Dokumen tersebut membahas tentang pengembangan penelitian terkini dalam bidang mikrobiologi molekuler. Terdapat beberapa poin utama yaitu: (1) isolasi DNA dari sampel daun menggunakan metode CTAB, (2) amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR dengan penanda molekuler matK, rbcL, dan trnL-F, (3) sekuensing DNA, dan (4) analisis data.

1. MIKROBIOLOGI
MELOKULER
KELOMPOK 6:
1. Alicia Margaretha (4001416032)
2. Yulianis (4001416034)
3. M. Amirul Mu’min (4001416037)
4. Selly Nihayatun Sa’adah (4001416055)
5. Fitriyani Mutiara Candra (4001416066)
01
02

2. • Mikrobiologi molekuler: pengkajian mengenai kehidupan mikroba pada
skala molekul.
• Kehidupan skala molekul meliputi hubungan antara struktur dan fungsi
molekul-molekul hayati serta kontribusi hubungan tersebut terhadap pel
aksanaan dan pengendalian berbagai proses biokimia.
• Untuk memahami struktur dan perkembangan suatu mikroba atau tujua
n lain dapat dilakukan dengan mengisolasi, karakterisasi dan analisis m
olekul-molekul dalam sel mikroba seperti DNA, RNA, maupun plasmid.
• Teknik replikasi DNA: PCR (polymerase chain reaction) atau metode pe
rbanyakan DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
Ruang Lingkup Mikrobiologi Molekuler

3. Konsep Dasar Teknik Isolasi RNA/DNA/PLASMID
1. Prinsip dan metode isolasi DNA plasmid
• Isolasi DNA plasmid adalah proses memisahkan DNA plasmid dari sel ba
kteri atau yeast.
• Manfaat isolasi plasmid pada umumnya digunakan sebagai vektor dalam
berbagai teknik rekayasa genetika seperti kloning gen atau transformasi.
• Plasmid memiliki beberapa karakteristik sehingga dapat digunakan seba
gai vektor, di antaranya memiliki ukuran yang relatif kecil.

4. • Dalam proses isolasi DNA plasmid bakteri maupun yeast, terdapat dua met
ode yang umum digunakan dalam isolasi DNA plasmid, yaitu metode boiling
dan metode alkaline lysis.
• Secara umum, prinsip isolasi DNA plasmid pada kedua metode tersebut ad
alah sama, yaitu pelisisan sel, ekstraksi DNA plasmid, serta presipitasi dan
purifikasi DNA plasmid.

5. METODE BOILLING
• Menggunakan prinsip bahwa suhu tinggi setelah proses pelisisan s
el akan mendenaturasi protein dan DNA, namun tidak dapat memis
ahkan kedua untai DNA pada struktur dobel heliks sirkular plasmid.
• Teknik isolasi plasmid tersebut disebabkan DNA sirkular plasmid m
emiliki topologi dua untai polinukleotida sirkular yang saling berkait
an.
• Pada saat suhu diturunkan, plasmid akan mengalami renaturasi, se
dangkan DNA kromosomal yang menjadi linear setelah proses pelis
isan sel dan tetap terikat pada membran sel tidak dapat mengalami
renaturasi akan mengendap dan terpisahkan dari DNA plasmid set
elah disentrifugasi.

6. METODE ALKALINE LISIS
• Pada metode ini, kondisi alkali yang disebabkan perlakuan dengan
campuran SDS dan NaOH menyebabkan DNA kromosomal dan pla
smid mengalami denaturasi setelah sel mengalami lisis.
• Penambahan natrium astetat setelah perlakuan alkali dapat menetra
lkan pH dan menyebabkan DNA mengalami renaturasi.
• Pada kondisi tersebut, DNA plasmid dapat mengalami renaturasi de
ngan segera, namun DNA kromosomal membentuk agregat yang di
akibatkan adanya asosiasi interstrand dan menyebabkan DNA krom
osomal terendapkan bersama komponen protein setelah disentrifug
asi.

