Документ описывает способ получения ассоциированной инактивированной сорбированной вакцины против гриппа птиц и болезни Ньюкасла, предполагающий использование двух вирусных штаммов, которые репродуцируются в развивающихся куриных эмбрионах. Предложенный метод позволяет сократить трудоемкость вакцинации, ускорить формирование иммунитета и снизить себестоимость противоэпизоотических мер. Вакцина обеспечивает приобретение иммунитета против обеих инфекций с помощью одной прививки.

1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29718
(51) A61K 39/145 (2006.01)
A61K 39/12 (2006.01)
A61P 31/12 (2006.01)
C12N 7/00 (2006.01)
C12R 1/92 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0438.1
(22) 04.04.2014
(45) 15.04.2015, бюл. №4
(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович;
Мырзахметова Балжан Шайзадаевна; Даутпаева
Зауреш Жумагановна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) RU 2358760 С1, 2009
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
АССОЦИИРОВАННОЙ
ИНАКТИВИРОВАННОЙ СОРБИРОВАННОЙ
ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА ПТИЦ И
БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА
(57) Изобретение относится к области
ветеринарной вирусологии и может быть
использовано для одновременной специфической
профилактики гриппа птиц и болезни Ньюкасла.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в получении
ассоциированной вакцины, содержащей в своем
составе иммунизирующие компоненты против
гриппа А подтипа A/H5N3 и болезни Ньюкасла,
применение которой резко снизит трудоемкость
самого процесса вакцинации, сократит сроки
формирования напряженного иммунитета у
привитой птицы сразу против двух особо опасных
патогенов и снизит себестоимость
противоэпизоотических мер, проводимых против
гриппа птиц А и болезни Ньюкасла.
Способ получения ассоциированной
инактивированной сорбированной вакцины против
гриппа и болезни Ньюкасла, включающий
репродукцию подтипового вируса гриппа птиц в
развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию
химическим агентом и эмульгирование в качестве
подтипа вируса гриппа птиц используют штамм
AV-0001 ЛБП - 5/3 КазНИВИ вируса гриппа типа А
и дополнительно штамм AV-0016 Алматы-03
КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла, которые
репродуцируют в развивающихся куриных
эмбрионах в течение 48 ч при температуре 37-38°С,
затем инактивируют формальдегидом в
концентрации 0,05% в течение 48 ч при температуре
37-38°С и сорбируют на гели гидрата окиси
алюминия, взятой в концентрации 1,0-1,2% к
общему объему вирусной массы и получают
целевой продукт.
(19)KZ(13)A4(11)29718

2. 29718
2
Изобретение относится к области ветеринарной
вирусологии и может быть использовано для
одновременной специфической профилактики
гриппа птиц и болезни Ньюкасла.
Известен способ получения ассоциированной
вакцины против гриппа птиц, включающий
репродукцию подтипового вирусов гриппа птиц в
развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию
химическим агентом эмульгирование [Патент
Российской Федерации №2358760, кл. А61K 39/135,
C12N 7/00, 2009].
Недостатком известного способа получения
ассоциированной вакцины против гриппа птиц
является то, что биопрепарат не содержит
иммунизирующего компонента против болезни
Ньюкасла и для создания протективности против
гриппа птиц подтипа A/H5N3 и болезни Ньюкасла
требуется использование двух разных вакцин и
проведение двукратной прививки птицы с затратой
дополнительного времени на вакцинацию и
формирование иммунитета.
Задачей предлагаемого изобретения является
создание ассоциированной вакцины, которая
способна обеспечить формирование напряженного
иммунитета сразу против гриппа птиц подтипа
A/H5N3 и болезни Ньюкасла с помощью одной
прививки.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в получении
ассоциированной вакцины, содержащей в своем
составе иммунизирующие компоненты против
гриппа птиц подтипа A/H5N3 и болезни Ньюкасла,
применение которой резко снизит трудоемкость
самого процесса вакцинации, сократит сроки
формирования напряженного иммунитета у
привитой птицы сразу против двух особо опасных
патогенов и снизит себестоимость
противоэпизоотических мер, проводимых против
гриппа птиц и болезни Ньюкасла.
