1. Pendahuluan
KCKT atau HPLC merupakan suatu teknik
kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa
diamnya berupa cairan atau padat. Ciri teknik ini
adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim
fase gerak ke dalam kolom.
Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan
setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya
diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut (kuantitatif)
3. Kolom HPLC
Kolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus yang
panjangnya antara 3 dan 15 cm dan pada dinding bagian
dalam kadang-kadang dilapisi dengan material inert seperti
kaca atau PEEKÂ ®. Kolom bisa terbuat dari sejenis plastik
disebut cartridge, atau terbuat dari stainless steel.
Kolom
pada
Kromatografi
Cair
Kinerja
Tinggi
(KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat penting,
sebab pemisahan komponen-komponen sampel akan
terjadi di dalam kolom.
4. Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama
dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan
dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh
terhadap performan kromatogram
Oleh karena itu ada beberapa hal yang harus diperhatikan,
yaitu
1. Pemilihan kolom yang sesuai
2. Pemeliharaan kolom
3. Uji terhadap spesifikasi kolom (walaupun kolom tersebut
merupakan kolom yang siap dipakai).
http://www.catatankimia.com
8. Fase Diam Kolom
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen.
Dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya, maka
kolom HPLC dibedakan atas Kolom Fasa Normal dan
Kolom Fasa Terbalik (Reversed Phase Column).
http://www.catatankimia.com
9. Kolom Fasa Normal
Kromatografi dengan kolom konvensional mempunyai
fasa diam normal yang bersifat polar, misalnya silika gel.
Sedangkan fasa geraknya bersifat non polar, sehingga
analit yang akan dipisahkan adalah analit yang bersifat
non polar.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom
akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih
cepat melewati kolom.
http://www.catatankimia.com
10. Kolom Fase Terbalik
Kolom fasa terbalik adalah kolom yang fasa
diamnya bersifat non polar, sedangkan fasa
geraknya bersifat polar, kebalikan dari fasa
normal.
11. Pemilihan Kolom
Ada beberapa cara yang dapat digunakan yaitu :
1. Tetapkan Tujuan Pemisahan Anda. Tentukan apakah
aplikasi Anda membutuhkan resolusi tinggi, waktu
analisis singkat,maksimum sensitivitas, waktu hidup
kolom yang panjang, biaya operasi yang rendah, atau
faktor penting lainnya.
2. Menyamakan kolom yang digunakan untuk analit lain
yang serupa
3. Mendapatkan informasi dari pustaka
12. Mekanisme Kerja di Dalam Kolom
Didalam kolom terjadi pemisahan kompenenkomponen campuran karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap
fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat
interaksinya dengan fasa diam akan keluar
dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solutsolut yang kuat interaksinya dengan fasa
diam akan keluar dari kolom lebih lama
13. Penggunaan Kolom
Banyak
faktor
harus
diperhatikan
di
dalam
menggunakan kolom, agar kolom dapat berfungsi
dengan baik dalam waktu yang relatif panjang. Faktorfaktor yang harus diperhatikan tersebut seperti:
1. Kualitas Pelarut
2. Larutan Pencuci Kolom
3. Pelarut untuk menyimpan kolom
4. Penggunaan pre coloum
Hal-hal lain yang perlu diperhatikan yaitu pengeluaran gas
(‘de-gas’) dengan menarik gelembung udara dari dalam
media dengan menggunakan peralatan pompa vakum.
14. Pelarut untuk menyimpan kolom
Umumnya jenis pelarut yang digunakan untuk
menyimapan kolom harus disesuaikan dengan jenis
kolomnya. Sebagai contoh :
1. Kolom penukar ion disimpan dalam metanol atau air.
Metanol lebih disukai karena dapat mencegah
pertumbuhan bakteri.
2. Kolom fasa terikat tak polar disimpan dalam metanol.
Asetonitril tidak dianjurkan untuk dipakai di sini karena
selain harganya mahal, asetonitril ini dapat terurai
membentuk pengotor pada kolom.
3. Kolom fasa terikat polar disimpan dalam heptana atau
metanol.
4. Kolom silika disimpan dalam heptana.
15. Di dalam penyimpanannya jangan sekali-kali kolom
dibiarkan kering. Pada kolom yang kering dapat terjadi
kekosongan karena paking kolom dapat mengkerut dari
dinding kolom atau karena pengerutan paking kolom itu
sendiri.
17. Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena
diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom
ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm
dan biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran
lebih besar dari ukuran partikel kolom utama.
Pre-colum dilengkapi dengan filter (saringan). Hal
tersebut sangat penting untuk memperoleh hasil
pemisahan yang sempurna serta untuk menghindari
terjadinya penyumbatan (blocking) di dalam kolom
sehingga self life kolom lebih panjang dan melestarikan
kinerjanya..
19. Penutup
1. Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat penting,
sebab pemisahan komponen-komponen sampel akan
terjadi di dalam kolom.
2. Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama
dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan
dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap
performan kromatogram.
25. Mekanisme Kerja di Dalam
Kolom
Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen
campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara
solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang
kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari
kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat
interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom
lebih lama.
Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh
detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
26. Precolumn
ini, yang mempertahankan
senyawa dengan Rf = 0, secara berkala
berubah. Hal ini juga dianjurkan sebelum
analisis, solusi untuk lulus sampel melalui
filter ukuran pori kurang dari 0,5 mikrom.
27. Penggunaan Kolom
Sebelum digunakan sebaiknya kolom dialiri dengan
pelarut pengembang yang kuat (metanol, eter, heksana),
apabila sedang tidak digunakan kolom direndam dalam
pelarut inert yang tidak mudah menguap (metanol,
metanol-air, air suling).
Perlakuan lain pada sampel adalah dengan
menggetarkan sampel pada ‘ultrasonic beam’ agar
terbebas dari gelembung udara. Selanjutnya setelah
melakukan tahap ini, dilakukan pengeluaran gas (‘degas’) dengan menarik gelembung udara dari dalam
media dengan menggunakan peralatan pompa vakum.
Sebelum sampel diinjeksikan ke dalam perangkat
HPLC, terlebih dahulu dilakukan penyaringan dengan
menggunakan ‘filter milipore’.
http://www.catatankimia.com
