Bioanalisis : Uji Sensitivitas Metode Spektrofotometri Visible Berdasarkan Penentuan LLoQ

1. LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM BIOANALISIS
UJI SENSITIVITAS METODE SPEKTROFOTOMETRI CAHAYA TAMPAK UNTUK
PENETAPAN KADAR SULFAMETOKSAZOL DALAM PLASMA MANUSIA
BERDASARKAN PENENTUAN LOWER LIMIT OF QUANTIFICATION
Nama : 1. Ira Kartika (201721)
2. Isabella Romu (201721)
3. Nadia Vidya Savira (2017210151)
4. Nesha Mutiara (2017210155)
Kelas : A
Kelompok : 4
Tanggal Praktek : 07 Januari 2021
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PANCASILA
JAKARTA
2020

2. I. Judul Percobaan
Uji Sensitivitas Metode Spektrofotometri Cahaya Tampak untuk Penetapan Kadar
Sulfametoksazol dalam Plasma Manusia Berdasarkan Penentuan Lower Limit of
Quantification
II. Tujuan
Mahasiswa mampu melakukan uji sensitivitas metode spektrofotometri cahaya tampak untuk
penetapan kadar sulfametoksazol dalam plasma manusia dan mampu menentukan nilai LLoQ
metode.
III. Teori Singkat
Sulfametoksazol adalah antibakteri golongan sulfa yang dapat bereaksi dengan asam nitrit
membentuk garam diazonium. Berdasarkan prinsip Reaksi Koppel, senyawa diazonium
bereaksi dengan ammonium sulfamat dan N-(naftil) etilendiamin menghasilkan senyawa azo
yang berwarna (kromogenik) sehingga dapat dianalisis secara spektrofotometri cahaya
tampak. Derivatisasi sulfametoksazol ini meningkatkan selektifitas metode, mengingat
plasma darah adalah matriks yang kompleks. Cmaks sulfametoksazol dalam plasma manusia
sebesar 25 ug/mL. Dalam rangka studi farmakokinetik sulfametoksazol diperlukan metode
bioanalisis yang valid.
Gambar I.1 Struktur Kimia Sulfametoksazol
Lower limit of quantification (LLoQ) merupakan salah satu parameter analitik yang harus
divalidasi dalam pengembangan metode bioanalisis, karena parameter ini menunjukkan
senstivitas metode bioanalisis. Sensitivitas metode bioanalisis harus mencapai lebih kecil
sama dengan 1/20 dari nilai Cmaks analit dalam matriks biologi. Cara menguji LLoQ metode
dapat dilakukan dengan cara standart addition method atau spike placebo method. Pada
bioanalisis, validasi metode dilakukan secara spike placebo method sesuai dengan standar
US-FDA Bioanalytical Method Validation.

3. IV. Alat dan Bahan
V. Cara Kerja
A. Pembuatan Kurva Baku Sulfametoksazol
1. Buat satu seri larutan sulfametoksazol dalam plasma darah (blank plasma) sebanyak
1 ml dengan kadar 2, 8, 10, 40, 45, dan 60 μg/mL.
2. Tiap kadar diambil 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
3. Tambah 1,5 mL larutan TCA 20% dan sentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit.
4. Ambil 1,0mL supernatan pada tiap konsentrasi lalu dimasukkan ke dalam tabung
reaksi lain.
5. Tambahkan 0,1 mL larutan natrium nitrit 0,1% ke dalam tabung melalui dinding
tabung dan diamkan 3 menit
6. Tambahkan 0,2 mL ammonium sulfamat 0,5% dan diamkan 2 menit.
7. Tambahkan 0,2 mL larutan N-(naftil) etilendiamin 0,1%, diamkan ditempat gelap.
8. Tambahkan aquadest sebanyak 3,5 mL
9. Diamkan larutan selama 20 menit
10. Pindahkan larutan ke dalam kuvet, baca intensitas warna larutan pada panjang
gelombang 536 nm.
11. Buat grafik serapan terhadap kadar, dan tentukan persamaan garis serta akurasi –
presisi pada setiap konsentrasinya.
B. Uji Sensitivitas Metode
1. Buat satu seri larutan sulfametoksazol dalam plasma darah (blank plasma) sebanyak
500 μL dengan kadar 1,5, 2 dan 2,5 μg/mL dalam tabung reaksi.
2. Tambah 1,5 mL larutan TCA 20% dan sentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit.
3. Ambil 1,0mL supernatan pada tiap konsentrasi lalu dimasukkan ke dalam tabung
reaksi lain.
4. Tambahkan 0,1 mL larutan natrium nitrit 0,1% ke dalam tabung melalui dinding

4. tabung dan diamkan 3 menit.
5. Tambahkan 0,2 mL ammonium sulfamat 0,5% dan diamkan 2 menit.
6. Tambahkan 0,2 mL larutan N-(naftil) etilendiamin 0,1%, diamkan ditempat gelap.
7. Tambahkan aquadest sebanyak 3,5 mL
8. Diamkan larutan selama 20 menit
9. Pindahkan larutan ke dalam kuvet, baca intensitas warna dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 536 nm.
10. Lakukan percobaan untuk setiap kadar sebanyak 5 kali.
11. Hitung kandungan sulfametoksazol berdasarkan persamaan kurva baku
12. Hitunglah % Differensiasi dan SBR-nya.
13. Simpulkan sensitivitas metodenya!
14. Tentukan nilai LLoQ metode!
VI. Daftar Pustaka
1. EMEA (European Medicines Agency). 2012. Guideline on Bioanalytical Method
Validation. EMEA/CHMP/EWP/192217/2009.
2. FDA (Food Drug Administration). 2013. Guidance for Industry Bioanalytical Method of
Validation. Diambil dari www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.
3. Susan RM, Corto’n E. Bioanalytical Chemistry. A John Wiley & Sons, Inc. Publication,
2004.