Способ получения ассоциированной
инактивированной сорбированной вакцины против
гриппа птиц и болезни Ньюкасла, включающий
репродукцию подтипового вируса гриппа птиц в
развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию
химическим агентом и эмульгирование, в качестве
подтипа вируса гриппа птиц используют штамм
AV-0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц
типа А и дополнительно штамм AV-0016
Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла,
которые репродуцируют в развивающихся куриных
эмбрионах в течение 48 ч при температуре 37-38°С,
затем, инактивируют формальдегидом в
концентрации 0,05% в течение 48 ч при температуре
37-38°С и сорбируют на гели гидрата окиси
алюминия, взятой в концентрации 1,0-1,2% к
общему объему вирусной массы и получают
целевой продукт.
Способ осуществляется следующим образом.
Для приготовления ассоциированной
инактивированной сорбированной вакцины против
гриппа птиц и болезни Ньюкасла используют
штамм AV- 0001 ЛБП - 5/3 КазНИВИ вируса гриппа
птиц типа А и штамм AV-0016 Алматы-03
КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла. Штаммы
депонированы и хранится в Лаборатории генофонда
культур микроорганизмов Товарищества с
ограниченной ответственностью «Казахский
научно-исследовательский ветеринарный институт»
(ТОО «КазНИВИ»).
Штамм AV-0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса
гриппа птиц типа А
Штамм AV-0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса
гриппа А патогенен по отношению к курам и
перепелам и обладает высокой репродуктивной
активностью в развивающихся куриных эмбрионах
и культуре фибробластов эмбрионов этих видов
птицы, которая способствует накоплению вирионов
вируса в повышенных концентрациях в единице
объема экстра-эмбриональной и культуральной
жидкостей.
Высокие концентрации вирусов гриппа птиц в
экстра - эмбриональной и культуральной жидкостях
обуславливают возможность получения из них
инактивированного вакцинного препарата с
высокими иммунобиологическими параметрами.
Состав среды и условия культивирования. Для
получения развивающихся эмбрионов кур или
перепелов оплодотворенные инкубационные яйца
этих видов птицы, свободных от патогенной
микрофлоры инкубируют в специальных
инкубаторах поддерживающих в камере инкубации
температуру в пределах 37-38°С, влажность - не
ниже 60% и обеспечивающих принудительный 4
кратный воздухообмен за час и автоматическое
переворачивание яиц с эмбрионами
периодичностью 2 раза за час в течение 10-12 суток.
За период инкубации ежедневно яйца овоскопируют
и контролируют развитие в них эмбрионов. С 10-х
суток полученные эмбрионы используют для
репродукции и вирусов гриппа птиц.
Для получения монослойной культуры клеток
фибробластов эмбрионы кур 10-12 суточного или
перепелов 6-7-суточного возраста трипсинизируют с
помощью 0,25% раствора трипсина и в
концентрациях 200-400 тыс.кл/мл высевают и
выращивают в матрасах или круговых сосудах с
питательной средой, содержащей 90% среды ИГЛА-
MEM и 10% сыворотки крови крупного рогатого
скота, а через 24-48 ч, после образования полного
монослоя в стенках сосудов, их используют для
репродукции вирусов с применением той же
питательной среды, но с 5% сыворотки крови
крупного рогатого скота. Культивирование
культуры клеток и вирусов в ней осуществляют при
температуре 37-38°С.
Морфологические признаки. Вирус гриппа птиц
типа А относится к семейству Orthomyxoviridae,
роду Influenza (А, В), вирионы плеоморфной или
округлой формы, диаметром 80-120 нм, состоят из
фрагментированного нуклеокапсида спиральной
симметрии диаметром 9-15 нм или липопротеидной
оболочки, на поверхности которой имеются
выступы длиной 10-13,5 нм.
Штамм AV-0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса
гриппа птиц подтипа A/H5N3 обладает
морфологическими признаками, свойственными для

3. 29718
3
возбудителя гриппа типа А из рода Influenza
семейства Orthomyxoviridae.
Культуральные свойства. Штамм AV-0001 ЛБП -
5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц репродуцируется
и накапливается в развивающихся куриных и
перепелиных эмбрионах и культуре фибробластов
этих эмбрионов в титре 107,25
ЭИД/ТЦД50/см3 и выше
(эмбриональные инфекционные дозы/титр
цитопатических доз, вызывающие
эмбриональные/клеточные поражения у 50%
инфицированных эмбрионов/культуры клеток). В
указанном титре штамм вируса накапливается после
двукратного последовательного пассирования в
развивающихся куриных эмбрионах или культуре
фибробластов при использовании множественности
заражения вирусом равной 0,1-0,0001 ЭИД50/эмб или
ТДЦ50/кл. В развивающихся эмбрионах
кур/перепелов пик накопления штамма вируса
наступает через 48 ч после инфицирования
возбудителем. Цитопатогенное действие штамма
вируса в монослой зараженных фибробластов
проявляется через 24 ч после инфицирования и
охватывает более 80% его площади в период между
48 ч и 96 ч.
