Genetic engineering

1. REKAYASA GENETIKA
IRFAN SULIANSYAH

2. AGENDA
PRESENTATION
TITLE
2
PLASMID
ISOLASI PLASMID
PREPARASI SEL KOMPETEN
LIGASI
TRANSFORMASI

3. P L A S M I D

11. ISOLASI PLASMID

12. ISOLASI DNA PLASMID
PRESENTATION
TITLE
1 2
4 tahapan kerja untuk isolasi plasmid dari bakteri :
1. Kultivasi sel dan pemanenan sel bakteri
2. Lisis sel
3. Pemurnian DNA plasmid
4. Pemekatan DNA plasmid

13. PEMISAHAN DNA PLASMID DAN DNA KROMOSOM
DAPAT DILAKUKAN BERDASARKAN
PRESENTATION
TITLE
1 3
• Ukuran
• Konformasi
Pemisahan berdasarkan ukuran
* Ukuran terbesar plasmid hanyalah 8% dibanding
ukuran kromosom E.coli
* Cara pemisahan :
a) lisis sel menggunakan campuran EDTA+lizosim
dalam larutan sukrosa, diinduksi Triton-X
b) Sentrifugasi, DNA plasmid dalam supernatan,
sedangkan DNA kromosom dalam debris sel
Kelemahan :
• Sebagian kecil fragmen DNA kromosom akan
terlarut dalam supernatant
• Plasmid yang berukuran besar akan terendapkan
bersama debris sel.

14. PEMISAHAN DNA PLASMID DAN DNA KROMOSOM
DAPAT DILAKUKAN BERDASARKAN
PRESENTATION
TITLE
1 4
• Ukuran
• Konformasi
• Pemisahan berdasarkan konformasi
• Plasmid dalam sel berada dalam konformasi
supercoiled (disebut juga ccc = DNA covalently
closed circular), sedangkan DNA kromosom
berbentuk linier

15. PREPARASI SEL
KOMPETEN

16. COMPETENT CELLS
• In molecular biology, we say a cell is competent when it has the ability to take
up foreign DNA. Therefore, there are two types of competent cells: 1)
chemically competent and 2) electrochemically competent
(electrocompetent).
• Chemically competent cells: are cells that are exposed to elements like
calcium chloride (CaCl2) or magnesium chloride (MgCl2) followed by
temperature changes from cold (0°C), heat (42°C) and cold again (0°C). This
exposure and shock leads to the formation of pores on the cell membrane,
allowing cells to take up foreign DNA.
1 6
PRESENTATION
TITLE

17. 1 7
PRESENTATION
TITLE

18. COMPETENT CELLS
1 8
PRESENTATION
TITLE
Natural ability of a cell (either bacterium/yeast or mammalian cell) to take up cell free DNA present in
extracellular environment is low and only 1% cells are capable to take DNA. Hence, a number of
(chemical/physical) treatments make the bacteria competent to take DNA through transformation

19. COMPETENT CELLS
• Sel kompeten dibuat dalam kondisi dingin 4oC, sehingga terjadi kejutan suhu pada
sel kompeten ketika ditempatkan pada suhu 42oC. Sel kompeten dibuat dengan cara
merendam sel dalam larutan garam klorida dalam kondisi dingin, seperti CaCl2,
MnCl2, dan MgCl2, untuk meningkatkan permeabilitas membran sel sehingga
plasmid dapat masuk ke dalam sel
• Larutan garam ini dapat mengikat DNA dan komponen lipopolisakarida dari dinding
sel bakteri yang bermuatan negatif, sehinga DNA terikat dengan dinding sel bakteri.
Selain itu, larutan lain yang dapat digunakan untuk pembuatan sel kompeten adalah
polietilene glikol
1 9
PRESENTATION
TITLE

20. COMPETENT CELLS
2 0
PRESENTATION
TITLE
Electrochemically competent cells: are cells that are exposed to an electric pulse and form
pores in their membranes facilitating the DNA intake.

21. L I G A S I

22. DESKRIPSI DNA LIGASE
Enzim yang dibutuhkan untuk memperbaiki, replikasi, dan rekombinasi
DNA
Digunakan untuk mengkatalisis formasi ikatan fosfodiester pada
ikatan tunggal yang berasal dari pecahan ikatan ganda
Memiliki sekuens asam amino, ukuran molekul dan sifat yang berbeda-
beda tiap jenisnya.
Ada 2 jenis DNA ligase berdasarkan spesifisitas kofaktornya, DNA ligase
yang membutuhkan NAD+ dan DNA ligase yang membutuhkan ATP

23. KEBUTUHAN PROSES LIGASI
Apa yang dibutuhkan untuk proses ligasi?
1. Dua atau lebih fragmen DNA yang memiliki ujung blunt ataupun
ujung ‘sticky’
2. Larutan buffer yang mengandung ATP. Larutan buffer biasa
disiapkan pada konsentrasi tertentu hingga konsentrasi ATP
mencapai 0,25 sampai 1 mM.
3. DNA ligase T4. Reaksi pemasukkan fragment ke dalam plasmid
(subkloning) akan membutuhkan sekitar 0,01(untuk ujung ‘sticky’)
hingga 1 unit (ujung ‘blunt’) ligase.

