Dokumen ini menjelaskan prosedur isolasi DNA dan PCR mulai dari persiapan alat dan bahan hingga analisis hasil elektroforesis dan sekuensing. Proses tersebut meliputi langkah-langkah spesifik seperti inkubasi, sentrifugasi, pengaturan suhu, dan visualisasi hasil. Tujuannya adalah untuk mengamplifikasi dan mengkonfirmasi urutan basa DNA yang diperoleh dari sampel darah menggunakan metode PCR dan elektroforesis.

1. PERIODE 31 OKTOBER s/d 12 NOVEMBER 2011
OLEH
KURNIA FITRI JAMIL

2. ISOLASI DNA
• Tujuan : Melakukan Isolasi DNA
• Alat dan Bahan :
 Tabung Eppendorf (1,5 ml)
 Sampel (Whatman Paper Blood)
 Saponin 0,5 % + 1 x PBS
 Sentrifus
 Chelex – 100 20 %
 dd H2O

3. ISOLASI DNA (lanjutan)
• Cara Kerja :
1. Siapkan tabung Eppendorf ukuran 1,5 ml dan
raknya.
2. Masukkan sampel (Whatman paper blood)
3. Tambahkan Saponin 0,5 % + 1 X PBS 1 ml
(1000µl)
Kemudian di inkubasi 4 jam atau 24 jam (overnight)

4. ISOLASI DNA (lanjutan)
• Setelah inkubasi
 Sentrifus 10 menit (12.000 rpm)
 Ambil presipitat secara hati-hati
 Tambahkan 1ml=1000µl  di ulang sentrifus
(5 menit) 12.000 rpm
 Ambil presipitat tambahkan 100µl ddH2O + 50µl
20 % Chelex-100
 Boiling 10 menit (Vertex tiap 5 menit)
 Sentrifus (12.000 rpm)
 Ambil supernatan (mengandung DNA)
 Kemudian simpan pada suhu 4ºC atau - 20ºC
 Dilanjutkan ke PCR

5. KEGIATAN ISOLASI DNA
Memotong Whatman
Paper Blood (P falciparum)
dimasukkan ke tabung
Eppendorf

6. ISOLASI DNA (lanjutan)
LEMARI INKUBASI - 20ºC SAPONIN 0,5% 1XPBS
MASUKKAN SAPONIN 0,5%
1XPBS KE SAMPEL MELAKUKAN VORTEX

7. ISOLASI DNA (lanjutan)
BOILING (MEREBUS) CENTRIFUS
HASIL ISOLASI DNA START ALAT PCR

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Tujuan : Untuk mengamplifikasi DNA
• Alat & Bahan :
 Tabung Eppendorf 0,2 ml = 200 µl  Larutan TAE
 Rak tabung, Pipet  MgCl2
 Alat PCR  dNTP
 Alat Elektroforesis + Agarosse 2 %
 Primer (Forward
 Timbangan Agarrosse
dan Reverse)
 Alat Pemanas (Microwave) sesuai dengan
 Sarung Tangan ( anti panas) tujuan (misal: genus
 Ethidium Bromida atau spesies)
 dd H2O
 Tag-Polymerase
 Buffer PCR (Kappa)
 Sampel (Template)

9. PCR (lanjutan)
 Cara Kerja:
1. Siapkan Tabung Eppendorf 200 µl (Biasanya
total volume PCR = 25 µl)
2. Masukkan 18 µl ddH2O
3. Masukkan 2,5 µl (10x buffer PCR)
4. Masukkan MgCl2 0,5 µl
5. Primer (forward) 0,25 µl
6. Primer (reverse) 0,25 µl
7. Masukkan Tag-Polymerase (Kappa) 0,2 µl
8. Template (sampel ) 2,5 µl

10. PCR (lanjutan)
• Siapkan Alat PCR
Pra – PCR r – PLU (± 2 jam 5 menit)
94ºC 55ºC 72ºC
5 menit 30 detik 2 menit
PCR – Running
94ºC 55ºC 72ºC
30 detik 30 detik 1 menit 30 detik
Selama PCR berlangsung peneliti menyiapkan alat
Elektroforesis