Антигенные свойства. Штамм AV-0001 ЛБП-5/3
КазНИВИ вируса гриппа птиц при инокуляции в
инактивированном формальдегидом виде в
организме кур, перепелов, кроликов, коз
стимулирует образование вируснейтрализующих
антител (3-5 log2) и антигемагглютининов (5-7 log2).
Патогенные свойства. Штамм AV-0001 ЛБП-5/3
КазНИВИ вируса гриппа птиц патогенен. Штамм
AV-0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц
вызывает развитие болезни с острым течением
характеризующейся 80% и выше заболеваемостью и
летальностью у инфицированных кур и перепелов.
Иммуногенные свойства. Штамм AV-0001
ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц
репродуцированные в развивающихся куриных
эмбрионах после инактивации формальдегидом и
сорбции гелью гидроокиси алюминия в дозе 0,5 см3
при подкожном введении стимулирует
формирование напряженного иммунитета против
гриппа птиц в организме привитых кур, который
формируется на 14 сутки и продолжается в течение
не менее 6 месяцев. Привитая птица полностью не
восприимчива к гомологичным вирулентным
вирусам.
Стабильность свойств при пассировании.
Основные биологические свойства штамма AV-0001
ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц при
культивировании в развивающихся куриных
эмбрионах сохраняются в течение не менее 10
последовательных пассажей (срок наблюдения).
Сохраняемость. Штамм AV-0001 ЛБП-5/3
КазНИВИ вируса гриппа птиц в экстра-
эмбриональной жидкости сохраняют свою
исходную биологическую активность при
температуре 4±1°С в течение 30 суток (срок
наблюдения), при минус 18-20°С - 3 месяцев (срок
наблюдения), при минус 40°С и ниже - не менее 12
месяцев (срок наблюдения). Образцы вирусных
штаммов, лиофилизированные в смеси со
стабилизирующей средой, содержащей пептон 3%,
сахарозу 4% и желатин 1%, сохраняют
биологическую активность при температуре 4±1°С в
течение не менее 12 месяцев.
Штамм AV-0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса
болезни Ньюкасла
Штамм AV-0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса
болезни Ньюкасла патогенен по отношению к курам
и обладает также как и штамм вируса грипп А
активной репродуктивностью в развивающихся
куриных эмбрионах и культуре фибробластов этих
эмбрионов, способствующая накоплению
возбудителя в повышенных титрах.
Высокие концентрации вирусов гриппа и
болезни Ньюкасла в экстра-эмбриональной и
культуральной жидкостях обуславливают
возможность получения из них инактивированного
вакцинного препарата с высокими
иммунобиологическими параметрами.
Состав среды и условия культивирования
Для получения развивающихся эмбрионов кур
или перепелов оплодотворенные инкубационные
яйца этих видов птицы, свободных от патогенной
микрофлоры инкубируют в специальных
инкубаторах поддерживающих в камере инкубации
температуру в пределах 37-38°С, влажность - не
ниже 60% и обеспечивающих принудительный 4
кратный воздухообмен за час и автоматическое
переворачивание яиц с эмбрионами
периодичностью 2 раза за час в течение 10-12 суток.
За период инкубации ежедневно яйца овоскопируют
и контролируют развитие в них эмбрионов. С 10-х
суток полученные эмбрионы используют для
репродукции и болезни Ньюкасла.
Для получения монослойной культуры клеток
фибробластов эмбрионы кур 10-12 суточного или
перепелов 6-7-суточного возраста трипсинизируют с
помощью 0,25% раствора трипсина и в
концентрациях 200-400 тыс.кл/мл высевают и
выращивают в матрасах или круговых сосудах с
питательной средой, содержащей 90% среды ИГЛА-
MEM и 10% сыворотки крови крупного рогатого
скота, а через 24-48 ч, после образования полного
монослоя в стенках сосудов, их используют для
репродукции вирусов с применением той же
питательной среды, но с 5% сыворотки крови
крупного рогатого скота. Культивирование
культуры клеток и вирусов в ней осуществляют при
температуре 37-38°С.
Морфологические признаки. Вирус болезни
Ньюкасла относится к семейству Paramyxoviridae,
подсемейству Paramyxovirinae, роду Paramyxovirus,
вирионы в виде частиц плеоморфной, чаще
округлой формы, диаметром 150-300 нм, состоят из
нуклеокапсида спиральной симметрии и
липопротеидной оболочки, на поверхности которой
имеются выступы длиной 8-12 нм.
Штамм AV-0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса
болезни Ньюкасла обладает морфологическими
признаками, свойственными для возбудителя
Ньюкаслской болезни из рода Paramyxovirus
подсемейства Paramyxovirinae семейства
Paramyxoviridae.

4. 29718
4
Культуральные свойства. Штамм AV-0016
Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла
репродуцируется и накапливается в развивающихся
куриных эмбрионах и культуре фибробластов этих
эмбрионов в титре 109,25
ЭИД/ТДД50/см3 и выше
(эмбриональные инфекционные дозы/титр
цитопатических доз, вызывающие
эмбриональные/клеточные поражения у 50%
инфицированных эмбрионов/культуры клеток). В
указанном титре штамм вируса накапливается после
однократного пассирования в развивающихся
куриных эмбрионах или культуре фибробластов при
использовании множественности заражения равной
0,01-0,00001 ЭИД50/эмб или ТЦД50/кл. В
развивающихся эмбрионах кур пик накопления
штамма вируса наступает через 48 ч после
инфицирования возбудителем. В монослое
культуры фибробластов цитопатогенное действие
штамма вируса проявляется через 24 ч после
инфицирования и охватывает более 80% его
площади в период между 48 ч и 96 ч.
Антигенные свойства. Штамм AV-0016 Алматы-
03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла при
инокуляции в инактивированном формальдегидом
виде в организме кур, перепелов, кроликов, коз
стимулирует образование вируснейтрализующих
антител (3-5 log2) и антигемагглютининов (5-7 log2).
Патогенные свойства. Штамм AV-0016
Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла
патогенны. Штамм AV-0016 Алматы-03 КазНИВИ
вируса болезни Ньюкасла вызывает
остропротекающую тяжелую форму болезни со
100% заболеваемостью и летальностью среди кур.
Иммуногенные свойства. Штамм AV-0016
Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла,
репродуцированные в развивающихся куриных
эмбрионах после инактивации формальдегидом и
сорбции гелью гидроокиси алюминия в дозе 0,5 см3
при подкожном введении стимулирует
формирование напряженного иммунитета против
болезни Ньюкасла в организме привитых кур,
который формируется на 14 сутки и продолжается в
течение не менее 6 месяцев. Привитая птица
полностью не восприимчива к гомологичным
вирулентным вирусам.
Стабильность свойств при пассировании.
Основные биологические свойства штамма AV-0016
Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла при
культивировании в развивающихся куриных
эмбрионах сохраняются в течение не менее 10
последовательных пассажей (срок наблюдения).
Сохраняемость. Штамм AV-0016 Алматы-03
КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла в экстра -
эмбриональной жидкости сохраняют свою
исходную биологическую активность при
температуре 4±1°С в течение 30 суток (срок
наблюдения), при минус 18-20°С - 3 месяцев (срок
наблюдения), при минус 40°С и ниже - не менее
12 месяцев (срок наблюдения). Образцы вирусных
штаммов, лиофилизированные в смеси со
стабилизирующей средой, содержащей пептон 3%,
сахарозу 4% и желатин 1%, сохраняют
биологическую активность при температуре 4±1°С в
течение не менее 12 месяцев.
Пример 1. Для получения ассоциированной
инактивированной сорбированной вакцины против
гриппа птиц и болезни Ньюкасла из эмбрионального
вируса готовят развивающиеся куриные эмбрионы
10-12-суточного возраста путем инкубации
инкубационных (оплодотворенных) яиц кур в
специальных инкубаторах, поддерживающих в
камере температуру в пределах 37-38°С, влажности
воздуха не ниже 60% и обеспечивающих
периодический воздухообмен и переворачивание
яиц. Развитие и состояние эмбрионов контролируют
овоскопированием и в возрасте 10-12 суток
подвергают их инфицированию штаммами вируса
болезни Ньюкасла по отдельности в дозе 0,01-0,001
ЭИД50 путем инокуляции в аллантоисную полость.
Инфицированные вирусами эмбрионы продолжают
инкубировать при тех же условиях еще в течение
8 ч. По истечению указанного времени все
эмбрионы охлаждают при температуре 4±1°С в
течение 18-24 ч, вскрывают их и собирают
асептически экстра-эмбриональную жидкость
(аллантоисная) в качестве вирусной биологической
массы. Собранную в единую емкость
вируссодержащую экстра-эмбриональную жидкость
замораживают при температуре минус 40°С,
исследуют на наличие антигемагглютининов, титр
вируса и контаминацию посторонней микрофлорой.