24. MEKANISME DNA
LIGASE
Mekanisme secara umum:
1. Aktivasi ligase dengan membentuk sebuah
protein kovalen (AMP intermediet)
2. Bagian AMP ditransfer dari ligase ke grup fosfat
ujung 5’ pada pecahan untai tunggal
3. DNA ligase mengkatalisis proses ligasi tersebut
dengan menghilangkan AMP bebas

25. TRANSFORMASI

26. TRANSFORMASI PLASMID KE
SEL INANG
2 6
PRESENTATION
TITLE
• Transformasi merupakan salah satu kemampuan bakteri untuk mengambil DNA asing ke dalam sel. Kemampuan
ini dimanfaatkan oleh peneliti untuk memperbanyak suatu gen. Gen yang telah diinsersikan ke dalam plasmid
dimasukkan ke dalam bakteri dengan metode transformasi (Brown, 2010).
• Transformasi yang terjadi pada DNA rekombinan dalam plasmid ini tidak terjadi secara alami, melainkan harus
diinduksi oleh zat-zat tertentu.
• Sel bakteri yang telah mengalami suatu perlakuan fisik sehingga dapat memperoleh kemampuan untuk
mengambil DNA asing adalah sel kompeten (Brown, 2010).
• Selain itu, sel kompeten ini juga dapat mengambil DNA plasmid sirkuler. Sel biasa hanya dapat melakukan
transformasi DNA linier (Sword, 2003).

27. TRANSFORMASI PLASMID KE
SEL INANG
2 7
PRESENTATION
TITLE
• Transformasi dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu heatshock atau kejutan panas, elektroporasi
(Casali dan Preston, 2003), dan coldshock atau kejutan dingin (Ng, 2009).
• Metode kejutan panas merupakan metode transformasi yang paling mudah dilakukan dibandingkan
metode lainnya. Metode ini menggunakan prinsip kejutan suhu, yaitu 42oC, selama 90 detik (Hanahan
dkk., 1983) atau 120 detik sehingga dinding sel bakteri terbuka dan plasmid dapat masuk dalam sel
(Sambrook dan Russel, 2001).
• Sel kompeten yang diberikan kejutan panas 42oC tetap hidup karena mengekspresikan protein kejutan
panas, yaitu heat-shock proteins (HSPs).
• Protein ini akan diekspresikan oleh sel apabila sel dalam kondisi stress suhu (Arsene dkk., 2000).

28. 2 8
PRESENTATION
TITLE

29. TRANSFORMASI DNA
Ekspresi materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel.
Diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982,
berdasarkan penelitian bahwa suatu bakteri dapat
melepaskan fragmen DNA‐nya ke dalam suatu medium yang
kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri yang lain dalam
kultur tersebut.
Bakteri diubah menjadi kompeten (istilah untuk bakteri yang siap
bertransformasi), misalnya dengan mendinginkannya pada larutan
yang mengandung kation divalen seperti Ca2+ untuk membuat dinding
sel menjadi permeable dan dapat dilalui oleh DNA plasmid.

30. PROSES TRANSFORMASI
Molekul DNA rantai ganda berikatan pada reseptor yang terdapat
dipermukaan sel. Perikatan ini bersifat reversible.
Pengambilan DNA donor yang bersifatirreversible. Pada saat ini DNA
donor menjadi resisten terhadap enzim DNAase di dalammedium.
Konversi molekul DNA donor yang berupa rantaiganda menjadi molekul
rantai tunggal melalui degradasi nukleotida terhadap salah satu rantai.
Integrasi (insersi kovalen) seluruh atau sebagian unting tunggal DNA
donor tersebut kedalam kromosom resipien.
Segregasi danekspresi fenotipik gen donor yang telah terintegrasi

31. TEKNIK HEAT-SHOCK

32. TRANSFORMASI PLASMID KE
SEL INANG
3 2
PRESENTATION
TITLE
Transformasi kejutan panas (Sumber : Brown, 2010) Keterangan : Bakteri normal diberi perlakuan
CaCl2 akan menjadi sel kompeten. Ketika diberi kejutan panas, plasmid yang menempel pada
dinding sel bakteri akan masuk ke dalam sel

33. THANK YOU