11. KEGIATAN PCR
FORMULASI BAHAN UNTUK PCR SAMPEL UNTUK PCR
ATUR WAKTU DAN SUHU ALAT PCR ALAT PCR

12. ELEKTROFORESIS
• Alat & Bahan:
 Siapkan Alat cetakan Agarosse 2 %
 Timbang Agarosse 2 % sebanyak 1 gram
 Masukkan ke dalam tabung Erlenmeyer
 Siapkan gelas ukur dan ukur cairan TAE 50 ml
 Campurkan TAE ke Agarosse 2 %
 Tutup tabung Erlenmeyer dengan plastik dan dilubangi
kecil-kecil (pori-pori)
 Panaskan (dengan Microwave 1 menit)
 Tambahkan E-Bromida 5 µgr/ml (= 5 µl)
 Homogenkan, kemudian di panaskan kembali (Microwave)
10 detik
 Tuangkan Agarosse 2 % ke wadah cetakan yang telah
disiapkan, tunggu mengeras (± 30 menit)

13. KEGIATAN ELEKTROFORESIS
ALAT CETAKAN ALAT TIMBANGAN
AGAROSSE 2% AGAROSSE 2%
MELAKUKAN
ELEKTROFORESIS
WELLING

14. ELEKTROFORESIS (lanjutan)
 Ambil sampel DNA sebanyak 0,8 µl secara hati-hati
dengan menggunakan pipet
 Tanamkan sampel DNA tersebut kedalam sumur
(well) chamber elektroforesis dan Markernya
(diujung)
 Setelah selesai welling, tutup Alat Elektroforesis
 Sambungkan dengan Arus Listrik (± 80 Volt)
selama 1 jam
 Angkat Agarosse dari Alat Elektroforesis
 Visualisasikan hasil tersebut dengan sinar
Ultraviolet (UV)
 Lihat hasil PCR (Pita DNA)/band pada layar
monitor dan di print hasilnya
 Contoh : (Gambar terlampir)

15. KEGIATAN VISUALISASI PCR
HASIL ELEKTROFORESIS VISUALISASI SINAR UV
GBR MONITOR PITA DNA
PRINT GBR PITA DNA

16. HASIL PCR

17. SEKUENSING
• Tujuan : Untuk mengetahui urutan
basa, sehingga dapat mengetahui ada mutasi &
konfirmasi hasil amplifikasi yang telah di kerjakan
(PCR)
• Tahap Sekuensing :
1. Produk PCR
2. Purifikasi
3. Cycle Sequensing
4. Presipitasi

18. PURIFIKASI
 Siapkan Tube mini Columns
 Campurkan sampel DNA dengan Mem – BS
(perbandingan 1 : 1) (misal: sampel DNA = 20 µl
MBS = 20 µl)
 Inkubasi 1 menit
 Sentrifus selama 1 menit (12.000 rpm)

19. PURIFIKASI
 Setelah sentrifus, endapan di luar membran tabung dibuang
 + 700 µl Membran Wash Solution (MWS) dan sentrifus 12.000 rpm
(1 menit)
 Buang sisa zat diluar tabung columns, kmd tambahkan 500 µl
MWS, centrifus 12.000 rpm (1 menit)
 Zat sisa diluar membran tabung columns dibuang
 Ambil supernatan (tanpa MWS) disentrifus lagi 12.000 rpm (1 menit)
 Supernatan diambil  masukkan ke tabung Eppendorf ukuran 1,5 µl
 Tambahkan 30 µl Nuclease free water (NFW)
 Tambahkan 20 µl Nuclease free water (NFW) (Total 50 µl Nuclease
free water (NFW))
Fungsi NFW untuk meloloskan DNA dari membran tabung column ke
tabung Eppendorf

20. PURIFIKASI (lanjutan)
• Inkubasi selama 2 menit
• Sentrifus lagi 12.000 rpm (1 menit)
• Selesai tahap purifikasi
• Endapan di tabung columns dibuang
• 50 µl cairan di tabung Eppendorf diambil
(DNA)
• Selanjutnya ke tahap Cycle Sequencing
(Tetapi harus diukur dulu kadar konsentrasi
dan kemurnian dari sampel DNA tersebut)

21. PURIFIKASI (lanjutan)
 Mengukur kadar konsenterasi dan kemurnian
dengan alat Nandrops.
 Tera dulu dengan 1 µl ddH2O
misalnya : Sampel A (DNA) 50 µl
1 µl sampel hasil konsentrasi = 24,2 ng/µlDNA
(artinya: dalam 1 µl sampel mengandung
konsentrasi = 24,2 ng/µlDNA, 50 µl X 24,2
ng/µl = 1200 ng/ µlDNA)
Sampel A – 260 = 0,782
A – 280 = 0,418

22. PURIFIKASI (lanjutan)
 Kemurnian 260/280 = 1,87
 Panjang gelombang 260
 Panjang gelombang 280
 DNA dinyatakan murni bila = 1,8 – 2

23. DNA Purifikasi “ PROMEGA”
New tube (mini column)
PCR Product : memb.Bind.Solution (1:1)
Incubate 1’ at room temperature (25oC)
12.000 rpm 1’
Discard the solution (put mini column back)
Add 700 µl membrane wash solution
12.000 rpm 1’

24. DNA Purifikasi “ PROMEGA”(lanjutan)
Discard supernatant
Add 500 µl membrane wash solution
12.000 rpm 1’
Discard supernatant, 12.000 rpm 1’
Transfer 1,5 µl tube
30 nuclease free water
So nuclease free water
Incubate 2’ , 12.000 rpm: 1’

25. TAHAP CYCLE SEQUENCING
 Tabung sampel DNA ukuran 0,5 µl (dilabel)
 Formulasinya :
1. Sampel sesuai perhitungan
2. ddH2O sesuai perhitungan
3. Primer 4 piccomol (biasa 1 µl)
4. Bigdye (biasa 6 µl)
Biasanya : total volume = 15 µl
Kemudian ke tahap PCR untuk Cycle Sequencing

26. TAHAP CYCLE SEQUENCING(lanjutan)
Setting Alat PCR (Cycle Sequencing)
Pre – PCR Cycle Sequencing
96ºC 96ºC 50ºC 60ºC 4ºC
3 menit 10 detik 5 detik 4 menit ~
1 X Cycle 25 X Cycle
Ket :
Suhu 96ºC : Denaturasi
Suhu 50ºC : Anealing (penempelan primer)
Suhu 60ºC : Elongation (perpanjangan urutan basa)
Selanjutnya ketahap presipitasi 

27. “Precipitation Method”
Sample
Spindown & move 1,5 µl tube (wrap in alufo)
Add 1,5 µl of 125 mm EDTA
Add 1,5 µl of 3 m Sodium Acetate
Add 37,5 µl of 100 % ETOH (mix by invert 4x)
Incubate in room temperature ± 15’
Spin in refrigerator centrifuge (4 oC : 12.000 rpm; 20’)

28. Precipitation Method (lanjutan)
Aspirate solution
Add 250 µl of 70 % ETOH
Spin in refrigerator centrifuge (4 oC : 12.000 rpm; 20’)
Aspirate solution
Dry it using speed vac ± 15’
Cover the tube with alufo
Store at 4 oC

29. KEGIATAN SEQUENCING
PROSES SAMPLING SAMPEL UTK SEKUENSING
ALAT DAN BAHAN SEKUENSING
ALAT NANODROP

30. HASIL SEQUENCING
KONFIRMASI KE GEN BANK NCBI
DICOCOKKAN APAKAH BENAR YG DIBACA
SESUAI GEN YG DIPERIKSA
URUTAN WARNA:
T : MERAH
C: BIRU
G: HITAM
A: HIJAU
TINGGI RENDAHNYA GELOMBANG TGT
KONSENTRASI SAAT TERBACA OLEH ALAT
SEKUENSING.