1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28428
(51) A61K 38/43 (2006.01)
A61K 36/899 (2006.01)
G01N 30/96 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/0954.1
(22) 18.07.2013
(45) 15.05.2014, бюл. №5
(72) Гильманов Мурат Курмашевич; Ригер Наталья
Георгиевна; Карабалин Арман Балтабаевич; Кастер;
Керимкулова Макпал Рыскуловна; Габдурахманова
Гульнара Жумабековна; Филимонова Ольга
Валерьевна; Адильбаева Алтынай Болатовна
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Институт
молекулярной биологии и биохимии им.
М.А. Айтхожина" Комитета науки Министерства
образования и науки Республики Казахстан
(56) Colman R.F., Frieden С. Cooperative Interaction
between the GTP Binding Sites of Glutamate
Dehydrogenase// Biochem. Biophys. Res. Commun,
1966, V.22, р.100-105
(54) ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
ГЛЮТАМАТА
(57) Ферментный препарат для определения
концентрации глютамата относится к области
клинической диагностики, анализа пищевых
продуктов и аналитической биохимии, касается
разработки ферментного препарата на основе
ферментного комплекса (ФК), состоящего из
малатдегидрогеназы (МДГ) и
глютаматоксалоацетатаминотрансферазы (ГОАТ)
для определения концентрации глютамата в
клинической диагностике и в продуктах детского
питания.
Задача изобретения - получить сравнительно
недорогой стабильный ферментный препарат с
высокой чувствительностью к глютамату.
Поставленная задача достигается путем
получения ферментного препарата на основе ФК
МДГ-ГОАТ из эндоспермальной фракции семян
пшеницы, очищенного с помощью ионообменной
хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе и гель-
хроматографии на колонке с Сефакрилом S-300.
Таким образом, ферментный препарат на основе
ФК МДГ-ГОАТ рекомендуется для использования в
клинической диагностике и в продуктах детского
питания.
(19)KZ(13)A4(11)28428

2. 28428
2
Изобретение относится к области клинической
диагностики, анализа пищевых продуктов и
аналитической биохимии, а именно разработки
ферментного препарата на основе ферментного
комплекса (ФК), состоящего из малатдегидрогеназы
(МДГ) и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы
(ГОАТ) для определения концентрации глютамата.
Известно получение ферментного препарата
оксидазы аминокислот из яда гюрзы, применяемой
для определения L-глютамата (А.А. Тара,
Э.Э. Аавиксаар, В.Ю. Арве, Ю.Р. Сийгур. Способ
выделения оксидазы аминокислот из яда гюрзы//
патент №SU 1055769А от 23.11.83г., Бюл.№43)
путем внесения этого ферментного препарата и
определения количества кислорода с помощью
стандартных методов: полярографии или
окислительно-восстановительных индикаторов -
солей тетразолия или дихлорфенолиндофенола
(Ghobadi S.E. Bienzyme Carbon Paste Electrodes for L-
Glutamate Determination // Current Separation. -1996. -
V. 14. р.94-102). Недостатком этого метода является
малая чувствительность к L-глютамату оксидазы L
аминокислот.
Известно определение L-глютамата с помощью
глютаматдегидрогеназы из печени быка (кат. №
G2626 Sigma) (Асатиани B.C. Ферментные методы
анализа// Изд-во: М.: Наука, 1969 г.), (Colman R.F.,
Frieden С. Cooperative Interaction between the GTP
Binding Sites of Glutamate Dehydrogenase// Biochem.
Biophys. Res. Commun.- 1966. -V.22. р.100-105).
Недостатком этого метода является высокая
стоимость препарата, сравнительно низкая
чувствительность к L-глютамату, а также
нестабильность фермента и большая зависимость от
присутствия нуклеотидов, других аминокислот,
стероидов и ионов металлов, что ухудшает
получение надежных и воспроизводимых
результатов.
Задачей изобретения является возможность
получить сравнительно недорогой стабильный
ферментный препарат с высокой чувствительностью
к глютамату.
Поставленная задача достигается путем
получения ферментного препарата на основе
ферментного комплекса, состоящего из
малатдегидрогеназы и
глютаматоксалоацетатаминотрансферазы, из
эндоспермальной фракции семян пшеницы,
очищенного с помощью ионообменной
хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе и гель-
хроматографии на колонке с Сефакрилом S-300.
Ферментный препарат на основе ФК МДГ-ГОАТ
имеет молекулярную массу 110 килоДальтон и
состоит из 2-х субъединиц 50кДа и бОкДа
соответственно.
Для получения ферментного препарата семена
пшеницы размалывали на мельнице, просеивали
через сито и брали эндоспермальную фракцию
семян, которую гомогенизировали в заранее
охлажденном 0,05 М трис -фосфатном буфере,
рН 7,4. Гомогенат центрифугировали при
10 000 оборотов в минуту в течение 10 минут.
Супернатант подвергали ионообменной
хроматографии на колонке с ДЭАЭ целлюлозой
типа ДЕ-52 Сервацел фирмы «Серва» (Германия),
уравновешенной 0,05 М трис -фосфатным буфером,
рН 7,4. После смыва несвязавшихся белков
проводили ступенчатую элюцию КС1, растворенном
в стартовом буфере. Ферментный комплекс
элюировался 0,15 М КС1. Для дальнейшей очистки
использовали гель-хроматографию на колонке с
Сефакрилом S-300 фирмы «Фармация» (Швеция),
уравновешенной 0,05М трис - фосфатным буфером,
рН 7,4. Ферментный препарат элюировался в пике,
который соответствует пикам белков с
молекулярной массой 110 кДа.
Пример 1.
На фиг.1, представлены результаты очистки
ферментного препарата на основе МДГ-ГОАТ из
семян пшеницы с помощью ионообменной
хроматографии на колонке с ДЭАЭ целлюлозой
типа ДЕ-52 Сервацел фирмы «Серва» (Германия),
уравновешенной 0,05 М трис -фосфатным буфером,
рН 7,4, где ферментный комплекс элюировался
0,15 М КС1.
Пример 2.
На рисунке 2, представлены результаты очистки
ферментного препарата на основе МДГ-ГОАТ из
семян пшеницы с помощью гель хроматографии на
колонке с Сефакрилом S-300 фирмы «Фармация»
(Швеция), уравновешенной 0,05М трис - фосфатным
буфером, рН 7,4.
Пример 3.
На рисунке 3 представлен калибровочный
график определения концентрации глютамата с
помощью ферментного препарата на основе ФК
МДГ - ГОАТ из семян пшеницы.
Пример 4.
Очищенный препарат ФК МДГ - ГОАТ
используют в качестве ферментного препарата. Для
этого необходимо приготовить реакционную смесь
следующего состава: 1,1 мМ НАД, 12мМ малат,
трис - фосфатный буфер, рН 7,7. Для
количественного определения глютамата к полной
реакционной смеси добавляют 0,2 мл испытуемой
пробы (кровь, моча, слюна, околоплодная жидкость
или строго разведенные растворы пищевых
полуфабрикатов) и определяют активность ФК МДГ
- ГОАТ на спектрофотометре при длине волне
340 нм в течении 1-2 минут. По полученной
активности на калибровочном графике определяют
точную концентрацию анализируемого вещества в
испытуемой биологической жидкости, рассчитанной
на 1мл пробы.
Установлено, что на активность ФК не влияют
ионы 1 и 2-х валентных металлов, ионы цинка и
ртути. Установлено, что в ферментном препарате
отсутствуют эссенциальные сульфгидрильные
группы, что делает его очень удобным для
определения концентрации глютамата.
Установлено, что нуклеотиды: АТФ, АДФ, АМФ,
ГТФ, ГДФ, ГМФ и различные протеиногенные
аминокислоты не оказывают влияние на активность
ФК.
Установлено, что очищенный растворенный
препарат ФК лучше всего хранится при температуре

3. 28428
3
-15°С в течение нескольких месяцев без потери
активности. Лиофильно высушенные препараты ФК
могут храниться в обычном холодильнике до 1-го
года без существенной потери активности.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Ферментный препарат для определения
концентрации глютамата, включающий выделение
фермента из биологического сырья гомогенизацией
и хроматографической очисткой, отличающийся
тем, что используют ферментный комплекс,
состоящий из малатдегидрогеназы и
оксалоацетатаминотрансферазы (МДГ-ГОАТ) из
эндосперма семян пшеницы.
2. Ферментный препарат для определения
концентрации глютамата по п.1, отличающийся
тем, что для очистки ферментного комплекса
малатдегидрогеназы и
глютаматоксалоацетатаминотрансферазы,
эндоспермальную фракцию семян пшеницы
гомогенизируют в охлажденном 0,05М трис-
фосфатном буфере рН 7,4, затем гомогенат
центрифугируют при 10000 об. в минуту в течение
10 минут, далее супернатант подвергают
ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЭ,
для дальнейшей очистки элюированного
ферментного комплекса используют гель -
хроматографию на колонке с Сефакрилом S-300.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч