaccharide.
Cân hiệu suất sản phẩm thu được. Polysaccharide tiếp tục được tách
polysaccharide điện tích và trung tính bằng nhựa cetavlon
(hexadecyltrimethylammonium bromide) và phân tích thành phần hóa học các sản
phẩm tách được
- Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

45. Bốn yếu tố được lựa chọn để khảo sát là pH dung dịch chiết, tỷ lệ dung
môi:nguyên liệu, thời gian chiết, nhiệt độ chiết.
Thí nghiệm cơ sở được tiến hành khi chiết 10 g bột rong trong dung dịch
chiết là nước có pH=6,0 với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu (mL/g) là 20:1, thời gian
chiết là 2 h, nhiệt độ chiết là 80o
C. Ở các thí nghiệm tiếp theo, khảo sát lần lượt
ảnh hưởng của từng yếu tố chiết đến quá trình chiết polysaccharide bằng cách thay
đổi giá trị yếu tố đó trong khi giữ 3 yếu tố còn lại ở giá trị cơ sở. Giá trị các yếu tố
khảo sát được trình bày ở bảng 2.1. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, kết quả
hiệu suất chiết và hàm lượng polysaccharide trung tính là giá trị trung bình 3 lần
đo.
Bảng 2.2: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết polysaccharide.
Tỷ lệ rong: dung môi
(g/mL)
pH Thời gian (h) Nhiệt độ (o
C)
1:5
1:10
1:15
1:20
1:25
1:30
1:35
1:40
1
3
6
7
9
12
13
0.5
1
2
3
4
5
40
50
60
70
80
85
90
100
- Tối ưu hóa điều kiện chiết
Sau khi đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết, ta tiến hành giới
hạn khoảng giá trị của mỗi điều kiện chiết, thiết kế thí nghiệm nhằm xác định điều
kiện tối ưu bằng phần mềm MODDE 5.0 (Umetrics AB, USA).
2.2.3. Xây dựng quy trình chuyển hóa các ulvan polysaccharide thành nano
ulvan polysaccharide
- Thủy phân polysaccharide dạng ulvan theo US patent 2009/017810 A1 [118]

46. 15 g ulvan hòa tan trong 1000 ml nước để đạt ở nồng độ 1.5 % (w/v). Sau đó,
bổ sung acid ascorbic và H2O2 để đều đạt được nồng độ 30 mmol/L . Dung dịch
được khuấy thành hỗn hợp đồng nhất và thực hiện phản ứng thủy phân trong điều
kiện khuấy nhẹ tại 300
C trong thời gian 2 giờ và 6 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng
, dung dịch được thẩm tách với nước cất qua màng siêu lọc MWCO 3500. Dịch
đem đông cô thu được ulvan có khối lượng phân tử thấp.
Phép đo khối lượng phân tử bằng phương pháp sắc ký lọc gel GPC (Gel
Permeation Chromatography) được thực hiện ở Phòng Thí Nghiệm Phân tích
Trung Tâm - ÐH Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, trên máy HPLC
Agilent 1100. Pha động 0.1N NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID.
- Acetyl hóa ulvan khối lượng phân tử thấp theo phương pháp [117, 124, 50, 130]
0,2 g ulvan (UL-H) đã thủy phân hòa tan trong 25 ml H2O khử ion, thêm vào
lần lượt 15 ml Isobutanol, 5 ml Pyridine và 5 ml Isobutyl Chloroformate. Khuấy
từ 12h, thẩm tách 3 ngày cho đến khi dung môi và sản phẩm phụ chỉ còn một lớp
mỏng nổi trên mặt nước trong túi thẩm tách. Loại dung môi, thu dịch trong suốt.
Đông khô dịch thu sản phẩm ulvan khối lượng phân tử thấp đã được acetyl hóa.
(Ký hiệu: Bc.U)
Ulvan acetyl được tổng hợp theo phương pháp của Xiao-xiao Liu và CS
[50, 124] và có thay đổi cho phù hợp như sau: 15 g ulvan được hòa tan trong cốc
thủy tinh có dung tích 2 lít với 180 ml nước, thêm 180 ml NaOH 1M khuấy mạnh
tại nhiệt độ 300
C trong 2 giờ để tạo sodium ulvan, thêm tiếp 180 ml anhydric
acetic, phản ứng xảy ra trong điều kiện khuấy từ với bể điều nhiệt tại 750
C trong
10 giờ. Hỗn hợp được điều chỉnh về pH = 7,0, cất loại dung môi, thẩm tách qua
màng MWCO 3500 và kết tủa bằng ethanol. Ulvan acetyl (AcU-H), được sấy khô
tại 500
C đến khối lượng không đổi.
. Xác định nồng độ kết tụ tới hạn CAC (Critical Aggregation Concentration)
CAC là giá trị nồng độ mà tại đó chất khảo sát như polymer chuyển trạng thái
từ phân tán trong dung môi bắt đầu kết tụ tạo các hạt nanogel. Nồng độ CAC được
xác định bằng cách sử dụng pyrene là chất chỉ thị huỳnh quang [24, 41] [123].
Pyrene là chất có xu hướng bám lên các tâm kỵ nước của hạt nanogel, thay đổi

47. tính chất quang lý. Giá trị quang lý của phân tử pyrene khi bám lên các tâm kỵ
nước khác giá trị quang lý của chúng khi phân tán trong dung dịch nước. Ở nồng
độ CAC, có sự dịch chuyển của pyrene từ môi trường phân cực trong dung môi
(phổ kích thích huỳnh quang của pyrene có đỉnh cao nhất ở giá trị 335 nm) vào các
vùng không phân cực là các tâm kỵ nước trên hạt nanogel (phổ kích thích huỳnh
quang của pyrene có đỉnh cao nhất ở giá trị 338 nm).
Pyrene được hòa tan vào acetone, sau đó thêm nước vào để dung dịch pyrene
đạt được nồng độ 5 x 10-7
M. Acetone dần được loại bỏ bằng cách khuấy dung
dịch ở áp suất thấp trong 6 h. Tiến hành pha các mẫu E.U-H và AcU bằng dung
dịch pyrene với nồng độ từ 0.0001 đến 0.1 g/L.
Phổ kích thích tại các nồng độ khác nhau EU-H và AcU-H được thu với bước
sóng phát xạ 390 nm và phổ phát xạ được đo tại bước sóng kích thích 339 nm.
Phổ phát xạ huỳnh quang của mẫu curcumin trong nước và curcumin trong
AcU trong khoảng bước sóng từ 450 nm đến 650 nm được đo tại bước sóng kích
thích là 319 nm.
Các phổ huỳnh quang được đo tại nhiệt độ phòng bằng hệ thiết bị đo là máy
quang phổ huỳnh quang Hitachi F-2500. tại Đại học Duy Tân – Đà Nẵng.
- Ảnh hưởng của nồng độ AcU đế kích thước hạt nano gel.
Nanogel được chuẩn bị bằng phương pháp thẩm tách : Hòa tan 25, 50, 100, 150
và 200 mg AcU-H trong 10 ml DMSO để thu được dung dịch có nồng độ 25, 50,
100, 150 và 200 mg/10 ml . Dung dịch đem lọc và thẩm tách với nước cất trong 2
ngày sử dụng màng lọc rây phân tử có kích thước 10 KDA. Dung dich nanogel
được bảo quản tại 50
C dùng để nghiên cứu tiếp theo.
- Đo kích thước hạt trên máy (Mastersizer-2000, Malvern, UK ). Tại Viện khoa
học Vật liệu – Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ việt Nam. Theo phương pháp
động học tán xạ ánh sáng (dynamic light scattering (DLS)).
2.2.4. Nghiên cứu cấu trúc hóa học và cấu hình không gian các sản phẩm ulvan
polysaccharide và nano ulvan polysaccharide.
- Xác định khối lượng phân tử của ulvan bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel
(GPC) được thực hiện ở Phòng Thí Nghiệm Phân tích Trung Tâm - ÐH Khoa học

48. Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, trên máy HPLC Agilent 1100. Pha động 0.1N
NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID.
- Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ môn
Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Phổ NMR của mẫu nghiên cứu bao gồm UL, AcU-H, EU-H được đo ở nhiệt độ
70ºC, với dung môi D2O, trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng D2O làm dung môi,
DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid) làm chất chuẩn nội. Với chế độ
đo khử tín hiệu của nước.
- Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LTQ Orbitrap XLTM
, Thermo
SCIENTIFIC kiểu ion hóa âm tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên Hà Nội, dung môi MeOH : H2O = 1:1. Khí phun mù là N2 với áp suất khí là
30psi với tốc độ phun khí 650 lít/giờ tại nhiệt độ là 1800
C.
Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)
Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại Photon
Factory, Tsukuba, Nhật Bản.
Tia X được phát ở bước sóng  = 0,149 nm.. Phép đo kéo dài 600 giây để
đảm bảo đủ thời gian đo cần thiết mà mẫu không bị phá hủy bởi tia X. Kết quả
được tính toán bằng đồ thị Kratky (q2
I(q) vs q) và đồ thị Guinier (ln(qI(q)) vs q2
).
Ở đây, I(q) là cường độ tán xạ và q được định nghĩa bằng (4)sin( với  là
bước sóng,  là góc tán xạ. Từ đồ thị Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc có thể
xác định được. Giá trị Rgc cho biết cấu trúc không gian của chất đo ở kính thước cỡ
nano [113].
Chuẩn bị mẫu đo:
Mẫu ulvan nồng độ 1 mg/ml trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M
được chuẩn bị cho phép đo SAXS.

49. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) và TEM
Ảnh SEM và TEM được chụp trên hệ thiết bị (FE-SEM, MIRA-II Tescan,
Czech), Transmission Electron Micrfoscope (TEM) (JEM-2100F -Jeol, Japan) tại
khoa hóa , Đại học changwon Hàn Quốc.
2.2.5. Thử hoạt tính sinh học của các ulvan polysaccharide và nano ulvan thu
được
Các phép thử hoạt tính sinh học được thực hiện tại Phòng Thử nghiệm
sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Phòng Hóa phân tích và triển khai công
nghệ - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, thuộc Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Hoạt tính gây độc tế bào
Xác định hoạt tính độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm bao
gồm: HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và Hela (ung thư cổ tử cung) theo
phương pháp của của Monks [77]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein
tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi
thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị
OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng
tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
Giá trị phần trăm sống sót (CS % Cell Survival) là khả năng sống sót của tế
bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh
giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) được tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn
Độ lệch σ được tính theo công thức:

50. Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i; : giá trị OD trung bình; n: số giếng
thử lặp lại.
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± σ) sẽ được chọn ra cho thử
nghiệm để tìm giá trị IC50.
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine
(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở
các nồng độ 10 µg/mL; 2 µg/mL; 0,4 µg/mL; 0,08 µg/mL. DMSO 10% luôn được
sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ
được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve.
- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Thử hoạt tính kháng khuẩn được tiến hành bằng phương pháp khuyếch tán đĩa
thạch theo phương pháp của Vanden và CS [119] với 100 µl dịch nuôi cấy có chứa
107
– 108
CFU/ml khuẩn và lượng dịch chiết sử dụng là 200 µl để thử hoạt tính
Kháng sinh kiểm định bao gồm: Cloramphenicol (10 mg/đĩa) đối với
khuẩn Gr (+), Tetracylin (30 mg/đĩa) đối với vi khuẩn Gr (-).
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm :
- Vi khuẩn Gr (-):
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Listeria monocytogenes
Raoultella terigena
- Vi khuẩn Gr (+):
Bacillus cereus
Streptococcus faecalis
Staphylococcus aureus
Nấm men: Candida albicans
Vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Trypcase soya broth
(TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong
môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn).
Mẫu được hoà tan trong dung môi nước bằng máy Vortex với nồng độ 4-10
mg/ml. Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng, mỗi giếng 10 µl mẫu.