7. TAHAPAN ISOLASI PLASMID
• Pelisisan Sel
• Ekstraksi DNA Plasmid
• Presipitasi dan Purifikasi DNA

8. 2. Prinsip, metode dan teknik isolasi DNA
1. Tahapan lisis
– Proses perusakan atau penghancuran membran dan dindi
ng sel.
2. Tahapan ekstraksi
– Seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediam
ine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi
enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisol
asi.
3. Tahapan pemisahan DNA
– Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekat
kan melalui presipitasi (pemisahan). Pada umumnya digu
nakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi.

9. 3. Isolasi RNA
• Isolasi RNA messenger (mRNA) adalah salah satu tekni
k dasar biologi molekular yang digunakan untuk menget
ahui ekspresi suatu gen baik pada hewan maupun tumb
uhan.
• RNA messenger adalah hasil transkripsi DNA dengan tuj
uan untuk ditranslasi menjadi protein.

10. Ilustrasi proses isolasi DNA:

11. • Pengukuran konsentrasi RNA yang telah dii
solasi menggunakan spektrofotometri pada
panjanggelombang λ260.
• Kemudian dilakukan sintesis copy DNA (cD
NA) menggunakan Reverse Trancriptase P
CR (RT-PCR).
• Penambahan enzim Reverse Trancriptas
e bertujuan agar RNA yang telah diisolasi d
apat digandakan dalam bentuk cDNA.
• Proses PCR ini tidak jauh berbeda dengan
PCR pada umumnya, yaitu meliputi denatur
ation, annealing, dan elongation.

12. Teknik PCR
• Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase
adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) sec
ara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro.
• Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakn
i:
(1) DNA cetakan,
(2) oligonukleotida primer,
(3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP,
dGTP, dTTP, dan
(4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sint
esis rantai DNA.

13. PROSES PCR
1. Denaturasi
– Pada tahap denaturasi, suatu fragmen DNA (duoble strand) dipanaskan pada s
uhu 95 0C selama 1-2 menit sehingga akan terpisah menjadi rantai tunggal (si
ngle strand).
2. Penempelan (annealing),
– Penempelan (annealing) dilakukan pada suhu 55 0C selama 1-2 menit, yakni o
ligonukleotida primer menempel pada DNA cetakan yang komplementer denga
n sekuen primer.
3. Amplifikasi.
– Setelah dilakukan penempelan, suhu dinaikkan menjadi 72 0C selama 1,5 men
it. Pada suhu ini, enzim DNA polimerase akan melakukan poses polimerasi, ya
kni rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA ce
takan. Proses ini disebut amplifikasi (diperkuat/disalin beberapa kali).

14. Ilustrasi Proses PCR:

15. Manfaat Penerapan PCR:
 Deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV
 Diagnosa kelainan genetik sebelum kelairan
 Peramalan hemophilia
 Isolasi DNA dari miselium jamur dan spora
 Pengujian kualitas air minum
 Analisis filogenetik dalam taksonomi
 Identifikasi polimorfisme DNA
 Identifikasi jenis kelamin
 Skrining pustaka gen λgt11
 Penentuan urutan nukleotida
 Pemetaan genom manusia

16. SEKUENSING, ALIGNMENT, DAN BLAST
 Sekuensing adalah teknik untuk menentukan urutan
basa nukleotida dari urutan suatu DNA seperti adenin,
timin, guanosin, dan sitosin.
 Manfaat dalam sequencing DNA menurut Tautz et al.,
(2003) antara lain:
 Bidang forensik
 Bidang kesehatan
 Bidang pertanian
 Bidang taksonomi

17.  Sequences DNA merupakan awal untuk hipotesis dari
hubungan filogenetik, khususnya pada tingkat spesies.
 Skala besar perbandingan antara berbagai bagian
pohon phylogenetik akan menjelaskan perbedaan
tingkat dan modus evolusi molekuler, pola spesies
diversifikasi, variasi karakter ekologi, dan akan
menghasilkan pemahaman yang lebih dalam tentang
keanekaragaman hayati.

18.  Alignment adalah pensejajaran atau penjejeran
sekuens DNA, RNA, atau protein berdasarkan
homologi sekuens tersebut dengan tujuan untuk
mengidentifikasi sekuens yang memiliki kesamaan
serta menganalisis persamaan sekuens tersebut yang
nantinya dikaitkan dengan analisis fenetik, evolusi dan
lain sebagainya.
 Berikut proses alignment pada sekuens DNA:

20.  BLAST adalah membandingkan data urutan nukleotida
atau protein dengan data base nukleotida atau protein di
seluruh dunia melalui situs dan beberapa situs lainnya.
 Selain sekadar menyimpan informasi biologis database itu
juga bisa digunakam untuk menganalisis gen-gen, fungsi-
sungsinya dan evolusinya,
 sebagai contoh jika ada sebuah gen diklona dan di
sekuensing, sekuens itu bisa digunakan untuk penelusuran
yang disebut BLAST terhadap semua sekuens yang
diketahui.

21. KONSTRUKSI POHON FILOGENI
 Filogeni: kajian mengenai hubungan antara
kelompok-kelompok organisme yang dianggap
sebagai dasar dari proses evolusi.
 Pohon filogeni: suatu gambaran silsilah makhluk
hidup yang bercabang-cabang sehingga menyerupai
pohon.
 Menunjukan adanya hubungan evolusi dengan
berbagai spesies makhluk hidup berdasarkan
kemiripan dan perbedaan karakteristik fisik dan
genetik.

22. Konstruksi Pohon Filogeni
 Cara pembuatan pohon filogeni:
1. Cara Sederhana (Manual)
2. Cara dengan menggunakan software
 Klasifikasi kontruksi pohon filogenetika:
1. Phenetic sistem: pengelompokan organisme
berdasarkan kesamaan (fisik dan kimia) karakteristik.
2. Kladistik: pengelompokan organisme didasarkan pada
kesamaan warisan evolusi.

23. Konstruksi Pohon Filogeni
 Mengkonstruksi pohon filogenik dari data molekuler:
1. Metode maximum parsimony/minimum evolution method:
memprediksikan pohon evolusi yang meminimalkan jumlah langkah
yang dibutuhkan untuk variasi yang diamati dalam sekuen.
2. Metode Distance: digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetika
dalam kelompok melalui perubahan pasangan sekuen dalam
kelompok.
3. Metode maximum likehood: menggunakan kalkulasi untuk menemukan
pohon yang mempunyai hitungan variasi terbaik dalam set sekuen.

24. Konsep Filogenetik
 Konsep filogenik: konsep mengenai bagaimana sekelompok makhluk
hidup membagi sifat yang dimilikinya satu dengan yang lainnya.
 Pembagian sifat:
1. Symplesiomorphy: Sifat yang dibagi oleh oleh dua atau lebih taksa
tetapi juga ditemukan pada taksa nenek moyang yang sebelumnya.
2. Homoplasy: Sifat yang dibagi oleh dua atau lebih taksa tetapi sifat ini
tidak ditemukan pada nenek moyang yang paling terakhir.
3. Synapomorphy: Sifat yang dibagi oleh satu atau dua taksa, sifat ini
ditemukan pada nenek moyang terakhir yang sama

25. Konsep Filogenetik
 Pohon evolusi terdiri dari cabang-cabang luar (outer
branches) atau daun-daun (leaves) yang
merepresentasikan taxa dan titik-titik (nodes) dan
cabang merepresentasikan hubungan diantara taxa.
 Taxa /pemisahan sekuen: jarak filogenetika unit pada
sebuah pohon.
 Total panjang semua cabang dalam pohon disebut
sebagai panjang pohon.

26. Konsep Filogenetik
 Dalam penentuan taksa, diperlukan pengelompokan spesies kedalam
taksa yang lebih spesifik seperti:
1. Monofiletik yaitu jika nenek moyang tunggalnya hanya
menghasilkan semua spesies turunan dalam takson tersebut dan
bukan spesies pada takson lain.
2. Polifiletik yaitu jika anggotanya diturunkan dari dua atau lebih
bentuk nenek moyang yang tidak sama bagi semua anggotanya.
3. Parafiletik yaitu jika takson itu tidak meliputi spesies yang memiliki
nenek moyang yang sama yang menurunkan spesies yang termasuk
dalam takson tersebut.

