great

1. III BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan dari bulan Maret 2006 sampai Maret 2007. Penelitian
bertempat di laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas MIPA,
Institut Pertanian Bogor dan di laboratorium Biokimia Mikroba, Bidang Mikrobiologi,
Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan untuk penelitian yaitu : autoklaf, UV-VIS
spektrofotometer (Shimadzu UV-1700), sentrifusa (Kubota 6500), shaker, laminar
air flow, penangas air, pipet mikro (Gilson), piranti elektroforesis (Mini Protean 3,
Biorad), kolom kromatografi, fraction collector (Biorad model 2110), timbangan
analitik (AND GR-200), pH meter (Schott), pengaduk bermagnet, vorteks, cawan
petri, gelas piala, labu ukur, gelas ukur, tabung reaksi, pipet serologis, dan erlenmeyer.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu : isolat Streptomyces sp SKK1-8 (koleksi
Dr. Ir. Yulin Lestari, Departemen Biologi, FMIPA, IPB), substrat birchwood xilan
(Fluka), sukrosa, ekstrak khamir, agar-agar, DNS, KNa tartrat, NaOH, Na2SO3,
Coomassie brilliant blue G-250, etanol 95%, asam fosfor 85%, aseton, Na2HPO4,
NaH2PO4, asam sitrat, Tris, HCl, Sephadex G-100 (Sigma), DEAE-Sephadex A50
(Sigma), NaCl, sodium dedosil sulfat (SDS), poliakrilamida, bis akrilamida,
N,N,N,N-Tetrametiletilendiamina (TEMED), amonium persulfat, bromophenol blue,
glisin, protein penanda dengan berat molekul rendah, p-nitrofenol dan berbagai
substrat turunannya (p-NP-β-D-xilanopiranosida, p-NP-α-L-arabinofuranosida, p-NP-
α-D-glukopiranosida dan p-NP-α-D-galaktopiranosida, p-NP-asetat) dari Amersham,
dan akuades. Bahan kimia tersebut dari Merck (kecuali yang disebutkan) dan
berkualitas pro analisa.

2. 3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Preparasi Larutan Xilanase
Streptomyces sp. SKK1-8 diremajakan pada cawan petri berisi media agar-
agar xilan (mengandung 1 % ekstrak khamir, 10.3 % sukrosa dan 0.5 % birchwood
xilan), diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari sampai terbentuk spora (sporulasi).
Sebanyak 3 cockborer kultur padat Streptomyces sp SKK1-8 tersebut diinokulasikan
ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair xilan, diinkubasikan pada suhu
kamar selama 10 hari dengan pengocokan (150 rpm). Kultur cair disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Filtrat yang diperoleh
dipisahkan dari endapan dan digunakan sebagai ekstrak kasar xilanase.
3.3.2 Pengujian Aktivitas Xilanase
Aktivitas xilanase diukur dengan mendeteksi gula pereduksi sebagai produk
hidrolisa xilan oleh xilanase menggunakan metode Miller (Miller 1959). Sebanyak
100µl larutan enzim ditambahkan pada campuran 1 ml substrat (0.5% birchwood
xilan dalam 100 mM bufer fosfat pH 6.0) dan 0.9 ml larutan bufer fosfat (100 mM,
pH 6.0), diinkubasikan pada suhu 50 oC selama 30 menit. Reaksi enzimatis diakhiri
dengan penambahan 2 ml reagen DNS (asam dinitrosalisilat) dan dipanaskan dalam
air mendidih selama 15 menit. Campuran reaksi didinginkan dan diukur
absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kontrol
dibuat dengan cara yang sama seperti pengujian aktivitas xilanase akan tetapi larutan
enzim ditambahkan setelah penambahan reagen DNS. Blanko dibuat dengan cara
yang sama akan tetapi larutan enzim diganti dengan 100µl akuades. Xilosa digunakan
sebagai standar untuk penghitungan aktivitas xilanase. Satu unit aktivitas xilanase
dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol
gula xilosa dari substrat birchwood xilan permenit pada kondisi seperti tersebut di
atas (suhu 50 oC, pH 6.0).

3. 3.3.3 Pengendapan Xilanase Menggunakan Amonium Sulfat dan Aseton
Xilanase diendapkan pada suhu dingin (diatas penangas es) dengan cara
menambahkan amonium sulfat yang telah dihaluskan atau aseton dingin sedikit demi
sedikit ke dalam larutan xilanase kasar sambil diaduk perlahan dengan pengaduk
bermagnet sampai mencapai kejenuhan tertentu. Pengadukan dilanjutkan selama 15
menit kemudian larutan disimpan dalam lemari pendingin selama semalam. Endapan
yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi dan dilarutkan dengan 10 mM bufer
fosfat pH 6.0. Penghitungan banyaknya amonium sulfat atau aseton yang
ditambahkan ke dalam larutan enzim diperlihatkan dalam lampiran 4.
Guna memperoleh hasil yang optimal maka pengendapan xilanase
Streptomyces sp. SKK1-8 dilakukan secara bertahap, yaitu dengan 50%-80% aseton.
Mula-mula aseton ditambahkan pada larutan enzim kasar sampai mencapai
konsentrasi 50%, disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm dan endapan yang
merupakan protein pengotor dibuang. Selanjutnya aseton ditambahkan lagi ke dalam
filtrat sampai mencapai konsentrasi 80%, disentrifugasi dan filtratnya dibuang.
Endapan dilarutkan dengan 0.05M bufer fosfat pH 6.0, disentrifugasi untuk
memisahkan protein tidak larut yang merupakan protein terdenaturasi. Filtrat yang
diperoleh dimurnikan lebih lanjut.
3.3.4 Pemisahan Xilanase dengan Polimer Eudragit S100
Preparasi 2% Eudragit S100: 2 gr eudragit S100 ditambah 80 ml akuades,
dinaikkan pHnya dengan penambahan 3 M NaOH sampai mencapai pH 11.
Selanjutnya pH diturunkan dengan penambahan 3 M HCl sampai mencapai pH 7.0
dan volume ditepatkan menjadi 100 ml. Larutan disimpan dalam lemari pendingin
sampai digunakan.
Pemisahan xilanase dengan eudragit S100 dilakukan berdasarkan metode
yang digunakan oleh Breccia et al. (1998) yang dimodifikasi. Sebanyak 40 ml ekstrak
kasar xilanase ditambahkan pada 20 ml 2% eudragit S100, diaduk dengan magnetik
stirer dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Selanjutnya pH diturunkan
dengan penambahan 2 M asam asetat sampai mencapai pH 4.0 dan disentrifugasi

4. pada kecepatan 5 000 g selama 15 menit. Supernatan disimpan (supernatan 1) dan
endapan dicuci dengan 10 mM bufer asetat pH 4.0 dan disentrifugasi. Supernatan
disimpan (supernatan 2), endapan dilarutkan dengan 14 ml 0.1 M bufer fosfat pH 7.5
kemudian ditambahkan NaCl dan Triton X-100 dengan konsentrasi akhir berturut-
turut 1M dan 0.2%. Larutan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit.
Ditambahkan 2 M asam asetat sampai pH mencapai 4.0, didiamkan selama 20 menit
dan disentrifugasi. Supernatan disimpan (supernatan 3) dan endapan dilarutkan dalam
1.5 ml 0.1 M bufer fosfat pH 7.5 (xilanase terikat eudragit S100). Dilakukan
pengujian aktivitas xilanase pada supernatan 1, 2, 3 dan xilanase terikat eudragit S100
(terimobilisasi).
3.3.5 Pemurnian Xilanase
Xilanase dimurnikan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dan
penukar ion. Matrik Sephadex G-100 sebanyak 10 gram dikembangkan dalam 10 mM
bufer fosfat pH 6.0, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 1 jam dan
dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama semalam. Didekantasi untuk
membuang matrik yang tidak mengendap dan ditambahkan 100 ml larutan bufer yang
sama. Matrik dituang ke dalam kolom kromatografi dan diseimbangkan dengan 10
mM bufer fosfat pH 6.0. Selanjutnya dibilas dengan bufer yang sama dengan
kecepatan alir 0.5 ml/menit. Setiap 3 ml eluen ditampung, diukur kadar proteinnya
pada panjang gelombang 280 nm dan diukur aktivitas xilanasenya. Dibuat grafik
Profil elusi dimana sumbu X merupakan nomor fraksi sedangkan sumbu Y
merupakan nilai kadar protein dan nilai aktivitas xilanase. Fraksi yang mengandung
xilanase hasil filtrasi gel digabungkan, dimasukkan ke dalam kantong dialisis
(molecular weight cut off 10 000) dan didialisis dengan 10 mM Tris-HCl pH 8.0
dalam lemari pendingin. Selama dialisis bufer diganti sebanyak 2 kali.
Matrik DEAE-Sephadex A50 sebanyak 7 gram dikembangkan dengan 10 mM
Tris-HCl pH 8.0, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 1 jam dan
disimpan dalam lemari pendingin selama 1 malam. Didekantasi untuk membuang
matrik yang tidak mengendap dan ditambahkan 100 larutan bufer yang sama. Matrik

5. dituang ke dalam kolom kromatografi dan diseimbangkan dengan 10 mM bufer Tris-
HCl pH 8.0. Larutan xilanase hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom yang berisi
matrik DEAE-Sephadex A50. Protein yang tidak terikat matrik dibilas dengan bufer
yang sama, sedangkan protein yang terikat matrik dibilas dengan gradien linier
larutan NaCl (0-0.5 M NaCl dalam bufer yang sama) dan 1 M NaCl. Pembilasan
dilakukan dengan kecepatan alir 0.5 ml/menit, setiap 3 ml eluen ditampung, diukur
kadar protein dan diuji aktivitasnya. Dibuat grafik profil elusi dan dilihat
kemurniannya dengan elektroforesis.
Elektroforesis dilakukan pada piranti elektroforesis vertikal Mini Protean 3
(Bio-Rad) pada kondisi protein terdenaturasi (SDS-PAGE) atau tidak terdenaturasi
(native PAGE). Larutan xilanase dari setiap tahap pemurnian dilarikan pada gel
poliakrilamida (4% akrilamida pada gel penahan dan 10% akrilamida pada gel
pemisah). Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt, 50 mA sampai pewarna
bromofenol biru mencapai sekitar 1 cm dari tepi gel bagian bawah. Hasil
elektroforesis diwarnai dengan pewarna Coomasie Brilliant Blue (CBB) atau pewarna
perak nitrat. Fraksi filtrasi gel dan fraksi kromatografi penukar anion dipekatkan 40
kali sebelum dilakukan elektroforesis.
3.3.6 Penghitungan Berat Molekul Xilanase
Penghitungan berat molekul xilanase dilakukan dengan cara membandingkan
jarak migrasi pita xilanase dengan pita protein penanda yang memiliki berat molekul
rendah (low molecular weight marker). Protein penanda yang digunakan yaitu
monoalbumin (serum babi, 66 kDa), albumin (telur ayam, 45kDa), karbonik
anhidrase (29 kDa) dan α-lactalbumin (14.2 kDa). Persamaan linier protein penanda
diperoleh dengan membuat kurva antara Rf dan log berat molekul protein penanda.
Perkiraan berat molekul xilanase dihitung dari persamaan linier tersebut.
Rf = jarak migrasi pita protein
jarak migrasi bromofenol biru

6. 3.3.7 Pengukuran Kadar Protein
Kadar protein selama pemurnian diukur dengan metode Bradford (Bradford
1976) dan absorbansi pada panjang gelombang 280 nm (untuk pembuatan
kromatogram). Pengukuran protein dengan metode Bradford dilakukan dengan cara
sebagai berikut : sebanyak 0.4 ml larutan enzim ditambah 4 ml reagen Bradford,
dikocok sampai homogen dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 15 menit.
Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
Bovine Serum Albumine (BSA) digunakan sebagai standar untuk menghitung kadar
protein larutan enzim.
3.3.8 Pengaruh pH dan Suhu Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Xilanase
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan
enzim dengan substrat pada suhu 50 oC selama 30 menit pada berbagai kondisi pH
larutan bufer (pH 4.0-9.0 dengan selang 0.5 unit). Gula pereduksi yang terbentuk
diukur dengan metode Miller (1959). Stabilitas enzim terhadap pH diuji dengan
menginkubasikan larutan enzim dalam 10 mM larutan bufer berbagai pH (3.0-9.0
dengan selang 0.5 unit) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, dengan cepat diuji
aktivitas enzim tersisanya pada kondisi optimum reaksi enzim xilanase dengan
konsentrasi larutan bufer sebesar 0.1 M. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan
dalam persentase dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). Bufer yang
digunakan yaitu bufer asetat (pH 4.0-6.0), bufer fosfat (pH 6.0-8.0) dan bufer Tris-
HCl (pH 7.0-9.0).
Pengaruh suhu terhadap aktivitas xilanase diuji dengan cara mereaksikan
larutan enzim dengan substrat selama 30 menit pada berbagai suhu (40-80 oC dengan
selang 5 oC). Aktivitas xilanase dihitung dengan mengukur gula pereduksi yang
terbentuk. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan larutan
enzim pada berbagai suhu (40-80 oC dengan selang 10 oC) selama 1 jam. Setelah
inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan di dalam penangas es.
Selanjutnya aktivitas enzim tersisa diuji pada kondisi standar reaksi enzimatis

7. xilanase. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan
dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan)
3.3.9 Pengaruh Kation Terhadap Aktivitas Xilanase
Pengaruh kation terhadap aktivitas xilanase diuji dengan cara menambahkan
kation (konsentrasi akhir 1 mM) ke dalam campuran substrat-bufer-enzim, dan
diinkubasikan pada kondisi optimal reaksi enzimatis. Penghambatan atau peningkatan
aktivitas xilanase oleh kation dinyatakan dalam persentase aktivitas xilanase
dibandingkan dengan kontrolnya (tanpa penambahan kation logam). Kation
ditambahkan dalam bentuk larutan garam klorida, yaitu KCl, NaCl, BaCl2, CaCl2,
CoCl2, CuCl2, NiCl2, SrCl2, ZnCl2, FeCl3. Selain itu juga diuji pengaruh EDTA
terhadap aktivitas xilanase.
3.3.10 Studi Kinetika Xilanase
Studi kinetika dilakukan dengan membuat grafik Lineweaver-Burk (double
reciprocal) untuk menentukan nilai Km dan Vmax reaksi enzimatis dari xilanase
Streptomyces sp SKK1-8. Persamaan Lineweaver-Burk : 1 = Km 1 + 1
V Vmax [S] Vmax
transformasi linier dari persamaan Michaelis Menten. Grafik double reciprocal
diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v sebagai sumbu Y.
Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan pembentukan produk (xilosa)
persatuan waktu.
Sebanyak 0.2 ml larutan enzim ditambahkan ke dalam campuran 2 ml
substrat birchwood xilan berbagai konsentrasi dan 1.8 ml 50 mM larutan bufer pH
optimum, diinkubasikan selama 40 menit pada suhu optimum reaksi enzimatis. Setiap
5 menit sekali diambil 0.3 ml dan ditambahkan 0.6 ml larutan DNS, dimasukkan ke
dalam penangas air yang mendidih selama 15 menit kemudian didinginkan dalam air.
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm dan kadar gula pereduksi
dihitung dengan persamaan kurva standar xilosa. Dibuat grafik hubungan antara

8. waktu (sumbu X) dan kadar xilosa (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal
dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut.
Selanjutnya dibuat grafik double reciprocal dan didilakukan penentuan nilai Km dan
Vmaxnya.
3.3.11 Hidrolisis Substrat Spesifik
Pengujian hidrolisis substrat spesifik dilakukan dengan cara mereaksikan
larutan enzim dengan berbagai substrat spesifik yang merupakan turunan p-nitrofenol,
yaitu : p-nitrofenol-α-L-arabinosida (substrat untuk α-L-arabinosidase), p-nitrofenol-
β-D-xilanopiranosida (substrat untuk β-D-xilanopiranosidase), p-nitrofenol-β-D-
glukopiranosida (substrat untuk β-D-glukopiranosidase), p-nitrofenol-α-D-
galaktopiranosida (substrat untuk α-D-galaktopiranosidase) dan p-nitrofenol-asetat
(substrat untuk asetil xilan esterase). Sebanyak 100 µl larutan enzim ditambahkan ke
dalam tabung reaksi yang berisi 900 µl substrat spesifik dalam 50 mM bufer pada pH
optimal, kemudian diinkubasi pada suhu optimal selama 30 menit. Reaksi enzimatis
dihentikan dengan penambahan 100 µl Na2CO3 0.4M dan banyaknya p-nitrofenol
yang terbentuk dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 405 nm.
Satu unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk
menghasilkan 1 µmol p-nitrofenol dari substrat spesifik permenit pada kondisi seperti
tersebut di atas.