Bioinformatika.pptx

1. Analisis Ekspresi
Gen secara
Bioinformatika
Anggota Kelompok :
1.
2.
3.
4. Shoffia Medina Al-Haq (1308619044)

2. Quantitative PCR
Alat dan bahan yang diperlukan :
• Materi genetik
• Primer
• dNTP
• Buffer reaksi
• DNA Polimerase termostabil
• Fluorokrom
• Kamera pendeteksi floresen
• Quantitative PCR (qPCR) merupakan metode pilihan untuk menganalisis
ekspresi gen dari sejumlah gen moderat di mana saja dari sejumlah kecil
hingga ribuan sampel.
• qPCR merupakan standar emas untuk mengukur ekspresi gen karena
sensitivitas tinggi, ketahanan, reproduktifitas yang baik, rentang kuantifikasi
dinamis yang luas, dan keterjangkauan.
Siklus PCR :
• Denaturasi pada suhu 95°C
• Annealing pada suhu 50-60°C
• Elongasi pada suhu 68-72°C

3. Metode Deteksi
Pewarna Fluoresen Non Spesifik
Contohnya seperti SYBR Green yang
mengikat lekukan kecil DNA dan membentuk
floresensi yang berbanding dengan jumlah salinan
DNA yang terbentuk.
Memerlukan analisis kurva leleh untuk
mendeteksi masalah pengikatan non-spesifik
pewarna ke DNA karena suhu leleh dapat
dipengaruhi oleh ukuran amplikon, jumlah basa
GC, dan struktur sekunder dan tersiernya.
Analisis kurva leleh dilakukan dengan
membentuk gradien dari 50-95°C pada akhir PCR.
Teknik qPCR memungkinkan kuantifikasi bahan awal (DNA, cDNA, atau
RNA) dengan menggunakan fluorophore. Fluoresensi yang terbentuk
diukur setiap siklus dan berbanding dengan jumlah produk PCR.
Probe Spesifik
Spesifik karena reaksi
floresen hanya terjadi ketika probe
berhibridisasi dengan daerah
komplementer.
Contoh Probe :
• TaqMan
• Molecular Beacon
• FRET probe
• Scorpion probe
• MGB probe

4. Karakteristik
Quantitative PCR
Kelebihan
• Kecepatan
• Kesederhanaan
• Kenyamanan
• Sensitivitas
• Spesifisitas
• Kekuatan hasil
• Performa tinggi
• Familiaritas
• Harga

5. Kuantifikasi
Kuantifikasi Absolut
Untuk melakukan kuantifikasi
mutlak perlu diketahui jumlah salinan
gen target dalam sampel standar.
Umumnya sampel standar ini adalah
DNA plasmid atau cDNA yang
konsentrasinya diukur dengan
spektrofotometer.
Dalam assay, pengenceran
serial sampel standar di mana gen
target akan diamplifikasi harus disiapkan
karena akan merefleksikan jumlah
salinan sampel melalui proses
interpolasi Ct.
Kuantifikasi Relatif
Umumnya menggunakan
metode 2-ΔΔCT yang mengasumsikan
bahwa konten DNA menjadi dua kali
lipat setiap siklus dan gen referensinya
terekspresi konstan antara semua
sampel.
Gen referensi merupakan gen
konstitutif yang digunakan sebagai
kontrol endogen untuk mengoreksi
variabilitas intra dan inter-assay.

6. Seleksi Gen Referensi
Gen Referensi yang baik
merupakan salah satu metode
pengkoreksi yang paling simpel
dan efektif :
• Masalah dalam proses ekstraksi,
pemurnian, atau penyimpanan RNA
• Performa buruk dari transkripsi balik ke
sintesis cDNA
• Kesalahan dalam pemipetan atau
pemindahan material
• inhibitor polimerase
• Primer yang dirancang dengan buruk
• Analisis statistik yang tidak tepat
Proses normalisasi gen
referensi melalui berbagai protokol dan
metodologi dilakukan untuk menghindari
desain eksperimen qPCR yang salah
dan sulit untuk direproduksi hasilnya.
• Gen konstitutif yang menjadi gen
referensi harus menunjukkan
variabilitas yang kecil antar jaringan,
sel, kondisi fisiologis atau perlakuan.
• Gen dengan ekspresi terlalu tinggi
(Ct>30) atau dengan ekspresi rendah
(Ct<15) tidak direkomendasikan
untuk dipakai sebagai gen referensi
• Direkomendasikan memakai dua gen
referensi dengan fungsi dan regulasi
yang berbeda untuk meminimalisir
kemungkinan bias.

7. RNA Sequencing (RNAseq)
Maxam dan Gilbert mengembangkan teknologi
pengurutan DNA berdasarkan modifikasi kimia DNA
dan subsequent cleavage pada basa tertentu
Automatic sequencer pertama yang menggunakan
metode Sanger
Revolusi besar terjadi di bidang DNA sequencing
saat pertama sequencing kinerja tinggi muncul di
pasar
1970-an
2005
1987
Holley membuat complete sequencing pertama dari
sebuah gen
1964
Sequencer memungkinkan untuk menyelesaikan
proyek genom manusia
2001

8. RNA Sequencing (RNAseq)
- Transkriptom adalah himpunan asam ribonukleat dalam sel,
termasuk messenger ribonucleic acid (mRNA), transfer
ribonucleic acid (tRNA), ribosomal ribonucleic acid (rRNA),
small
- nuclear ribonucleic acid (snRNA), noncoding ribonucleic acids
(ncRNA).
- RNA ini diekspresikan secara berbeda menurut jaringan,
kondisi fisiologis atau stage of development
- Interpretasi kompleksitas transkriptom sangat penting
bertujuan untuk memahami elemen fungsional genom
- RNA sequencing adalah teknik di mana fragmen diurutkan dari
25–400 pasangan basa digunakan tergantung pada
teknologinya
1. Transcriptome and RNA sequencing

9. RNA Sequencing (RNAseq)
Desain studi transkriptome mengikuti langkah-langkah berikut
1. Pemilihan jaringan yang diinginkan di mana RNA akan dibuat
dipelajari.
2. Building the cDNAlibraries
3. Menggunakan sistem pengurutan yang masif.
4. Analisis data menggunakan alat bioinformatika. Jutaan hort readings
diperoleh, yang dipetakan ke genom atau transkriptom. Bacaan harus
disejajarkan untuk meringkas semua data. Lalu, data dinormalisasi dan
uji statistik diterapkan untuk mempelajari ekspresi gen diferensial,
menghasilkan sebuah klasifikasi gen dengan tingkat ekspresinya, p-
values, dan fold change.
2. RNAseq Methodology

10. RNA Sequencing (RNAseq)
Teknologi RNAseq menghadirkan beberapa keunggulan dibandingkan yang
lain metodologi yang bertujuan untuk mempelajari ekspresi gen:
• Resolusi basis: juga dapat mendeteksi perubahan dalam satu nucleo tide
(SNP) dalam transkrip, mikrosatelit, isoform, dan varian alelik.
• Jangkauan Dinamis Lebar: tidak ada batas atas untuk kuantifikasi dan
berkorelasi dengan jumlah urutan yang diperoleh, akibatnya memiliki
rentang level ekspresi dinamis yang luas, diperkirakan empat sampai lima
kali lipat. Jadi, itu bisa menganalisis gen yang diekspresikan pada tingkat
yang sangat rendah atau sangat tinggi yang tidak terdeteksi oleh yang lain
teknik. Sinyal latar belakang yang rendah membantu meningkatkan
rentang dinamis.
• Pembacaan Singkat: pembacaan dari 30 bp untuk memungkinkan
informasi yang akurat tentang cara menghubungkan dua ekson.
3. Advantage and limitations of RNAseq

11. RNA Sequencing (RNAseq)
• Tinggi akurat: telah ditunjukkan oleh studi validasi dengan PCR kuantitatif.
• Reproduktifitas tingkat tinggi
• Sampel RNA rendah: karena tidak ada langkah kloning.
• Tidak diperlukan genom referensi : pembacaan dapat dilakukan tanpa
genom referensi dan transkriptom dirakit secara de novo. Ini merupakan
keuntungan bagi spesies yang genom belum diurutkan
3. Advantage and limitations of RNAseq