27. Konsep Filogenetik
 Hubungan antara Taksonomi dengan Pohon Filogeni:
 Pohon filogenik merupakan diagram yang melacak
kemungkinan hubungan evolusioner di antara
kelompok-kelompok taksonomik.
 Dengan kata lain Filogeni melacak pola keturunan
dari garis keturunan.

28. Pengembangan Penelitian Terkini dalam Molekul Mikrobiologi

30. 1. Alat dan Bahan
Sampel penelitian berupa material daun muda
(berwarna hijau muda hingga hijau kekuningan
) sejumlah 30 jenis (Tabel 1). Pengambilan sa
mpel dilakukan pada pagi hari antara pukul 06.
00 sampai dengan 07.00 WIB.

31. 2. CARA KERJA
1. Isolasi DNA
2. Amplifikasi DNA
melalui tehnik PCR
3. Sekuensing DNA
4. Analisis Data
1. ISOLASI DNA
menggunakan metode CTAB (Cethyl Trimethyl Ammonium Bromide) Jumlah pell
et DNA yang diperoleh dilarutkan dalam 50 μl buffer TE (Tris EDTA) pH 7,6. Perla
kuan sampel DNA penelitian untuk jangka panjang disimpan pada suhu - 20°C.

32. 2. Amplifikasi DNA
melalui tehnik PCR
Amplifikasi DNA menggunakan penanda molekuler matK, r
bcL (coding DNA) dan trnL-F (non-coding DNA) pada se
tiap sampel DNA.
Setiap 10 μl larutan, dilakukan pencampuran aquabidesh (
ddH2O) sebanyak 6,4 μl, larutan PCR mix (2x konsentrasi)
sebanyak 2,35 μl, primer forward (10 pmole) sebanyak 0,3
75 μl, primer reverse (10 pmole) sebanyak 0,375 μl dan 0,5
μl sampel DNA. Amplifikasi mengggunakan alat PCR therm
al cycle.
Program annealing untuk penanda molekuler rbcL adalah p
re-denaturasi pada suhu 94° C selama 3 menit; denaturasi
pada suhu 94°C selama 45 detik, annealing pada suhu 55°
C selama 30 detik, ekstensi pada suhu 72°C selama 2 men
it (diulang sebanyak 35 siklus);

33. 3. SEKUENSING DNA
Sekuensing DNA dilakukan untuk mengetahui sekuen DNA dari sampel DNA hasil amplifikasi. Sampel DNA disek
uensing menggunakan automatic sequencer machine di Laboratorium 1st-Base, Malaysia.

34. 4. ANALISIS DATA
Menggunakan program ABI sequence scanner untuk mengetahui kualitas sekuen DNA.
Pohon filogenetik dihasilkan melalui proses alignment menggunakan program Clustal W, dilanjutkan analisis
berdasarkan model evolusi Kimura 2 parameter (K2P) dengan metode algoritma Neighbour-Joining (NJ), Ma
ximum Likelihood (ML) dan Maximum Parsimony (MP) menggunakan program statistik MEGA 5.03.
Perbandingan antara ketiga metode algoritma tersebut menggunakan nilai bootstrap 1000 ulangan untuk meng
uji validitas topologi dari pohon filogenetik. Kategori nilai bootstrap meliputi tinggi (˃85%), moderat (70–85 %
), lemah (50–69 %), atau sangat lemah (<50%). (Kress, dkk., 2002)

35. HASIL DAN PEMBAHASAN
POHON
FILOGENETIK
sub-suku Malmeoideae
(klad I)
terdiri dari anggota dari tribus Miliuseae.
Sister dari sub-suku Annonoideae dan mer
epresentasikan 35% dari diversitas jenis A
nnonaceae, sehingga tergolong dalam Sh
ort Branch Clades (SBC)
Annonoideae (klad II)
Anggota tribus Xylopiae, Annoneae dan U
variae.
Tergolong dalam Long Branch Clades (LB
C) yang merepresentasikan 60% dari dive
rsitas jenis Annonaceae.
coding sekuen DNA rbcL memiliki
kisaran nilai bootstrap yang lemah
hingga sangat lemah (17-63%)
dan matK memiliki kisaran nilai b
ootstrap yang tinggi (98-99%).
Sedangkan non-coding sekuen
DNA (trnL-F) memiliki nilai boots
trap yang sangat lemah (36-53%)
hingga tinggi (100%).
“Nilai bootstrap yang tinggi ditun
jukkan oleh kelompok LBC dari su
b-famili Annonoideae khususnya m
enggunakan penanda molekuler D
NA rbcL and trnL-F .”

36. Gambar 1. Kladogram jenis-jenis Annonaceae terpilih berdasarkan
metode analisis (A) Maximum Parsimony, (B) Maximum Likelihood, (
C) Neighbour-Joining; I = Malmeoideae dan II = Annonoideae
“Topologi dari pohon filogenetik memberikan
klarifikasi yang lebih besar dibandingkan peng
elompokan dengan karakter morfologi meskipun
memiliki nilai bootstrap yang rendah.”
“Topologi pohon filogenetik digunakan untuk
menjawab berbagai permasalahan yang terkai
t dengan tingkatan evolusi dalam karakter
morfologi.”

37. Analisis polimorfisme terhadap kladogram dari coding dan non-coding sekuen DNA dilakukan untuk mengetahui kara
kter polimorfisme pada masing-masing penanda molekuler DNA.
Karakter yang diamati meliputi karakter yang terkonservasi, singletone dan informatif parsimoni (Tabel 2). Karakter yan
g bersifat polimorfik terdiri dari karakter singletone dan informatif parsimoni.
Berdasarkan tabel 2 dapat diketahui bahwa non-coding sekuen DNA (trnL-F) memiliki jumlah karakter singletone da
n informatif parsimoni paling sedikit dibanding coding sekuen DNA. Kedua karakter tersebut mempengaruhi tinggi rendahnya
nilai bootstrap pada topologi pohon filogenetik yang dibentuk. Banyaknya karakter singletone dan informatif parsimoni pada codi
ng sekuen DNA menyebabkan nilai bootstrapnya rendah sehingga klad yang terbentuk kurang kokoh.
Molekuler DNA dari coding sekuen DNA (rbcL dan matK) hanya sedikit menjelaskan hubungan antar jenis maupu
n antar marga di dalam suku Annonaceae, namun memberikan kontribusi yang besar dalam pemisahan klad untuk masing-m
asing sub-suku.
Berdasarkan hasil penelitian ini, penanda molekuler dari non-coding sekuen DNA (trnL-F) menghasilkan topologi pohon fil
ogenetik yang paling baik dibanding coding sekuen DNA (rbcL dan matK).

38. KESIMPULAN
Topologi pohon filogenetik dari ketiga penanda molekuler DNA menunjukkan bahwa non-coding sekuen DNA (trnL
-F) memberikan topologi pohon filogenetik terbaik serta mampu menunjukkan hubungan antar jenis dalam Annon
aceae dibanding coding sekuen DNA (rbcL dan matK).

39. Kesimpulan
• Mikrobiologi molekuler: pengkajian mengenai kehidupan mikroba pada skal
a molekul.
• Isolasi DNA/RNA/plasmid pada risnsipnya sama yaitu penghancuran (lisis)
, ektraksi, dan pemisahan serta purifikasi.
• Proses PCR terdiri dari tiga tahap, yakni denaturasi, penempelan (annealin
g), dan amplifikasi.
• Teknik penjajaran sekuens: sekuensing, alignment,dan blast.
• Pohon filogenetik menunjukan adanya hubungan evolusi dengan berbagai s
pesies makhluk hidup berdasarkan kemiripan dan perbedaan karakteristik fi
sik dan genetik.

40. TERIMA KASIH