Teknik Northern Blot digunakan untuk menganalisis ekspresi gen pada tanaman kacang hijau dengan mendeteksi mRNA spesifik gen Cmchi1 dan Cmchi2. Total RNA diekstraksi dari berbagai organ tanaman dan dipisahkan menggunakan elektroforesis agarosa. Probe RNA yang berlabel digunakan untuk mendeteksi mRNA target setelah transfer RNA ke membran dan hibridisasi. Hasil deteksi menunjukkan pola ekspresi gen yang berbeda di antara organ tanaman.

1. NORTHERN BLOTTING

2. NORTHERN BLOTTING
 Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama
kali pada tahun 1977
 secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot
 Yang membedakan adalah sampel yang
digunakan, yaitu RNA.
 Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi
(transkripsi) suatu mRNA (gen) pada organ atau
jaringan tertentu, seperti daun, bunga, biji, batang,
dan lain sebagainya.

3. DEFINISI DAN PRINSIP
Northern Blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan
informasi mengenai identitas, ukuran dan kelimpahan
RNA.
Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan
ukuran dan
terdeteksi pada membran menggunakan probe
hibridisasi dengan urutan basa komplementer
untuk semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target

4. TAHAPAN NORTHERN BLOTTING

5. TAHAPAN UMUM NORTHERN BLOT
 isolasi RNA (total atau poli (A) RNA)
 Generasi Probe
 Denaturasi dan elektroforesis gel agarosa
 Transfer ke support solid dan imobilisasi
 Prehybridization dan hibridisasi dengan probe
 Pencucian
 Deteksi
 Pengupasan dan reprobing (opsional)

6. ISOLASI RNA
Dapat dilakukan dengan cara:
 Lisis membran Seluler
 Penghambatan aktivitas ribonuklease
 Deproteinasi
 Recovery intact RNA

7. ISOLASI POLI (A)
 dalam beberapa kasus, langkah terpisah untuk
isolasi mRNA dari RNA total dapat dimasukkan
dengan poly (A) selection, hal ini meningkatkan
sensitivitas.
 Isolasi mRNA dari total RNA menggunakan poli-A
prosedur seleksi +, yang melibatkan kolom oligo-T,
atau beads primed oligo-T, untuk mengikat ekor
poli-A + mRNA.
 RNA diekstraksi spesies, apakah RNA total atau
poli-A + yang dipilih, kemudian dipisahkan
berdasarkan ukuran molekul dengan elektroforesis
agarosa-gel

8. GENERASI PROBE
 Dapat menggunakan radioaktif atau nonisotopically
label, RNA, DNA atau probe oligodeoxynucleotide.
 RNA Probe dapat diproduksi secara in vitro melalui
reaksi transkripsi menggunakan Ambion yang
MAXIscript Kit.
 Nukleotida berlabel isotop atau nonisotopic dapat
dimasukkan langsung selama sintesis dengan kit
ini, atau RNA dapat disintesis unlabeled dan
kemudian ditambah Psoralen-Biotin untuk
menghasilkan probe terbiotinilasi untuk
hybridizations blot.

9. DENATURASI DENGAN ELEKTROFORESIS
AGAROS
 Formaldehida biasa digunakan secara tradisional
sebagai denaturan, meskipun sistem glyoxal
memiliki beberapa keunggulan dibandingkan
formaldehida.

10. TRANSFER KE SUPPORT SOLID DAN
IMOBILISASI
 RNA ditransfer ke membran nilon bermuatan positif dan
kemudian bergerak selama hibridisasi berikutnya.
 Metode berteknologi rendah terbaik untuk transfer agarosa
adalah dengan elusi, pasif sedikit basa, ke bawah.
 Prosedur ini, dibandingkan dengan mentransfer ke atas, jauh
lebih cepat dan karena itu menghasilkan band-band lebih
ketat dan sinyal yang lebih. Atau, cara transfer yang tersedia
secara komersial aktif (electroblotter, semidry electroblotter,
vakum tinta, tinta tekanan, dll) dapat digunakan.
 Setelah RNA ditransfer, membran harus segera disiapkan
untuk Crosslink RNA. Hal ini dapat dilakukan oleh sinar
ultraviolet (metode yang disukai) atau dengan dipanggang.

11. PREHYBRIDISASI DAN HIBRIDISASI DENGAN
PROBE
 Prehybridisasi atau memblokir, diperlukan sebelum
menyelidiki hibridisasi untuk mencegah probe dari
lapisan membran. Blocking yang baik diperlukan
untuk meminimalkan masalah back ground.

12. HIBRIDISASI PROBES
 Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini
melengkapi semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target.
 Secara umum, ukuran minimum untuk probe untuk
memastikan spesifisitas adalah sekitar dua puluh lima basa,
memberikan bahwa ada kecocokan lengkap antara urutan
probe dan urutan dari mRNA target,
 Ada dua bentuk utama probe hibridisasi, pendekatan
tradisional yang menggunakan DNA komplementer (cDNA).
Atau, anti-sense oligonukleotida (umumnya
30-40 basa) dapat dirancang dari data urutan dan disintesis.
 Oligonukleotida, seperti cDNA, adalah molekul DNA yang
tetapi 'riboprobes' basa RNA nya dapat digunakan.
 Riboprobes dapat meningkatkan sensitivitas dibandingkan
dengan probe DNA, tetapi mereka kurang stabil dalam arti
menjadi subyek dengan kerusakan oleh RNases.

13. PENCUCIAN
 Setelah hibridisasi, unhibridisasi probe dihilangkan
dengan mencuci dengan buffer. Mencuci strigensi
rendah (misalnya, dengan 2X SSC atau SSPE)
menghilangkan larutan hibridisasi dan probe
unhibridisasi.
 Mencuci strigenci tinggi (misalnya, dengan 0.1X
SSC atau SSPE) menghilangkan sebagian molekul
hibridisasi.

14. DETEKSI
 Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot
dapat dibungkus dalam bungkus plastik agar tidak
kering dan kemudian segera menggunakan film
untuk autoradiografi.
 Jika menggunakan probe nonisotopic, blot harus
diperlakukan dengan reagen deteksi nonisotopic
sebelum terkena film.

15. DETEKSI
 Deteksi dicapai baik dengan radioaktivitas atau
dengan non-radioaktif.
 Dengan radioaktivitas, probe ditandai dengan 32P
(atau 33P).
 Dengan non-radioaktiv, deteksi dilakukan dengan
pewarnaan. Salah satunya dengan teknik
chemiluminescence, deteksi juga mungkin
didasarkan pada fluoresensi, tapi ini memerlukan
substansial investasi dalam instrumentasi khusus.

16. TAHAPAN NORTHERN BLOT DALAM JURNAL

17. Biji tanaman yang sedang imbibisi atau akaar,
batang, daun, atau bunga dari tanaman yang
sudah matang
Isolat Total RNA
Poly (A+)RNA
Menggunakan metode phenol-SDS
Elektroforesis
Probing generate
Fragmen RNA
Hasil blotting
Transfer RNA dari gel ke membran
Hibridisasi
deteksi
Seleksi mRNA

18. PROBING
 untuk RNA probe synthesis, 598 bp fragment dari
Cmchi1 cDNA yang sudah diamplifujasi dengan primer
48EM dan 48RV.
 527 bp fragment telah diamplifiksi dari Cmchi2 cDNA
dengan primer 24DM and 24RV.
 T7 promoter diligasi ke setiap fragmen dari kedua
fragmen tadi (Lign’s Kit, Ambion), dengan template
untuk amplifikasi PCR menggunakan T7 adapter primer
1 (Lign’s Kit, Ambion) and a gen-specific primer (48EM
from Cmchi1 and 24DM from Cmchi2).
 DIG-labelled RNA probe disintes menggunakan produk
PCR yang tadi sebagai template (DIG RNA Labeling Kit,
Roche Molecular Biochemicals).

19. PEMISAHAN DAN TRANSFER
 Poly(A+) RNA (1.75–5 ìg) dipisahkan dengan elektroforesi gel
dalam1% agarose gel yang mengandung 1× denaturing gel
buffer (ada dalam Northern MaxKit, Ambion) selama 2 jam
dengan 70 V.
 RNA ditransfer dan di cross-linked ke membran positif (Hybond-
N+, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey,
USA)
 membran RNA-blotted di prehybridiz dengan 10 ml buffer
komersial hybridisasi(Ultrahyb, Ambion) selama1 jam dan
dihibridisasi dengan probe DIG-labelled RNA (0.1 nM)
semalaman dengan suhu 68°C.
 Membran dicuci di suhu 25°C sebanyak 2 kali pada stringensi
rendah untuk 5 min dan dua kali di suhu 68°C pada stringensi
tinggi untuk 20 min (NorthernMax kit, Ambion).
 Sinyal hybridisasi didetesi menggunakan chemiluminescence
 Setelah deteksi, membran yang sama dikupas
dan reprobed dengan
DIG-label antisense-aktin 7 dari Arabidopsis thaliana probe.

20. HASIL NORTHERN

24. TERIMA KASIH