Стерильную биологическую массу с титром
гемагглютининов не ниже 7,0 log2 подвергают
инактивирующей обработке формальдегидом в
концентрации 0,01% к общему объему вирусной
массы в течение 48 ч при температуре 37±1°С,
сорбируют гелью гидроокиси алюминия путем
добавления ее в инактивированную вирусную массу
в соотношении 1:100 и отстоя в течение 24 ч при
температуре 4±1°С после умеренного встряхивания.
Полученную таким образом белую массу с
сероватым оттенком принимают за конечный
продукт - вакцину против гриппа птиц и болезни
Ньюкасла инактивированную сорбированную,
который в последующем подвергают
стандартизации по иммунобиологическим
свойствам.
Иммунобиологические свойства вакцины
характеризуются следующими данными.
Стерильность по отношению к посторонним
контаминантам.
Стерильность вакцины испытывают согласно
требованиям ГОСТ 28085. В вакцине не должны
присутствовать посторонние контаминанты
бактериального, грибкового и вирусного характера.
Безвредность. На безвредность вакцину
проверяют на десяти цыплятах 30-45-суточного
возраста путем внутримышечного введения ее в
дозе по 1,5-2,5 см3
/гол, содержащей 3-5-кратно
превышающий прививной объем препарата. У
вакцинированных цыплят в течение 10 суток после
прививки не должны отмечаться какие-либо
патологии местного и общего характера.
Реактогенность. Реактогенность вакцины
проверяют на десяти цыплятах 30-45-суточного

5. 29718
5
возраста путем внутримышечного введения ее в
иммунизирующей дозе, которая составляет
0,5 см3
/гол. Препарат должен быть слабо
реактогенным. Реакция организма на введенную
вакцину может проявляться у отдельных особей
птицы на 2-4 сутки после прививки в виде слабой
местной, характеризующейся гиперемией и
воспалительным отеком в месте введения
препарата, которая исчезает в течение 2-3 суток без
ветеринарного вмешательства. В большинстве
случаев реакция организма на введение вакцины
клинически не проявляется.
Иммуногенность. Иммуногенность вакцины
проверяют на тридцати цыплятах 30-45-суточного
возраста путем внутримышечного введения ее в
иммунизирующей дозе (0,5 см3
/гол). Для этого
вакцину с помощью стерильного одноразового
шприца или специального дозатора вводят
30 цыплятам внутримышечно, а затем через 21
сутки всех привитых и 30 аналогичных цыплят, не
привитых вакциной (контрольные), инфицируют
вирулентными вирусами гриппа птиц подтипа
AH5N3 и болезни Ньюкасла в дозе по
10 3,0-4,0
ЦЛД50/гол путем внутримышечного введения.
Для проведения контрольного заражения
вакцинированных и контрольных цыплят разделяют
на две группы. Цыплят первый группы, состоящих
из 10 вакцинированных и 10 не вакцинированных,
заражают вирулентным вирусом гриппа А подтипа
H5N3, второй группы, состоящей из аналогичного
количества вакцинированных и не
вакцинированных, инфицируют вирулентным
вирусом болезни Ньюкасла.
Вакцина считается иммуногенной, если в
течение 14 суток после контрольного заражения не
менее чем 80% привитых цыплят каждой группы
останутся здоровыми и живыми при заболевании и
гибели не менее чем 80% не вакцинированных
цыплят каждой группы. Допускается клиническое
выздоровление заболевших контрольных цыплят
при сохранении требуемого количества больных.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения ассоциированной
инактивированной сорбированной вакцины против
гриппа птиц и болезни Ньюкасла, включающий
репродукцию подтипового вируса гриппа птиц в
развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию
химическим агентом и эмульгирование,
отличающийся тем, что в качестве подтипа вируса
гриппа птиц используют штамм AV-0001 ЛБП-5/3
КазНИВИ вируса гриппа птиц типа А и
дополнительно штамм AV-0016 Алматы-03
КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла, которые
репродуцируют в развивающихся куриных
эмбрионах в течение 48 ч при температуре 37-38°С,
затем инактивируют формальдегидом в
концентрации 0,05% в течение 48 ч при температуре
37-38°С и сорбируют на гели гидрата окиси
алюминия, взятой в концентрации 1,0-1,2% к
общему объему вирусной массы и получают
целевой продукт.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова