Download luận án tiến sĩ ngành công nghệ sinh học với đề tài: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN NGỌC QUANG
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội – 2020

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN NGỌC QUANG
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 942 02 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
2. TS. BS. Nguyễn Phi Hùng
Hà Nội – 2020

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu,
cộng tác với các nhà khoa học khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng như các hội nghị trong
nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại
trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Ngọc Quang
Nguyễn Ngọc Quang

4. LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ
bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ
cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm
túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực
hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau
này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. BS.
Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K.
Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong
những lúc tôi gặp khó khăn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Tạ Văn Tờ, TS. Vương Diệu Linh và các
đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời
gian qua.
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng,
thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp
tôi hoàn thành tốt luận án này.
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Ngọc Quang

5. MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.....................................................................................4
1.1. Ung thư phổi.........................................................................................................4
1.1.1. Thực trạng ung thư phổi....................................................................................4
1.1.2. Phân loại ung thư phổi ......................................................................................6
1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi ...............................................................................7
1.2. Ung thư biểu mô tuyến của phổi..........................................................................9
1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến .......................................................................9
1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến ................................11
1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi .............................................................13
1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR...................................................................13
1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi..........................................................15
1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi...................................................17
1.4. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi.................................................................17
1.4.1. Methyl hóa DNA.............................................................................................17
1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong
ung thư phổi......................................................................................................20
1.5. Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi.......................................................29
1.5.1. Điều trị đích trong ung thư..............................................................................29
1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi......................................................................31
1.6. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi.............................33
1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi................................33
1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi ........................35
1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam .......................37
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP...................................................39
2.1. Vật liệu...............................................................................................................39
2.1.1. Mẫu nghiên cứu...............................................................................................39
2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................39
2.2. Thiết bị chính .....................................................................................................42
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................43

6. 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA ......................................43
2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số.....................................................................44
2.3.3. Phương pháp PCR...........................................................................................44
2.3.4. Phương pháp điện di .......................................................................................47
2.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR.....................................................47
2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch .........................................................48
2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI .........................49
2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học.............................................................50
2.4. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................................50
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ ......................................................................................51
3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu........................................................................51
3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR .......................................................................52
3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân......................52
3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân..............56
3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của
phổi...................................................................................................................59
3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ................59
3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ..............61
3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân...............63
3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân ......................65
3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân...........66
3.4. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một
số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi ...................................................68
3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR.....................68
3.4.2. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa
các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A.................................................71
3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu
mô tuyến của phổi ............................................................................................74
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................76
4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi.....76
4.1.1. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR......................................76

7. 4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR ............................................................78
4.1.3. Methyl hóa vùng promoter EGFR ..................................................................80
4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR ........................................81
4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh
nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi ..............................................................83
4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1..........................................................83
4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT ..........................................................84
4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 ...........................................................86
4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A ......................................................87
4.3. Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của
phổi...................................................................................................................88
4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u...............88
4.3.2. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u ............................90
4.3.3. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô
tuyến của phổi...................................................................................................91
KẾT LUẬN..............................................................................................................94
KIẾN NGHỊ.............................................................................................................95
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ...............................................................................96
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................97

8. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt Tên đầy đủ
A260 Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm
AAH
Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức
không điển hình)
ABL Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene
ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ)
AIS Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ)
ALK Anaplastic Lymphoma Kinase gene
ALK-EML4,
BCR-ABL
Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL
APC Adenomatous polyposis of the colon gene
BAC Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang)
BCR Breakpoint Cluster Region gene
BRCA1 Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú)
BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B
CD74 Cluster of Differentiation 74 gene
CHFR Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains
CK5/6 Cytokeratin 5/6 protein
CK7 Cytokeratin 7 protein
COBRA
Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp
Bisulfite và cắt giới hạn)
cs. Cộng sự
DAB 3, 3 –diaminobenzidine
DAPK Death‐associated protein kinase
DNA Acid deoxyribonucleic
DNMTs DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA)

9. dNTP Deoxynucleotide triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
EGFR Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô)
ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen)
FDA
Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm và thuốc
Hoa Kỳ)
FFPE Formalin fixed paraffin embedded
FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang)
GTP Guanosine triphosphate
GDP Guanosine diphosphate
GSTP1 Glutathione S-transferase Pi 1 gene
H&E Hematoxylin & Eosin
HDACs Histone deacetylase
HRM High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy)
HPR Horseradish Peroxidase
IARC
International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên
cứu ung thư thế giới)
IHC Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch)
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MDR Multidrug resistance gene
MEK
(MAP2K1)
Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1
MET Mesenchymal-epithelial transition factor
MIA Minimally Invasive Adenocarcinoma
MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene
MLH1 MutL homolog 1 gene
MsssI CpG methyltransferase
MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl)

10. MYC Myelocytomatosis genes
NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)
NSCLC Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ)
PI3K Phosphoinositide 3-kinases
PTEN Phosphatase and tensin homologue
PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone)
RASSF1A Ras association domain family 1A gene
RARP2 The retinoic acid receptor P gene
Ras Rat sarcoma
RB2 Retinoblastoma-like protein 2
RET Rearranged during transfection
ROS1 c-ros oncogene 1gene
SAM S-adenosylmethionine
SCLC Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ)
SDC4 Syndecan 4 gene
SLC34A2 Solute Carrier Family 34 Member 2 gene
SNP Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide)
SSCP
Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi
đơn)
TAE Tris-acetate-EDTA
TBE Tris-borate-EDTA
TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
TKIs Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase)
TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene
TTF-1 Transcription Termination Factor 1 (Yếu tố kết thúc phiên mã 1)
WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới)
WNT Wingless genes
YAP Yes-associated protein

11. DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên
thế giới 5
Hình 1.2 Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018 5
Hình 1.3 Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi 7
Hình 1.4 Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến 11
Hình 1.5 Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi 12
Hình 1.6 Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR 14
Hình 1.7 Tần suất các dạng đột biến gen EGFR 15
Hình 1.8 Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư 19
Hình 1.9 Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR 22
Hình 1.10 Cấu trúc gen BRCA1ở người 22
Hình 1.11 Chức năng ức chế khối u của BRCA1 23
Hình 1.12 Cấu trúc gen MLH1 24
Hình 1.13 Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1 24
Hình 1.14 Cấu trúc gen MGMT 26
Hình 1.15 Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT 26
Hình 1.16 Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân 27
Hình 1.17 Chức năng ức chế khối u của RASSF1A 28
Hình 1.18 Điều trị đích trong ung thư phổi 32
Hình 1.19 Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen 35
Hình 1.20 Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA 36
Hình 2.1 Phương pháp xử lý bisulfite 44
Hình 2.2 Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms 48
Hình 2.3 Phương pháp hóa mô miễn dịch 49
Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 50
Hình 3.1 Kết quả phát hiện đột biến EGFR 53

12. Hình 3.2 Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR 56
Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen EGFR 59
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen BRCA1 61
Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen MGMT 63
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl
hóa MLH1 65
Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen RASSF1A 67
Hình 4.1 Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện
EGFR 81

13. DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 40
Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 41
Bảng 2.3 Điều kiện các phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu 45
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu 46
Bảng 3.1 Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu 51
Bảng 3.2 Các đột biến gen EGFR được phát hiện trong nghiên cứu 52
Bảng 3.3 Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 54
Bảng 3.4 Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh
nhân nam giới
55
Bảng 3.5 Mức độ biểu hiện protein EGFR 57
Bảng 3.6 Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR với đặc điểm
bệnh nhân 58
Bảng 3.7 Tương quan giữa methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân 60
Bảng 3.8 Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân 62
Bảng 3.9 Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân 64
Bảng 3.10 Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân 66
Bảng 3.11 Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân 68
Bảng 3.12 Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein
EGFR 69
Bảng 3.13 Tỷ lệ đột biến, biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR 70
Bảng 3.14 Tương quan giữa đột biến và methyl hóa với biểu hiện EGFR 70

14. Bảng 3.15 Tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A 72
Bảng 3.16 Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa các
gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A 73
Bảng 3.17 Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến ung thư
biểu mô tuyển ở phổi 74

15. 1
MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Ung thư phổi là loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong cao nhất trên thế giới
hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2018 có đến 2,1 triệu
trường hợp mắc mới và 1,8 triệu người chết do ung thu phổi. Trong khi đó, số ca
mắc mới và tử vong ở Việt Nam là 160 000 và 115 000 người. Ung thư phổi được
chia làm hai nhóm chính là ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 10 – 15 % và ung thư
phổi không tế bào nhỏ chiếm 85 – 90 %. Trong đó, ung thư biểu mô tuyến của phổi
là dạng phổ biến nhất, không chỉ gặp ở những người hút thuốc lá mà còn khá phổ
biến ở những người không hút thuốc, phụ nữ và những người trẻ tuổi. Ung thư phổi
nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng có tiên lượng và mức độ đáp
ứng điều trị rất thấp, chỉ 10 – 15 % bệnh nhân ung thư phổi có thể sống sót qua 5
năm. Tuy vậy hiệu quả điều trị sẽ được cải thiện rõ rệt nếu như bệnh nhân được
phát hiện ung thư sớm và sử dụng những phác đồ điều trị hiện đại. Một trong những
phương pháp điều trị mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay là những thuốc điều
trị nhắm đích dựa trên những hiểu biết về những biến đổi di truyền của tế bào ung
thư. Ở ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi
nói riêng, phác đồ điều trị bằng thuốc nhắm đích TKIs (Tyrosine Kinase Inhibitors)
dựa trên những đột biến về gen EGFR (Epidermal growth factor receptor) đang
được sử dụng rộng rãi và mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời
gian sống thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi. Bên
cạnh đó việc đánh giá sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong
việc đưa ra những tiên lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng
thuốc cho bệnh nhân. Mặt khác, biểu hiện gen EGFR lại được điều khiển bởi mức
độ methyl hóa vùng promoter của gen này. Cùng với EGFR, methyl hóa các gen ức
chế khối u cũng được xem là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triển của
ung thư. Methyl hóa các gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1,
RASSF1A…. đã được phát hiện trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi.
Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa một số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng
xấu cho bệnh nhân và được xem là marker điển hình trong ung thư phổi. Đồng thời,

16. 2
sự kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại
hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKIs trên những dòng tế bào ung
thư phổi điển hình.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư phổi. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu tổng thể về những biến đổi
phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của hiện tượng methyl hóa các gen ức chế
khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên những biến đổi này. Ở Việt Nam hiện
nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa ra
phác đồ điều trị bằng TKIs. Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột
biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên
quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi” với mục tiêu:
1. Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư biểu mô tuyển ở phổi.
2. Đánh giá được tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1,
MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột
biến và biểu hiện protein EGFR.
Nội dung nghiên cứu
1. Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu bệnh
phẩm ung thư phổi và mẫu phổi liền kề.
2. Xác định tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR. Phân tích sự liên
quan của các đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến và biểu hiện gen EGFR.
3. Thiết lập và xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl
nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter các gen EGFR, BRCA1,
MGMT, MLH1 và RASSF1A và sự tương quan của hiện tượng này với các đặc điểm
bệnh nhân trong nghiên cứu.
4. Phân tích tương quan giữa đột biến và biểu hiện EGFR với tình trạng methyl
hóa các gen liên quan bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A.

17. 3
Đóng góp mới của luận án
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định toàn diện các đặc điểm phân tử
của EGFR là đột biến, methyl hóa và biểu hiện protein. Đồng thời, đánh giá được
tình trạng methyl hóa 4 gen ức chế khối u quan trọng trong ung thư biểu mô tuyến
của phổi. Nghiên cứu có một số đóng góp mới và ý nghĩ thực tiễn như sau:
1. Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu hiện của protein EGFR và sự methyl hóa
của một số gen liên quan đến sự phát sinh ung thư, tiến triển bệnh và đáp ứng điều
trị ung thư biểu mô tuyến ở phổi.
2. Chỉ ra được mối liên quan giữa methyl hóa gen RASSF1A với methyl hóa
các gen BRCA1 và MLH1. Sự khác nhau của methyl hóa vùng promoter gen EGFR
và BRCA1 với sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến
ở phổi.

18. 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Ung thƣ phổi
1.1.1. Thực trạng ung thư phổi
Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo thống kê của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư
phổi trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư (Hình 1.1) [35]. Đây vẫn ung thư
phổ biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số). Tỷ lệ mắc cao nhất
là ở Trung Âu và Đông Âu (53,3/100 000 người) và Đông Á (50,4/100 000 người).
Tỷ lệ mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100 000 người). Ở phụ
nữ, ung thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4%
tổng số). Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau
ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc
lá. Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) và Bắc Âu
(23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100 000
người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100 000 người) [35]. Hiệp
hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm 2017, đã có
thêm 225 500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư
được phát hiện. Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm
quá 5 năm. Cũng theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015 có đến
155 800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư
[102]. Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong
do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư
vú và ung thư đại tràng cộng lại [102].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có
khoảng 160 000 trường hợp mắc mới và có tới 115 000 người tử vong do ung thư.
Việt Nam đứng ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong
110/100 000 người (Hình 1.2). Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ 2 ở nam
giới và đứng hàng thứ 3 ở nữ giới nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai ở cả nam
và nữ (sau ung thư gan). Số ca mắc mới ung thư phổi ở nam giới năm 2000 chỉ là 6
905 ca với tỉ lệ 29,3/100 000 dân, đến năm 2018 số ca mắc đã là 23 667 trường hợp

19. 5
(14,4% tổng số ca ung thư) và tăng tỉ lệ lên 35,1/100 000 dân. Dự báo, đến năm
2020, số trường hợp mắc mới có thể lên tới 23 000 ở nam giới và hơn 34 000 ở cả
hai giới [35]. Cũng theo WHO, Việt Nam nằm ở nhóm nước có tần suất mắc ung
thư phổi cao thuộc hàng thứ hai trên thế giới, với tỉ lệ mắc ở nam giới là 25,5 –
41,5/100 000 dân và ở nữ giới là 7,3 – 13,6/100 000 dân [35].
Hình 1.1. Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới [35].
Hình 1.2. Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2018 [35].

20. 6
1.1.2. Phân loại ung thư phổi
Ung thư phổi được phân loại dựa trên kết quả xét nghiệm mô bệnh học [84].
Sự phân loại này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị và tiên lượng
bệnh. Ung thư phổi được hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô,
gọi là ung thư biểu mô. Ung thư biểu mô phổi được phân loại theo kích thước và
hình thái của các tế bào ác tính quan sát dưới kính hiển vi. Để phục vụ cho mục đích
điều trị, ung thư phổi được chia ra hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ
(NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC –
Small Cell Lung Cancer) (Hình 1.3) [72].
1.1.2.1. Ung thư phổi không tế bào nhỏ
Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó
ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung
thư biểu mô tế bào lớn [57].
Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường
hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57]. Ung thư biểu
mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [135]. Đây
cũng là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [112].
Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng
25 – 30% số trường hợp ung thư phổi. Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vẩy,
là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi. Ung thư biểu mô tế
bào vẩy có xu hướng được tìm thấy ở phần trung tâm của phổi, gần một đường hô
hấp chính (phế quản), thường gặp ở nam giới và có liên quan mật thiết với tiền sử
hút thuốc lá nhiều hơn so với hầu hết các loại ung thư phổi khác [65].
Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 –
15% số trường hợp mắc ung thư phổi. Sở dĩ tên gọi như vậy vì tế bào ung thư có
kích thước rất lớn, với sự dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn và hạch nhân dễ thấy
[84]. Ung thư biểu mô tế bào lớn có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào của phổi. Nó có
xu hướng phát triển và lan truyền nhanh chóng, điều này có thể làm cho việc điều trị
trở nên khó khăn hơn. Một phân nhóm của ung thư biểu mô tế bào lớn, được gọi là
ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, là một loại ung thư phát triển nhanh, rất giống
với ung thư phổi tế bào nhỏ [84].

21. 7
Ngoài ra ung thư phổi không tế bào nhỏ còn có thêm một số phân típ khác
hiếm gặp như là carcinoid và thần kinh nội tiết [84].
Hình 1.3. Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi [57].
1.1.2.2. Ung thư phổi tế bào nhỏ
Đặc điểm nổi bật của ung thư phổi tế bào nhỏ là các tế bào chứa dày đặc các
hạt tiết thể dịch thần kinh đó là những túi tiết chứa hormone thần kinh nội tiết, do
đó khối u loại này có liên quan đến với hội chứng cận ung thư/nội tiết [118,
135]. Đa số trường hợp bệnh phát sinh ở đường dẫn khí lớn (phế quản chính và phế
quản thùy). Khoảng 60 – 70% trường hợp bệnh được phát hiện ở giai đoạn đã lan
rộng và không thể tiến hành xạ trị ở một phạm vi đơn lẻ [57].
1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi
Ung thư được phân chia theo các giai đoạn phát triển dựa vào kích thước, vị
trí của khối u nguyên phát, mức độ xâm lấn cũng như khả năng di căn. Hiện nay, hệ
thống phân loại giai đoạn ung thư phổi đang được sử dụng phổ biến nhất là hệ thống
TNM, dựa trên kích thước khối u (Tumor), số hạch lympho phát sinh (Node) và
mức độ di căn (Metastasis). Theo hệ thống phân loại này, tiến triển của ung thư
phổi có thể chia thành các giai đoạn từ 0 (STAGE 0) đến IV (STAGE IV) [3].
Giai đoạn 0 tương ứng với ung thư phổi không xâm lấn, không có hạch,
không di căn xa. Giai đoạn này, các tế bào ung thư chỉ khu trú, không hề xuất hiện

22. 8
bất cứ một tế bào ung thư hay tế bào dị thường nào xuất hiện ngoài vùng phổi/phế
quản, hay có biểu hiện tấn công các vùng mô lành xung quanh [3].
Giai đoạn I tương ứng với ung thư phổi xâm lấn, các tế bào ung thư bắt đầu
lan tỏa và tấn công các phần mô lành, với kích thước khối u ≤ 5 cm. Ở giai đoạn
này, sự xâm lấn mới chỉ diễn ra rất ít, chủ yếu bao xung quanh phổi hoặc lá tạng
màng phổi, không xâm lấn vào phế quản thùy; chưa có hiện tượng di căn hạch. Giai
đoạn I được chia làm IA, IB tùy thuộc vào kích thước khối u [3]. Thời gian sống
thêm sau 5 năm đối với những bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn I khoảng 65%
(55 – 90,5%). Thời gian sống thêm của bệnh nhân nhóm này phụ thuộc vào kích
thước khối u khi phát hiện bệnh. Đối với bệnh nhân ở giai đoạn T1N0, tỷ lệ sống
sau 5 năm là 82%, sau 10 năm là 74%. Trong khi tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân T2N0
giảm xuống lần lượt là 68% và 60% [84].
Giai đoạn II được chia ra làm IIA và IIB. IIA mô tả ung thư xâm lấn dưới
dạng khối u có kích thước nhỏ hơn 5 cm, di căn hạch cạnh phế quản cùng bên
và/hoặc hạch cạnh rốn phổi, bao gồm cả xâm lấn trực tiếp vào hạch, chưa có di căn
xa. IIB mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng khối u có kích thước có thể lớn hơn 5cm
và nhỏ hơn 7 cm, có di căn hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh rốn
phổi; hoặc khối u có kích thước lớn hơn 7 cm, hoặc có xâm lấn trực tiếp vào thành
ngực, cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất, hoặc lá thành màng tim [3].
Thời gian sống sau 5 năm của bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn II là 42%. Đặc
điểm của mô bênh học của khối u cũng có ảnh hưởng đến thời gian sống thêm.
Bệnh nhân thuộc nhóm T1 ung thư biểu mô tế bào vẩy có 75% sống sau 5 năm,
nhưng con số này chỉ là 25% ở bệnh nhân T2 ung thư biểu mô tuyến [84].
Giai đoạn III tương ứng với ung thư có di căn hạch lympho, các hạch này tập
trung thành cụm hoặc gắn lên các cấu trúc khác. Giai đoạn III được chia ra làm IIIA
và IIIB. Giai đoạn III mô tả ung thư xâm lấn chưa có di căn xa, khối u nguyên phát
có kích thước có thể lên đến 7 cm, hoặc xâm lấn vào lá tạng màng phổi, có liên
quan đến phế quản, hoặc xâm lấn vào thành ngực, cơ hoành, lá thành màng tim;
hoặc khối u có kích thước bất kỳ đã xâm nhiễm vào trung thất, lan vào tim, mạch
máu lớn, khí quản, thực quản, thân đốt sống, hoặc đã có tràn dịch màng phổi ác
tính. Giai đoạn IIIA và IIIB khác nhau ở tình trạng di căn hạch của khối u, trong đó

23. 9
IIIB có di căn hạch trung thất đối bên, hạch rốn phổi đối bên, di căn hạch cơ bậc
thang cùng bên hoặc đối bên, hoặc hạch thượng đòn. Ngược lại, IIIA được mô tả
hoặc không có di căn hạch, hoặc hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh
rốn phổi, hoặc di căn hạch trung thất cùng bên và/hoặc hạch dưới carina [3]. Thời
gian sống trung bình của bệnh nhân nhóm IIIA là 12 tháng và chỉ có 9 – 15% trường
hợp có thể sống thêm 5 năm. Trong khi đó, thời gian sống trung bình của bệnh nhân
giai đoạn IIIB là 8 tháng và chỉ có dưới 5% bệnh nhân có thể sống sót sau 5 năm
[84].
Giai đoạn IV mô tả ung thư phổi xâm lấn dưới dạng di căn ra xa và hình
thành các hạch lympho ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể. Ở giai đoạn này, có
các khối riêng biệt ở một thùy đối bên, hoặc khối u có các khối ở màng phổi, hoặc
có các tổn thương ác tính ở màng phổi [3]. Với những bệnh nhân giai đoạn IV việc
phẫu thuật loại bỏ khối u là điều gần như không thể. Thời gian sống thêm của bệnh
nhân nhóm này rất ngắn, đồng thời rất hiếm bệnh nhân có thế sống sót quá 5 năm
[84]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp hiếm gặp, bệnh nhân có thể được phẫu
thuật thành công, làm cải thiện đáng kể chất lượng cuộc sống và thời gian sống
thêm. Thời gian sống sau 5 năm có thể lên tới 13 – 21% và thời gian sống trung
bình là 14 tháng [84].
1.2. Ung thƣ biểu mô tuyến của phổi
1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến
Ung thư biểu mô tuyến chiếm khoảng 40% số trường hợp ung thư phổi (Hình
1.3). Ung thư này thường bắt đầu ở những tế bào tiết thông thường như là tế bào tiết
chất nhầy [57, 84]. Ung thư biểu mô tuyến xảy ra ở những người đã từng hoặc đang
hút thuốc, nhưng phổ biến nhất ở những người không hút thuốc. Ngoài ra, ung thư
biểu mô tuyến ở phổi phổ biến ở nữ giới hơn nam giới và hay gặp ở những người trẻ
tuổi hơn những loại ung thư phổi khác [84].
Ung thư biểu mô tuyến của phổi thường được tìm thấy ở phần bên ngoài của
phổi. Mặc dù có xu hướng phát triển chậm hơn so với những dạng ung thư phổi
khác và khả năng phát hiện trước khi ung thư lan rộng nhưng nó lại rất khác nhau
giữa các bệnh nhân. Những bệnh nhân ung thư phổi tại chỗ (Adenocarcinoma in
situ) thường có tiên lượng tốt hơn so với những loại ung thư phổi khác [57, 84].

24. 10
Ung thư biểu mô tuyến ngoại vi ở phổi được cho là phát sinh từ các tổn
thương tiền ung thư được gọi là tế bào ung thư tân sản (Neuoplasia) sau đó phát
triển thành các tế bào ung thư phân chia quá mức không điển hình (Atipical
Adenomatous Hyperplasias - AAH), AAH được coi là hình ảnh mô học đầu tiên
trong quá trình hình thành khối u ác tính (Hình 1.4) [41]. AAH mang những biến
đổi di tuyền và di truyền ngoại gen tương tự với những biến đổi được tìm thấy trong
ung thư tuyến của phổi kể cả đột biến KRAS, EGFR, TP53, mất đoạn dị hợp tử tại
cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm sắc thể số 16, và biến đổi đi truyền
ngoại gen WNT [59]. Từ các AAH sẽ tiếp tục hình thành ung thư biểu mô tuyến tại
chỗ (AIS – Adenocarcinoma in situ) hay còn được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế
nang (BAC – Bronchioloalveolar Carcinoma); lần đầu tiên tiến tới giai đoạn tiền
ung thư trước khi được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC). Đây được coi
là giai đoạn không xâm lấn của những tế bào ung thư tuyến tân sản nhưng chúng thể
hiện sự tăng kích thước và hình thái tế bào không điển hình. Giai đoạn tiếp theo của
ung thư là sự hình thành xâm lấn tối thiểu (MIA – Minimally Invasive
Adenocarcinoma), được định nghĩa là một ung thư biểu mô tuyến nhỏ (kích thước
nhỏ hơn 3 cm) với thành phần chủ yếu là tổn thương lepidic và xâm lấn nhỏ hơn
5mm tại một vị trí. Sau đó khối u chuyển sang quá trình xâm lấn (Invasive
Carcinoma) mặc dù các yếu tố không xâm lấn có thể tồn tại ở các cạnh của các khối
u [59].
Di căn là giai đoạn cuối cùng trong quá trình phát triển của khối u. Ung thư
biểu mô phổi có thể di căn theo hệ bạch huyết cũng như mạch máu. Sự di căn theo
con đường mạch máu thường thấy ở các khối u ở giai đoạn thấp, thường dẫn đến
tăng tỷ lệ tái phát cũng như rút ngắn thời gian sống sót của bệnh nhân. Trong khi di
căn qua đường bạch huyết thường mất nhiều thời gian hơn cho sự hình thành khối u
di căn, di căn qua đường bạch huyết sẽ hình thành những khối u di căn xa [39]. Ung
thư biểu mô phổi có một số địa điểm ưu tiên cho di căn như: Não, xương và tuyến
thượng thận. Các cơ quan khác có di căn thường ở giai đoạn cuối của bệnh. Đối với
các loại ung thư phổi khác nhau có sự ưu tiên hình thành khối u di căn không giống
nhau, chẳng hạn như di căn gan trong ung thư biểu mô phổi tế bào nhỏ và di căn
não trong ung thư tuyến mô [39].

25. 11
Hình 1.4. Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến [59].
1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến
Khối u trong ung thư biểu mô tuyến thể hiện sự biệt hóa tuyến với một hay
nhiều dạng phát triển gồm một số dạng chính: Tổn thương lepidic, chùm nang, nhú,
vi nhú hoặc dạng đặc … (Hình 1.5) [57, 84].
Tổn thương lepidic: Đây là sự phát triển không điển hình các tế bào vuông
đơn dọc theo thành phế nang có đặc điểm: Cấu trúc phế nang vẫn được duy trì;
không có sẹo xơ trung tâm hay lan rộng; thường có dày thành phế nang; không có
hoặc ít phát triển dạng tầng; không tạo cấu trúc nhú. Nếu trên mảnh sinh thiết chỉ
thấy phát triển đơn thuần thành phần lepidic thì không loại trừ u có thành phần xâm
nhập [84].
Ung thư biểu mô tuyến nhú (Papillary Adenocarcinoma): U thường đơn độc
bao gồm cấu trúc nhú được phủ bởi tế bào kích thước lớn, không điển hình với nhân
lớn, tăng sắc, hạt nhân rõ, nhiều nhân chia (Hình 1.5A) [84].

26. 12
Hình 1.5. Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi.
(A) ung thư biểu mô tuyến nhú (HE x 100); (B) ung thư biểu mô tuyến vi nhú (HE x
400); (C) ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (HE x 400); (D) ung thư biểu mô
tuyến dạng chùm nang (HE x 200) [84].
Ung thư biểu mô tuyến vi nhú (Micropapillary Adenocarcinoma): Cấu trúc u
gồm các tế bào phát triển tạo các búi nhú không có trục liên kết xơ mạch. U có thể
liên tục với thành phế nang hoặc không. Tế bào u thường nhỏ, vuông đơn, nhân
không điển hình mức độ nhẹ. Thường có xâm nhập mô đệm và xâm nhập mạch. Tỷ
lệ xâm lấn và di căn cao (Hình 1.5B) [84].
Ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (Invasive Mucinous
Adenocarcinoma): Cấu trúc u gồm các tế bào trụ có chế nhầy ở cực ngọn, nhân nhỏ
nằm ở cực đáy. Tế bào u lót dọc thành phế nang, có thể tạo cấu trúc nhú (Hình
1.5C) [84].

27. 13
Ung thư biểu mô tuyến chùm nang (Acinar Adenocarcinoma): U có dạng
nang, túi tuyến hoặc ống với tế bào hình trụ hoặc hình khối vuông, nhân lệch đáy,
chế nhày, gợi tuyến của phế quản (Hình 1.5D) [84].
Ung thư biểu mô tuyến đặc (Solid adenocarcinoma): U không có cấu trúc
nhú, ống, nang; thay vào đó là các mảng tế bào hình đa diện nhưng có ít nhất 5 tế
bào chế nhày trên 2 vi trường có độ phóng đại lớn [84].
Ung thư biểu mô tuyến bào thai (Fetal Adenocarcinoma): Thường gặp ở độ
tuổi trẻ hơn các típ khác. U gồm các tuyến ống được lót bởi tế bào trụ không có
lông với bào tương sáng, nhân nằm ở cực đáy thường có hốc. Đôi khi u gợi hình
ảnh u nguyên bào phổi típ đơn pha (Monophasic Pulmonary Blastoma). Xảy ra do
đột biến gen β – catenin [84].
Ung thư biểu mô tuyến nhày dạng keo (Mucinous “Colloid”
Adenocarcinoma): U có đặc điểm giống với loại u cùng tên ở đường tiêu hóa. U
gồm các cấu trúc ống, tuyến kích thước không đều, mô đệm có nhiều chất nhày đặc
và quánh. Tế bào u trôi nổi trong bể chất nhày [84].
1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thƣ phổi
1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR
EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) nằm trong họ thụ thể yếu tố phát
triển biểu bì bao gồm HER-1 (EGFR), HER-2, HER-3 và HER-4 trong phân lớp thụ
thể Tyrosine Kinase (Tyrosine Kinase Receptor) [12]. Protein EGFR là một
glycoprotein màng có kích thước 170 kDa với cấu trúc gồm 3 phần chính là: Phần
gắn phối tử ở ngoài màng, phần protein xuyên màng và phần bên trong tế bào chất
với vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase được mã hóa bởi gen EGFR nằm trên cánh ngắn
của nhiễm sắc thể 7 (7p12) gồm 28 exon. EGFR chứa một số yếu tố lặp lại, bao
gồm SINE và LINE, và một vùng giàu (TGG/A) trong intron 15, và 2 vùng lặp lại
CA trong intron 27, đặc biệt exon 1 rất giàu trình tự GC [49,114]. EGFR có vai trò
quan trọng trong quá trình nhân lên, chết theo chương trình, di động, xâm nhập, sửa
chữa và tương tác giữa tế bào với tế bào. Khi phân tử EGFR kết hợp với phối tử
chúng sẽ thực hiện quá trình nhị trùng hợp (homo/heterodimeration) và hoạt hóa
phân tử EGFR qua đó kích hoạt hai con đường truyền tín hiệu chính của tế bào là
con đường qua PI3K/AKT/m-TOR và RAS/RAF1/MAP2K1/MAPK1 làm cho tế

28. 14
bào tăng phân chia, tăng khả năng sống sót và chống lại quá trình chết theo chương
trình [96].
Hình 1.6. Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR [96].
Con đường MAPK RAS-RAF-MEK-ERK có thể là con đường quan trọng
nhất liên quan đến phản ứng sinh học của EGFR, trong đó có gen RAS và RAF là
các tác nhân tiền gây ung thư (Hình 1.6). Mục tiêu chính trong liệu pháp điều trị
ung thư là MEK. MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) tương tác với hơn 100
cơ chất để khởi đầu một loạt các phản ứng sinh lý và bệnh lý, bao gồm tăng trưởng,
biệt hóa, di cư và ức chế chết theo chương trình (Apoptosis) [96]. Hệ thống dẫn
truyền tín hiệu PI3K-AKT-mTOR kiểm soát sự trao đổi chất, tăng sinh, kích thước
tế bào, sự sống còn và tính di động của tế bào. Trong ung thư, con đường này
thường được kích hoạt ở trạng thái tăng hoạt động do tạo ra đột biến đối với các
thành viên tham gia vào con đường, chẳng hạn như EGFR, PI3K, AKT; ngược lại
con đường này có thể giảm biểu hiện của gen ức chế khối u PTEN, từ đó ức chế
hoạt động của PI3K. Con đường PI3K-AKT-mTOR cũng rối loạn trong bệnh tiểu
đường, tự kỷ và lão hóa [22].

29. 15
1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi
Đột biến hoạt hóa các gen gây ung thư được xem như một điểm nhạy trong
ung thư. Khi gen gây ung thư nhạy cảm với các chất ức chế, đặc tính tăng sinh của
tế bào u bị loại bỏ, đặc biệt có thể gây chết tế bào [149]. Liệu pháp điều trị kháng
EGFR trong ung thư phổi được sử dụng trước khi có những hiểu biết về các đột
biến gen EGFR hoạt hóa. Cụ thể, Gefitinib, khi được sử dụng trong các trường hợp
quần thể không được sàng lọc, có tỷ lệ đáp ứng 10 – 20%. Erlotinib liên quan đến
việc cải thiện thời gian sống thêm của bệnh nhân, đặc biệt hiệu quả điều trị rõ rệt
đối với trường hợp ung thư biểu mô tuyến mang đột biến xảy ra với tỷ lệ cao ở bệnh
nhân nữ giới, không hút thuốc và chủng tộc Châu Á [70].
Hình 1.7. Tần suất các dạng đột biến gen EGFR [127].
Đến nay, đã phát hiện được khoảng 40 đột biến khác nhau của gen EGFR
nằm rải rác trên 4 exon từ 18 – 21 thuộc vùng kinase domain (Hình 1.7) [127]. Đột
biến dẫn đến sự tự động hoạt hóa phân tử EGFR mà không cần đến sự có mặt của
phối tử. Kết quả của quá trình này làm cho tế bào ung thư tăng cường sự phân chia,

30. 16
khả năng sống sót, tăng khả năng di căn, xâm lấn và chống lại sự chết theo chương
trình [88, 127]. Hầu hết các đột biến thường gặp là đột biến điểm và đột biến mất
đoạn dẫn đến sai lệch khung đọc mở, trong đó đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột
biến thay thế L858R ở exon 21 chiếm khoảng 90% tổng số các trường hợp bị đột
biến [88, 127]. Ba đột biến điểm thường gặp là G791C, L858R và L861Q; ba đột
biến mất đoạn chính là Del E746 – A750, Del L747 – T751inS và Del L747 –
T753inS [85]. Tỷ lệ đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của
phổi tương đối khác nhau ở các nghiên cứu. Những nghiên cứu được thực hiện ở
những bệnh nhân phương tây có tỷ lệ đột biến khá thấp 10 – 15% [8]. Trong khi
những nghiên cứu được công bố ở người châu Á có tỷ lệ đột biến 30 – 60% [105].
Đột biến gen EGFR thường gặp ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi là nữ
giới và không hút thuốc [8, 105].
Những hiểu biết về sinh học phân tử, nguyên nhân và cơ chế phát triển của
ung thư nói chung và ung thư phổi nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc xây
dựng những phác đồ điều trị mới có hiệu quả hơn rất nhiều so với những phương
pháp điều trị truyền thống trước đây cả về khả năng lui bệnh và chất lượng cuộc
sống của bệnh nhân ung thư [55]. Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs) là những chất
ức chế sự hoạt hóa phân tử EGFR được phát triển dựa trên những hiểu biết về đột
biến gen trong ung thư phổi [55, 139]. TKIs gắn vào vị trí bám ATP của phân tử
EGFR làm cho phân tử này không thể hoạt hóa và làm cho những con đường truyền
tín hiệu qua EGFR không hoạt động. Sự bất hoạt phân tử EGFR làm cho tế bào mất
khả năng phân chia, giảm khả năng sống sót và đi vào con đường chết theo chương
trình [68]. Trong những đột biến gen EGFR đã biết hầu hết những đột biến có sự
đáp ứng tốt với TKIs thế hệ thứ nhất và thế hệ thứ hai trong đó đột biến chiếm tỷ lệ
lớn nhất là mất đoạn ở exon 19 và thay thế L858R ở exon 21 được nghiên cứu và
thử nghiệm nhiều nhất. Có nhiều công trình nghiên cứu đã công bố về hiệu quả sử
dụng của TKIs đối với bệnh nhân ung thư phổi [55, 68, 139]. Những nghiên cứu
này đã chỉ ra được sự cải thiện đáng kể về tỷ lệ đáp ứng điều trị, thời gian tái phát u
và thời gian sống thêm ở những bệnh nhân mang đột biến này được sử dụng TKIs
so với bệnh nhân không sử dụng thuốc và bệnh nhân không mang đột biến [55, 68].

31. 17
1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi
Biểu hiện protein có liên quan mật thiết đến sự methyl hóa và khuếch đại gen
EGFR [80, 95]. Methyl hóa làm giảm sự biểu hiện protein trong khi khuếch đại gen
lại tăng cường mức độ biểu hiện [95, 122]. Mức độ biểu hiện protein được chia
thành các cấp độ khác nhau từ 0 đến 3+ tùy thuộc vào cường độ và tỷ lệ phần trăm
tế bào có sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt[80]. Phương pháp xác định mức độ
biểu hiện của EGFR trên bề mặt tế bào phổ biến nhất hiện nay là hóa mô miễn dịch,
sử dụng những kháng thể kháng EGFR đặc hiệu kết hợp với hệ enzyme – cơ chất
tạo mầu đặc trưng có thể quan sát bằng kính hiển vi quang học [80]. Khoảng 60 –
80% trường hợp ung thư biểu mô tuyến của phổi có sự biểu hiện protein EGFR,
trong đó sự biểu hiện quá mức EGFR chiếm khoảng 35 – 50% [80, 122]. Sự biểu
hiện EGFR cũng phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển của bệnh. Có đến 50% trường
hợp bệnh nhân ở giai đoạn III có sự biểu hiện quá mức EGFR trong khi đó tỷ lệ này
ở giai đoạn I và II lần lượt là 20% và 25%. Sự biểu hiện quá mức EGFR cũng đi
kèm với tiên lượng xấu cho bệnh nhân, thể hiện ở việc tăng nguy cơ xâm lấn hoặc
di căn; trong khi sự ức chế biểu hiện EGFR dẫn đến giảm sự phân chia tế bào ung
thư, sự di cư, hình thành mạch máu và quá trình apoptosis trong các khối u thể rắn
[122, 150]. Biểu hiện EGFR trong tế bào ung thư được kiểm soát chặt chẽ, tuy
nhiên cơ chế kiểm soát chưa được nghiên cứu đầy đủ. Điều hòa di truyền ngoại gen
là cơ chế sinh học mà gen được biểu hiện hay bị kìm hãm thông qua quá trình
methyl hóa DNA, biến đổi Histone và miRNA, trong đó phổ biến và tập trung nhiều
hơn cả là methyl hóa DNA. Nghiên cứu về trạng thái methyl hóa vùng promoter
liên quan đến biểu hiện protein EGFR tạo điều kiện cho sự phát triển các dấu ấn
sinh học hữu ích trong thử nghiệm lâm sàng [150].
1.4. Methyl hóa DNA trong ung thƣ phổi
1.4.1. Methyl hóa DNA
Methyl hóa DNA là hiện tượng gắn thêm gốc methyl (CH3) vào vị trí 5’ C
của nucleotide. Ở một số trường hợp, Adenine bị methyl hóa phổ biến đóng vai trò
trong cơ chế bảo vệ đối với vi khuẩn [134]. Trong khi đó ở động vật có vú, methyl
hóa DNA xảy ra ở Cytosine đứng trước Guanine trong phức CpG tạo thành 5 –
methylcytosine (5mC) [81]. Trong hệ gen ở người, đảo CpG là vùng giàu phức

32. 18
CpG, có kích thước từ 0,5 – 5,0 kb và thường tìm thấy trong vùng promoter của các
gen. Khi đảo CpG bị methyl hóa, các gen không được phiên mã. Methyl hóa xảy ra
tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen chiếm ưu thế so với các vị trí khác, bởi
vậy khi đánh giá tình trạng methyl hóa DNA thường xem xét tại vùng chứa đảo
CpG (Hình 1.8) [54]. Ngoài ra, methyl hóa DNA có vai trò nhất định đối với các tế
bào ở trạng thái bình thường như in dấu gen, duy trì trạng thái dị nhiễm sắc, duy trì
trạng thái bất hoạt của 1 nhiễm sắc thể X ở con cái động vật có vú [128]. Ở tế bào
bình thường, các Cytosine trong phức CpG không bị methyl hóa trong quá trình
phát triển và biệt hóa mô; tuy nhiên các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen có
thể bị methyl hóa dẫn đến trạng thái ức chế phiên mã của gen. Methyl hóa DNA
được hình thành trong quá trình biệt hóa tế bào, làm tế bào mất một phần hoặc mất
hoàn toàn khả năng phân chia. Methyl hóa DNA có tính đặc hiệu đối với các mô
trong cơ thể, và vai trò của hiện tượng này ở các tế bào khác nhau là không giống
nhau. Ở tế bào bình thường, promoter mang các đảo CpG không bị methyl hóa có
chức năng duy trì cấu trúc nhiễm sắc thực, đây là cấu trúc hoạt hóa phiên mã cho
phép gen được biểu hiện. Tuy nhiên, trong quá trình phát sinh ung thư, CpG vùng
promoter nhiều gen bị methyl hóa gây ức chế biểu hiện gen do thay đổi cấu trúc
nhiễm sắc thực thành cấu trúc dị nhiễm sắc. Enzyme DNA methyltransferase 1
(DNMT1) và DNA methyltransferase 3a, 3b (DNMT3a, DNMT3b) thực hiện quá
trình methyl hóa DNA [117]. DNMT1 duy trì nhóm methyl cho sợi DNA sau khi tái
bản; do đó duy trì trạng thái methyl hóa cho thế hệ sau [43]. DNMT1 tương tác với
một số protein như HDACs và HMTs tạo phức liên kết với CpG bị methyl hóa, từ
đó hình thành hệ thống phức tạp điều hòa sự sắp xếp lại chất nhiễm sắc và mức độ
biểu hiện gen. Nhóm DNMT3 gồm enzyme DNMT3a, DNMT3b và DNMT3L.
DNMT3a và 3b là các enzyme methyl hóa DNA ở các vị trí mới (denovo
methylation). DNMT3b và DNMT1 duy trì sự methyl hóa quá mức gen ức chế khối
u p16INK4a ở dòng tế bào ung thư đại trực tràng [115]. Khi hoạt tính của hai
enzyme bị ức chế, mức độ methyl hóa gen này giảm tới hơn 95% [115]. Trong khi
đó, DNMT3L có chức năng methyl hóa DNA trên các gen in dấu (imprinting genes)
[53].

33. 19
Methyl hóa DNA được chia thành 2 loại: Methyl hóa dưới mức và methyl
hóa quá mức. Methyl hóa DNA dưới mức trong ung thư thường xảy ra tại các trình
tự lặp lại, yếu tố vận động Alu hay LINE1, vùng DNA vệ tinh α gần tâm động. Kết
quả là thúc đẩy sự vận động của các yếu tố di truyền, tăng khả năng sắp xếp lại hệ
gen và phát sinh khối u. Ví dụ như methyl hóa dưới mức promoter của yếu tố vận
động L1 xuất hiện ở nhiều loại ung thư như thận, bàng quang, đại trực tràng [18].
Bên cạnh các trình tự lặp lại và yếu tố vận động, các nghiên cứu gần đây chỉ ra
methyl hóa dưới mức còn xảy ra ở các gen đơn bản trong các loại ung thư. Shao và
cs. (2011) phát hiện 8 gen bị methyl hóa dưới mức, bao gồm các gen AQP1,
CECR1, C1QR1, CTAG2, P53AIP1, TDRD12, BEX1 và DYNLT3 trong ung thư
biểu mô tuyến nước bọt, trong khi đó Gupta A. và cs. (2003) chỉ ra có sự methyl
hóa dưới mức gen synuclein γ trong ung thư vú và ung thư buồng trứng [45,124].
Bên cạnh đó, methyl hóa dưới mức có vai trò trong phát sinh ung thư bằng cách
hoạt hóa các gen gây ung thư như cMYC và H-RAS [33].
Hình 1.8. Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư [43].
Methyl hóa quá mức vùng promoter là cơ chế phổ biến gây bất hoạt các gen
ức chế khối u, xuất hiện ở nhiều loại ung thư thể rắn. Chẳng hạn, nhiều gen bị bất
hoạt do methyl hóa quá mức trong ung thư vú như các gen tham gia mã hóa thụ thể
steroid ER, PR; gen mã hóa protein liên kết tế bào E-cadherin; gen có chức năng

34. 20
sửa chữa DNA BRCA1, TIMP-3 [29, 111]. Trong khi đó, methyl hóa quá mức các
gen p15, p21, ER, SDC4, MDR liên quan tới các dạng ung thư máu [75]. Bên cạnh
các gen như RASSF1A và p16 thường bị methyl hóa trong nhiều loại ung thư, một
số gen chỉ methyl hóa đặc hiệu trong một loại ung thư, ví dụ như gen GSTP1 bị
methyl hóa quá mức trên 90% ở ung thư tuyến tiền liệt [91]. Hơn nữa, mức độ
methyl hóa của mỗi gen trong từng loại ung thư cũng khác nhau. Ví dụ như gen
RASSF1A ít bị methyl hóa trong ung thư đại tràng nhưng bị methyl hóa cao ở ung
thư vú, ung thư tuyến tiền liệt [29, 91, 111].
1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong
ung thư phổi
Ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Di truyền
ngoại gen được xem như một dấu ấn phân tử trong giai đoạn sớm hình thành ung
thư, hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng và định hướng điều trị. Methyl hóa DNA, biến đổi
Histone và miRNA là 3 lĩnh vực của di truyền ngoại gen, trong đó methyl hóa DNA
phổ biến và được tập trung nghiên cứu [61]. Hiện nay, hầu hết các dấu chuẩn ngoại
gen trong ung thư phổi được phát triển và ứng dụng ngày càng rộng rãi trong lâm
sàng.
Methyl hóa dưới mức hay quá mức tại các vùng chứa đảo CpG được chứng
minh liên quan đến ung thư phổi. Đặc biệt, methyl hóa quá mức vùng CpG thường
xảy ra ở giai đoạn sớm của quá trình phát sinh ung thư [61]. Nhiều gen được methyl
hóa quá mức trong ung thư phổi bao gồm p16, PAK3, NISCH, KIF1A, OGDHL,
BRMS1, FHIT, CTSZ, CCNA1, NRCAM, LOX, MGMT, DOK1, SOX15, TCF21,
DAPK, RAR, RASSF1, CYGB, MSX1, BNC1, CTSZ và CDKN2A [104,110]. Tần
suất methyl hóa của các gen có sự biến đổi rộng, một số gen như p16 hay MGMT,
tỷ lệ methyl hóa có thể lên đến 100% ở các trường hợp chẩn đoán ung thư phổi tế
bào nhỏ trước 3 năm. Một số gen ức chế khối u bị methyl hóa quá mức có vai trò
trong các quá trình tế bào khác nhau, chẳng hạn như điều chỉnh chu kỳ tế bào (p16),
sửa chữa DNA (MGMT), apoptosis (DAPK, caspase 8, ARF, FAS, TRAILR1,
RASSF1A, NORE1A và G0S2) [104, 109]. Protein p16 thúc đẩy quá trình chuyển
pha G1 sang pha S không biểu hiện do methyl hóa promoter chiếm 70% trong ung
thư phổi. Điểm đặc biệt là methyl hóa quá mức p16 thường xảy ra ở các tế bào biểu

35. 21
mô của người hút thuốc cũng như các dạng tổn thương, và tần suất methyl hóa tăng
lên cùng với sự tiến triển ung thư. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng sự thay đổi
trong quá trình methyl hóa quá mức Cytosine có giá trị chẩn đoán và tiên lượng
trong ung thư phổi, trong một số trường hợp có thể sử dụng để dự đoán đáp ứng
điều trị. Zhang và cs. (2011) đánh giá methyl hóa 20 gen ức chế khối u trên 78 mẫu
UTPKTBN và 50 mẫu đối chứng cho thấy một bộ 5 gen (APC, RASSF1A, CHD13,
KLK10 và DLEC1) bị methyl hóa cao hơn đáng kể ở bệnh nhân ung thư phổi với độ
nhạy 83,64% và độ đặc hiệu 74%, gợi ý về panel chẩn đoán đối với bệnh nhân
UTPKTBN Trung Quốc [157]. Nghiên cứu tương tự trên 64 bệnh nhân UTPKTBN,
bệnh nhân có ít nhất 4 gen bị methyl hóa đồng thời trong hệ thống 15 gen nghiên
cứu (APC, CHD13, KLK13, DLEC1, RASSF1A, EFEMP1, SFRP1, RAR,
p16INK4A, RUNX3, Hmlh1, DAPK, BRCA1, p14ARF) có tỷ lệ có tỷ lệ sống sót sau
2 năm kém hơn trường hợp bệnh nhân bị methyl hóa dưới 4 gen (13,8 tháng so với
17,8 tháng). Salazar và cs. khẳng định quá trình methyl hóa gen có thể hữu ích trong
việc dự đoán đáp ứng điều trị, cụ thể bệnh nhân có gen CHFR không bị methyl hóa
đáp ứng với thuốc ức chế TKIs tốt hơn so với trường hợp CHFR bị methyl [119].
Bên cạnh methyl hóa quá mức, methyl hóa dưới mức cũng có vai trò nhất định
trong ung thư phổi. Chẳng hạn, các gen H19, IGF2 và MEST bị mất in dấu do
methyl hóa dưới mức được phát hiện ở các tế bào ung thư phổi, làm mất kiểm soát
quá trình tăng trưởng tế bào.
1.4.2.1. Methyl hóa gen EGFR
Bên cạnh những nghiên cứu về đột biến gen, những nghiên cứu về sự methyl
hóa gen EGFR cũng đang nhận được rất nhiều sự quan tâm. Methyl hóa gen EGFR
được tập trung nghiên cứu ở vùng promoter nằm trong khoảng –300 đến –100 tại
đầu 5’ không dịch mã [120]. Sự methyl hóa gen EGFR đã được nghiên cứu trên một
số ung thư như ung thư đại trực tràng, ung thư vú và ung thư đầu và cổ dạng tế bào
vẩy và ung thư phổi [95, 120]. Tế bào phổi bình thường không xảy ra hiện tượng
methyl hóa EGFR, hiện tượng này chỉ xảy ra đối với những tế bào ung thư [95].
Một nghiên cứu trên 54 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ tại Hoa Kỳ cho thấy 11% trường hợp có vùng promoter của gen EGFR bị
methyl hóa [95]. Tuy nhiên, một số công bố tương tự ở bệnh nhân người Trung

36. 22
Quốc lại cho thấy sự methyl hóa EGFR xảy ra khá phổ biến với tỷ lệ 30 - 40% [77,
106].
Hình 1.9. Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR
1.4.2.2. Methyl hóa gen BRCA1
BRCA1 ( Breast cancer – associated gene 1) là một gen ức chế khối u chủ
yếu liên quan đến ung thư vú và ung thư buồng trứng được xác định và tách dòng
lần đầu năm 1994 bởi Miki và cs. [93]. Gen BRCA1chứa 24 exon với dài khoảng
100kb nằm trên cánh dài của NST17 (17q21) và mã hóa cho protein BRCA1 có
chức năng trong sửa chữa DNA và apotosis của tế bào (Hình 1.10) [93].
Hình 1.10. Cấu trúc gen BRCA1 ở người [97].
Trong tế bào bình thường, BRCA1 mã hóa cho một phosphoprotein đóng vai
trò quan trọng trong việc duy trì sự ổn định di truyền, đồng thời nó cũng hoạt động
như một gen ức chế khối u. BRCA1 tham gia điều khiển sự biểu hiện p53, GADD45
đồng thời có vai trò trong quá trình sửa chữa hiện tượng gãy DNA sợi đôi [66].
BRCA1 còn tương tác trực tiếp với phức hợp sửa đổi NST SWI/SNF, với các nhân
tố điều hòa quá trình acetyl hóa hoặc khử acetyl hóa histone, cũng như với các
DNA helicase bao gồm BLM và BACH1 để tham gia vào quá trình điều hòa phiên
mã [133] (Hình 1.11).
Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 được tìm thấy chủ yếu trong ung thư
vú và ung thư buồng trứng. Hiện tượng methyl hóa BRCA1 xảy ra chủ yếu tại đảo
CpG chứa 30 vị trí CpG, nằm từ vị trí –567 đến +44 (Hình 1.10). Các nghiên cứu

37. 23
chỉ ra rằng đảo CpG này vai trò quan trọng trong điều hòa phiên mã và không bị
methyl hóa ở các tế bào bình thường nhưng lại có nhiều biến đổi và trạng thái
methyl trong các tế bào ung thư [116]. Sự methyl hóa BRCA1 trong ung thư vú
được nghiên cứu khá rộng rãi trên thế giới, kết quả cho thấy có sự khác nhau về
mức độ methyl gen này xảy ra với tỷ lệ cao hơn ở người châu Á so với ở các nước
phương tây và châu Úc [155]. Ở Việt Nam, tỷ lệ methyl hóa gen BRCA1 xảy ra ở
58,2% bệnh nhân ung thư vú 18,6% bệnh nhân ung thư buồng trứng [142, 143].
Hình1.11. Chức năng ức chế khối u của BRCA1[125]
Đã có một số nghiên cứu về hiện tương methyl hóa vùng promoter gen
BRCA1 trên ung thư phổi không tế bào nhỏ. Nghiên cứu đầu tiên được tiến hành tại
Hòa Kỳ năm 2004 với 158 bệnh nhân, kết quả cho thấy chỉ có 4% trường hợp được
phát hiện có sự methyl hóa gen này [89]. Những nghiên cứu sau đó trên bệnh nhân
người Đài Loan và Trung Quốc cho thấy hiện tượng methyl hóa BRCA1 xảy ra khá
phổ biến ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bảo nhỏ ở bệnh nhân Châu Á với tỷ lệ
30% và 27% [40, 73]. Không những vậy, methyl hóa quá mức BRCA1 trong ung
thư phổi cho thấy sự tiên lượng xấu cho bệnh nhân [40].
1.4.2.3. Methyl hóa gen MLH1
Gen MLH1 (human mutL homolog 1) nằm ở vị trí 3p22.2 trên nhiễm sắc thể
số 3 bao gồm 19 exon với kích thước khoảng 57 kb. Protein in MLH1 chứa 756
acid amin với khối lượng phân tử là 84,6 kDa (Hình 1.12) [24]. MLH1 là một trong

38. 24
sáu thành phần trong phức hợp sửa chữa bắt cặp sai trên DNA bao gồm: MSH2,
MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 và MPS1. Đối với những bắt cặp sai ở một hoặc một
vài nucleotide MLH1 sẽ kết hợp với PMS2/1, MSH2 và MSH6 để loại bỏ trình tự
bắt cặp sai trên một sợi DNA sau đó sợi DNA mới được tổng hợp dựa trên sợi DNA
bổ sung còn lại. Ngược lại đối với những bắt cặp sai của nhiều nucleotide, MLH1 sẽ
kết hợp với PMS2/1, MSH2 và MSH3 để tạo thành phức hợp sữa chữa (Hình1.13)
[90].
Hình1.12. Cấu trúc gen MLH1 [24].
Hình1.13. Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1 [90].
Đột biến tế bào mầm gen MLH1 có liên quan đến hội chứng Lynch trong ung
thư đại trực tràng với tần suất khoảng 37% [154]. Ngoài ra methyl hóa vùng

39. 25
promoter gen MHL1 cũng được phát hiện khá phổ biến trong ung thư đại tràng với
tỷ lệ khoảng 18% [78]. Không những vậy, đột biến tế bào mầm MLH1 và methyl
hóa quá mức MLH1 được phát hiện đồng thời ở những bệnh nhân ung thư đại trực
tràng. Ngoài ra, methyl hóa quá mức MLH1 được quan sát ở một số ung thư khác
như: Ung thư phổi và ung thư dạ dày [123].
Methyl hóa MLH1 trong ung thư phổi được nghiên cứu khá phổ biến, với tỷ
lệ nằm trong khoảng từ 0 – 58% [23]. Một nghiên cứu trên 72 người Châu Âu vào
năm 2006 không phát hiện sự methyl hóa MLH1 trên bất kỳ bệnh nhân nào [137].
Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác trên bệnh nhân ung thư phổi tại Trung Quốc lại
cho thấy tỷ lệ methyl khá cao của gen MLH1, đạt 35 – 56% [123, 148]. Ngoài ra,
Seng T.J. và cs. (2008) so sánh tỷ lệ sống sót của bệnh nhân bị methyl hóa và không
methyl hóa MLH1 cho thấy những bệnh nhân mang gen MLH1 bị methyl hóa có
tiên lượng xấu và có thời gian sống sót thấp hơn nhóm không methyl hóa [110].
1.4.2.4. Methyl hóa gen MGMT
MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase) là một protein duy nhất
có khả năng sửa chữa DNA có gắn các chất gây ung thư và tự bất hoạt. Trình tự gen
MGMT được nhân bản lần đầu tiên vào năm 1988. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể
10 ở vị trí 10q26, bao gồm 5 exon và 4 intron và kéo dài hơn 300 kb (Hình 1.14).
Protein MGMT có chiều dài 207 axit amin và được bảo tồn thông qua quá trình tiến
hóa [126, 127]. MGMT tham gia vào nhiều con đường sửa chữa sai hỏng DNA
trong tế bào, thông qua việc loại bỏ các nhóm Alkyl gắn vào Guanine. Trong trường
hợp không có sự có mặt của MGMT, O6-meG chưa được chỉnh sửa có thể kết hợp
với Cytosine hoặc Thymine dẫn đến lỗi bắt cặp sai O6-meG/T (Hình 1.15). Thiếu
hụt MGMT do sự methyl hóa quá mức thường được quan sát thấy trong ung thư
biểu mô đại trực tràng, u thần kinh đệm, ung thư phổi không tế bào nhỏ, u lympho
và ung thư biểu mô cổ và đầu. Trong ung thư đại trực tràng, sự bất hoạt MGMT là
một sự kiện sớm liên quan đến phát sinh đột biến. Hiện tượng methyl hóa promoter
MGMT được phát hiện ở khoảng 45% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
(GBM-Glioblastoma), liên quan đến việc tăng độ nhạy cảm với TMZ và kéo dài
thời gian sống thêm của bệnh nhân [28].

40. 26
Hình1.14. Cấu trúc gen MGMT [30].
Methyl hóa vùng promoter MGMT đã được quan sát trong ung thư phổi, tuy
nhiên tình trạng methyl hóa MGMT cho thấy sự khác nhau giữa các báo cáo (8 –
50%) [113]. Một nghiên cứu trên bệnh nhân Hàn Quốc cho thấy tỷ lệ methyl
MGMT là 17% [69]. Trong khi đó, kết quả phân tích trên bệnh nhân người Trung
Quốc có tỷ lệ methyl hóa gen này cao hơn khá nhiều 30 – 50% [83, 151]. Đồng
thời, methyl hóa MGMT ở những bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn I-III và những
bệnh nhân trẻ tuổi cho thấy tiên lượng xấu trong quá trình tiến triển của ung thư
phổi [14].
Hình 1.15. Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT [100].

41. 27
1.4.2.5. Methyl hóa gen RASSF1A
RASSF1A (Ras association domain-containing protein 1A) là một trong 8
đồng phân của gen RASSF1 bao gồm RASSF1A, RASSF1B, RASSF1C, RASSF1D,
RASSF1E, RASSF1F, RASSF1G, RASSF1H. RASSF1 nằm ở vị trí 3p21.3 trên
nhiễm sắc thế số 3 và có kích thước khoảng 11 kb bao gồm 8 exon [87]. RASSF1A
bao gồm các exon 1α, 2αβ, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho chuỗi polypeptide ngắn với 340
axit amin có trọng lượng phân tử là 38,8 kDa (Hình 1.16) [87] (Hình 1.16).
Hình 1.16. Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân [87].
RASSF1A là một gen ức chế khối u tham gia vào con đường điều hòa sự phát
triển và chết theo chương trình của tế bào (Hình 1.16) [87]. RASSF1A tham gia
tổng hợp thoi vô sắc và có thể gây kìm hãm chu kì tế bào bằng cách tác động đến
protein Rb (Retinoblastoma protein). RASSF1A ức chế quá trình tích lũy cyclin D1
điều khiển sự phosphoryl hóa Rb và kiểm soát chương trình chết tự nhiên của tế bào
từ pha G1. Nhờ vậy RASSF1A có thể ức chế chu kỳ tế bào ở điểm chuyển đổi G1/S
[87]. Ngoài ra, RASSF1A có thể kết hợp với serine/threonine kinase MST1
(mammalian sterile twenty - like protein) để điều khiển Ras theo con đường chết
theo chương trình [2]. RASSF1A còn được chứng minh có khả năng ức chế sự xâm
lấn và di căn của những dòng tế bào ung thư phổi thông qua sự ức chế protein YAP
(Yes-associated protein) [26].

42. 28
Methyl hóa quá mức gen RASSF1A xảy ra chủ yếu ở đảo CpG – A gồm 48 vị
trí CpG nằm ở vùng promoter và exon 1 [87]. Hiện tượng methyl hóa RASSF1A
được phát hiện ở rất nhiều ung thư khác nhau như: U nguyên bào thần kinh, ung thư
biểu mô tuyến giáp, ung thư gan, tụy, tuyến thượng thận … và đặc biệt phổ biến ở
ung thư đường tiêu hóa [87]. Tuy nhiên, mức độ methyl hóa gen RASSF1A không
cho thấy sự tương đồng trong các dạng ung thư khác nhau của đường tiêu hóa. Tỷ lệ
methyl hóa gen này trong ung thư biểu mô tế bào gan là 78% trong khi ở u nguyên
bào gan chỉ có 34,6% trường hợp. Tương tự, tỷ lệ methyl hóa RASSF1A trong các
dạng ung thư đường tiêu hòa khác lần lượt là: Ung thư biểu mô tế bào vảy thực
quản 50%, ung thư tuyến tụy tuyến tụy 54%, u nội tiết tụy 75%, ung thư biểu mô
đại trực tràng 35,6% và dạ dày 31% [87].
Hình 1.17. Chức năng ức chế khối u của RASSF1A [25].
Methyl hóa RASSF1A đã được nghiên cứu khá rộng rãi và trở thành dấu
chuẩn trong chẩn đoán và điều trị ung thư phổi. Tỷ lệ methyl hóa RASSF1A trong
các nghiên cứu khác nhau từ 20 – 80% [146]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra methyl
hóa RASSF1A có tiên lượng xấu đối với bệnh nhân ung thư phổi. Những bệnh nhân
mang gen RASSF1A bị methyl hóa có thời gian sống thêm cũng như thời gian sống
không bệnh ngắn hơn so với bệnh nhân không methyl hóa RASSF1A [21,74]. Ngoài
ra, methyl hóa RASSF1A có liên quan đến tiền sử hút thuốc của bệnh nhân. Năm
2011, Yanagawa N. và cs. tiến hành phân tích 62 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến
của phổi, kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa RASSF1A ở nhóm không hút thuốc là

43. 29
34,6% trong khi tỷ lệ này ở nhóm hút thuốc là 61,9% [153]. Nghiên cứu của Lee
S.M. và cs. (2011) cũng cho kết quả tương tự [74]. Vì vậy, hút thuốc lá có thể là
nguyên nhân gây nên sự methyl hóa RASSF1A ở những bệnh nhân ung thư phổi.
1.5. Điều trị đích trong ung thƣ và ung thƣ phổi
1.5.1. Điều trị đích trong ung thư
Ung thư thể rắn ở người gây ra bởi nhiều nguyên nhân bao gồm các thay đổi
di truyền và di truyền ngoại gen. Trong các phương pháp điều trị ung thư, hóa trị
truyền thống đã được chấp thuận từ 60 năm trước. Các thuốc hóa trị nhắm vào các
tế bào ung thư có đặc điểm phân chia rất nhanh, tuy nhiên, những loại thuốc này
cũng nhắm vào một số tế bào bình thường, chẳng hạn như tế bào biểu mô ruột. Với
mục đích chỉ nhắm tới các tế bào, liệu pháp điều trị đích đã được phát triển nhằm
ngăn chặn sự phát triển và di căn của ung thư. Thay vì điều trị trên toàn bộ hệ gen,
liệu pháp điều trị đích tập trung vào những thay đổi phân tử cụ thể giúp mang lại lợi
ích trong điều trị cho nhiều loại ung thư như phổi, đại trực tràng, vú, ung thư hạch
và bệnh bạch cầu [7]. Từ năm 2000, cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ
(FDA) đã phê duyệt hơn 15 liệu pháp điều trị đích trong ung thư. Liệu pháp điều trị
đích được chia thành 3 loại chính: 1) Kháng thể đơn dòng, 2) Chất ức chế phân tử
nhỏ và 3) Độc tố miễn dịch. Mỗi liệu pháp điều trị có ưu và khuyết điểm riêng dựa
trên việc xác định những thay đổi phân tử đặc hiệu ở các tế bào ung thư, do vậy
điều trị hiệu quả hơn và ít gây hại cho mô và tế bào bình thường hơn các phác đồ
điều trị hiện nay.
Những thay đổi bất thường trong hoạt tính kinase là con đường chủ yếu làm
các tế bào bình thường chuyển dạng sang ung thư. Các chất ức chế phân tử nhỏ
cạnh tranh vị trí liên kết của Tyrosine Kinase dẫn tới bất hoạt hoặc kích hoạt ATP.
Các chất này nhắm đến các protein không được kiểm soát hoặc tăng biểu hiện trong
quá trình tiến triển ung thư như BCR-ABL, Akt hay mTOR. Khi các phân tử này
liên kết với đích đặc hiệu, chúng sẽ bất hoạt vùng Tyrosine Kinase, từ đó ngăn chặn
con đường tín hiệu tiếp theo. Các thuốc thuộc dòng này đặc biệt có hiệu quả đối với
bệnh nhân được điều trị kết hợp với phương pháp hóa trị. Hiện nay, hơn 20 đích
kinase khác nhau đã được phát triển trong các thử nghiệm lâm sàng [42].

44. 30
Một trong những cách điều trị đích là tạo ra các kháng thể đơn dòng chống
lại protein đích có vai trò trong quá trình hình thành khối u. Các nhà khoa học đã
phát triển các kháng thể đơn dòng nhắm tới một loạt các protein liên quan đến nhiều
loại ung thư. Ba cơ chế chính phá hủy tế bào ung thư bao gồm: Phá vỡ chức năng
của protein và tín hiệu theo sau; gây độc tính độc lập với kháng thể và độc tính độc
lập với bổ thể [7]. Bên cạnh các phương pháp truyền thống, kháng thể đơn dòng
ngày càng được sử dụng phổ biến trong điều trị ung thư. Liệu pháp này sử dụng rất
nhiều kháng thể được tạo ra bên ngoài cơ thể hơn là những kháng thể do hệ miễn
dịch của bệnh nhân sản xuất ra. Các kháng thể đơn dòng đầu tiên được tạo ra trong
phòng thí nghiệm bằng cách dung hợp tế bào ung thư của chuột (Myeloma) với tế
bào B của chuột hình thành dạng tế bào lai. Tất cả các kháng thể đơn dòng ban đầu
có nguồn gốc từ chuột, tuy nhiên để đảm bảo an toàn và có hiệu quả điều trị cao hơn
trong điều trị ung thư, các kháng thể đơn dòng hiện nay đều có nguồn gốc từ người.
Trong thập kỷ qua, nhiều kháng thể đơn dòng đã được FDA chấp thuận để điều trị
một loạt các bệnh ung thư [7].
Độc tố miễn dịch là một loại thuốc mới bao gồm các yếu tố sinh trưởng và
kháng thể đơn dòng bị biến đổi [1]. Ban đầu, độc tố miễn dịch được tạo ra bằng
cách gắn một độc tố với một protein thông qua liên kết hóa học. Tuy nhiên, hiện
nay với công nghệ DNA tái tổ hợp có thể hình thành các protein dung hợp có độc tố
là vùng bổ sung trên kháng thể hoặc yếu tố sinh trưởng. Độc tố miễn dịch sau khi
gắn với protein bề mặt của tế bào sẽ xâm nhập vào bên trong tế bào, dẫn đến hoạt
động chết theo chương trình của tế bào đích, chẳng hạn như các độc tố bạch hầu
(DT), protein kháng virus (PAP), ngoại độc tố A từ pseudomonas (PE), ricin và
saporin [1].
Giải trình tự thế hệ mới phát hiện ra hơn 50% ung thư ở người mang các đột
biến ảnh hưởng đến trình tự DNA, cấu trúc nhiễm sắc thể. Bên cạnh các thay đổi
liên quan đến trình tự gen, các tế bào u có sự biến đổi di truyền ngoại gen nhằm trốn
thoát hệ thống miễn dịch của cơ thể. Do vậy, nghiên cứu và phát triển các loại thuốc
với mục tiêu là những biến đổi di truyền và di truyền ngoại gen ngày càng được đặc
biệt quan tâm, bao gồm các thuốc liên quan đến đột biến gen, methyl hóa DNA và
biến đổi Histone, đã được thử nghiệm và chấp thuận bởi FDA [62]. Liệu pháp di

45. 31
truyền ngoại gen (chất ức chế DNMT, HDAC) đảo ngược những thay đổi acetyl hóa
Histone và methyl hóa DNA ở bệnh nhân ung thư. Chất ức chế DNMT và HDAC
có tác dụng bổ trợ, có thể tái kích hoạt lại các gen ức chế khối u. Vì vậy, chức năng
bình thường của tế bào được phục hồi [71].
1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi
Những hiểu biết về sinh học phân tử, nguyên nhân và cơ chế phát triển của
ung thư nói chung và ung thư phổi nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc xây
dựng những phác đồ điều trị mới có hiệu quả hơn rất nhiều so với những phương
pháp điều trị truyền thống trước đây cả về khả năng lui bệnh và chất lượng cuộc
sống của bệnh nhân ung thư [55]. EGFR và các đường truyền tín hiệu của nó đóng
vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư. Hai nhóm chính của liệu pháp đích
EGFR đã được phát triển, nhóm đầu tiên là các kháng thể đơn dòng chống lại vùng
ngoại bào của EGFR, với thiết kế nhằm ức chế phần gắn phối tử hoặc có vai trò
trung gian giảm mức độ biểu hiện [51]. Lớp thứ hai bao gồm các chất ức chế
Tyrosine Kinase (TKIs), ngăn chặn truyền tín hiệu (Hình 1.18) [17]. TKIs là những
chất ức chế sự hoạt hóa phân tử EGFR được phát triển dựa trên những hiểu biết về
đột biến gen trong ung thư phổi [55, 139]. TKIs gắn vào vị trí bám ATP của phân tử
EGFR làm cho phân tử này không thể hoạt hóa và làm cho những con đường truyền
tín hiệu qua EGFR không hoạt động. Sự bất hoạt phân tử EGFR làm cho tế bào mất
khả năng phân chia, giảm khả năng sống sót và đi vào con đường chết theo chương
trình [68]. Trong những đột biến gen EGFR đã biết hầu hết những đột biến có sự
đáp ứng tốt với TKIs (trừ đột biến thay thế T790M, S768I, đột biến thêm đoạn ở
exon 20) trong đó đột biến mất đoạn ở exon 19 và thay thế L858R ở exon 21 của
gen EGFR được nghiên cứu và thử nghiệm nhiều nhất. Có nhiều công trình nghiên
cứu đã công bố về hiệu quả sự dụng của TKIs đối với bệnh nhân ung thư phổi [55,
68, 139]. Những nghiên cứu này đã chỉ ra được sự cải thiện đáng kể về tỷ lệ đáp
ứng điều trị, thời gian tái phát u và thời gian sống thêm ở những bệnh nhân mang
đột biến này được sử dụng TKIs so với bệnh nhân không sử dụng thuốc và bệnh
nhân không mang đột biến [55, 68].
Hiện nay, FDA đã chấp thuận các kháng thể đơn dòng EGFR bao gồm
Cetuximab (Erbitux) và Panitumumab (Vectibix); các chất ức chế TKIs như

46. 32
Erlotinib (Tarceva), Gefitinib (Iressa) và Lapatinib (Tykerb). Trong đó, Gefitinib và
Erlotinib được cấp phép trong điều trị ung thư phổi [94]. Gefitinib là thế hệ thuốc
đích đầu tiên được sử dụng cho các trường hợp ung thư phổi không tế bào nhỏ di
căn có mang đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến thay thế L858R ở exon 21
gen EGFR, hai đột biến này chiếm khoảng 90% đột biến EGFR kích hoạt đã biết
[131]. Tuy nhiên, các khối u dương tính với đột biến EGFR có thể kháng với chất
ức chế EGFR, do đó sàng lọc các dấu ấn sinh học có khả năng dự đoán tính nhạy
cảm với liệu pháp đích EGFR được đặc biệt quan tâm. Phản ứng với liệu pháp
kháng EGFR có thể bị biến đổi bởi đột biến EGFR dạng soma, khuếch đại gen
EGFR, tăng các thể gắn EGFR tự do, và đột biến trong các protein của con đường
truyền tín hiệu EGFR, bao gồm ERBB2, K-RAS, B-RAF, PI3KCA, PTEN và BIM
[9]. Chẳng hạn, biểu hiện quá mức protein EGFR được chứng minh là không tương
quan trong đáp ứng với các chất ức chế EGFR [16].
Hình 1.18. Điều trị đích trong ung thư phổi [138].

47. 33
Ngoài thử thách trong phát triển các dấu ấn sinh học nhằm dự đoán phản ứng
nhạy hoặc kháng thuốc khi điều trị liệu pháp kháng EGFR, một thách thức hiện nay
là thời gian đáp ứng thường bị hạn chế và nhiều khối u luôn phát triển kháng thuốc
[9]. Các đột biến EGFR thứ cấp có thể xảy ra sau khi điều trị TKIs, ví dụ đột biến
T790M là dạng kháng thuốc phổ biến nhất đối với TKIs [158]. TKIs thế hệ thứ ba
đang được phát triển để nhắm tới T790M, bao gồm Brigatinib, HM61713,
Osimertinib và Rociletinib. Ngoài đột biến T790M, các đột biến thứ cấp trong con
đường truyền tín hiệu EGFR như đột biến KRAS, PI3K cũng ảnh hưởng đến hiệu
quả của liệu pháp đích EGFR. Ức chế EGFR chủ yếu giữ chu kỳ tế bào ở G1, ngăn
cản quá trình tổng hợp DNA, tăng sinh tế bào. Thông thường, các TKIs được sử
dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với hóa trị hoặc xạ trị liều cao [131].
1.6. Phƣơng pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thƣ phổi
1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi
Sinh học phân tử cung cấp các thông tin chi tiết về đặc tính di truyền ở
người, phát triển và ngày càng hoàn thiện phân tích dựa trên DNA/RNA nhằm kiểm
soát bệnh lý ở người. Trong ung thư, phát hiện đột biến gen gặp một vài hạn chế.
Thứ nhất, tế bào bình thường (tế bào lành) không mang những biến đổi trên gen; vì
vậy phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm cần đảm bảo độ chính xác để toàn bộ bệnh
phẩm đều là các tế bào ác tính, không lẫn tế bào lành. Thứ hai, không phải tất cả các
tế bào ác tính đều mang đột biến gen. Với những hạn chế này, phương pháp phát
hiện đột biến gen phải có độ nhạy cao để phát hiện được các đột biến ngay cả khi nó
xuất hiện ở mức thấp trong mẫu bệnh phẩm. Nhiều cách thức tiếp cận khác nhau
được sử dụng trong xác định các đột biến gen đã biết, mỗi phương pháp đều có
những ưu điểm và nhược điểm khác biệt, thông thường bắt đầu với phản ứng chuỗi
trùng hợp (PCR) (Hình1.19) [86]. Vào những năm 1980, Mullis giới thiệu một
phương pháp khuếch đại đoạn DNA thành một số lượng lớn chỉ trong vài giờ; được
gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), là một thành tựu tiêu biểu trong sinh học
phân tử [98]. Một vài dạng PCR được ứng dụng phổ biến hiện nay như PCR phiên
mã ngược (Reverse transcriptase PCR), Multiplex PCR, Nested PCR, Scorpion-arm
RT-PCR (ARMS-PCR), Real time PCR...[94].
Giải trình tự gen trực tiếp (Sanger sequencing) là kỹ thuật mang tính kinh tế,
dễ triển khai nhất nhưng độ nhạy thấp nhất (có thể phát hiện đột biến khi lượng tế
bào mang đột biến phải lớn hơn 20% tổng số tế bào). Để đảm bảo lượng tế bào ác
tính, kỹ thuật này yêu cầu sự trợ giúp từ các nhà giải phẫu bệnh với mục đích

48. 34
khoanh vùng khu vực bệnh phẩm có tế bào ác tính trước khi tiến hành tách DNA để
phát hiện đột biến [37].
Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển
thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Realtime PCR có độ nhạy khá cao, có
thể phát hiện được đột biến khi tế bào ác tính mang đột biến ở mức trên 1% tổng số
tế bào. Trong các phương pháp Realtime PCR, SYBR green được sử dụng đầu tiên
với ưu điểm đơn giản, dễ thao tác, chỉ liên kết với mạch kép DNA [5]. Tuy nhiên,
SYBR green có nhược điểm quan trọng đó là tín hiệu huỳnh quang phát ra không
cao và có thể ức chế phản ứng PCR. Do đó, Realtime sử dụng SYBR green làm chất
phát huỳnh quang không thể ứng dụng trong Multiplex realtime PCR, realtime PCR
phát hiện các SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Để khắc phục nhược điểm
này, hệ màu HRM (High Resolution Melting dye) đã được phát triển và thay thế.
Ưu điểm vượt trội của hệ màu HRM là khả năng phân biệt được sự khác biệt với 1
nucleotide do hệ màu HRM không ức chế PCR và cường độ phát huỳnh quang của
một phân tử màu HRM khi chèn vào mạch đôi DNA có thể tăng 250 lần so với khi
tự do trong dung dịch. Với realtime PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang,
tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu xác định SNP hay định genotype có thể sử dụng
Taqman probe hoặc probe lai (FRET) (Hình 1.19) [63].
Kỹ thuật lai DNA tại chỗ (In stitu Hybridiration) cho phép xác định vị trí của
trình tự DNA đặc biệt trên nhiễm sắc thể. Thí nghiệm lai tại chỗ lần điều tiên được
tiến hành vào năm 1969 với các đầu dò là các DNA gắn phóng xạ, sau đó đầu dò
huỳnh quang ra đời và nhanh chóng thay thế các đoạn DNA phóng xạ. Cho đến nay
kỹ thuật lại tại chỗ huỳnh quang đã được cải thiện rất nhiều về độ nhạy và độ đặc
hiệu. Ngoài lai tại chỗ huỳnh quang, lai tại chỗ sử dụng enzyme cũng được ra đời
nhằm cải thiện nhược điểm của đầu do huỳnh quang với thời gian tồn tại của tín
nhiệu ngắn và có thể sử dụng kính hiển vi quang học thay vì kính hiển vi huỳnh
quang (Hình 1.19) [36]. Vi dãy DNA được sử dụng để phát hiện nhiều đột biến.
Trong công nghệ này, các đích DNA khác nhau ở dạng mạch đơn sẽ được cố định
lên một bề mặt rắn (chip). Mặt khác, DNA mẫu hoặc cDNA được gắn huỳnh quang
được lai với chip. Sau đó sử dụng một hệ thống laser, tín hiệu huỳnh quang được

49. 35
kiểm tra; các trình tự và số lượng trình tự quan tâm trong mẫu nghiên cứu được xác
định [36].
Hình 1.19. Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen [36].
Bên cạnh những đột biến đã được nghiên cứu, với những đột biến mới,
phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) cho phép sàng lọc đơn giản và hiệu
quả các đột biến như thay thế nucleotide, mất đoạn ngắn, thêm đoạn hoặc đảo đoạn
có kích thước nhỏ. Nguyên tắc của kỹ thuật đó là 2 mạch DNA trong đó 1 mạch
mang đột biến và mạch còn lại bình thường sẽ có độ di động khác nhau trong quá
trình điện di [64]. Khoảng 80 – 90% đột biến điểm tiềm năng có thể được phát hiện
bởi kỹ thuật SSCP. Trong những năm gần đây, công nghệ mới cho giải trình tự
DNA với quy mô lớn được gọi là giải trình tự thế hệ tiếp mới (NGS). Ưu điểm nổi
trội của kỹ thuật này cho phép định tính và định lượng toàn hệ gen trong thời gian
vài ngày [121].
1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi
Hiện nay, ba phương pháp được sử dụng để phân tích methyl hóa DNA trên
toàn bộ hệ gen hoặc từng gen đặc hiệu. Thứ nhất là phương pháp kết tủa miễn dịch
sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận biết trình tự methyl hóa. Thứ hai là sử dụng các
enzyme giới hạn nhạy cảm với trình tự methyl hóa/không methyl hóa, dẫn đến cắt
hoặc không cắt các trình tự này. Cuối cùng là các kỹ thuật dựa trên DNA đã xử lý
bisulfite, trong đó Cytosine không bị methyl sau quá trình xử lý biến đổi thành

50. 36
Uracil và Cytosine bị methyl được giữ nguyên sau quá trình này (Hình 1.20) [129].
Với đặc điểm phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển như Việt Nam, phát
triển các kỹ thuật phân tích định tính và định lượng methyl hóa từng gen đặc hiệu
đối với từng loại ung thư được đặc biệt quan tâm.
Hình 1.20. Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA [52].
PCR đặc hiệu methyl (Methyl specific PCR, MS-PCR) là kỹ thuật đơn giản,
độ nhạy cao, cho phép phát hiện 1 alen methyl hóa trên 1000 alen không methyl hóa
với nguyên tắc DNA xử lý bisulfite được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR sử
dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế trên vùng giàu CpG, cho phép khuếch đại trình
tự DNA methyl hóa hoặc DNA không methyl hóa [129, 156]. Như vậy, MS-PCR
cho phép đánh giá trình tự quan tâm là đồng hợp methyl hóa hay không methyl hóa
(chỉ thu được sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho DNA meythyl hay không
methyl hóa), và dị hợp methyl hóa (thu được đồng thời cả sản phẩm khuếch đại với
cặp mồi methyl hóa và không methyl hóa). Tuy nhiên, nhược điểm của phương
pháp này đó là không đánh giá được mức độ methyl hóa vùng trình tự nằm giữa các
vị trí thiết kế mồi đặc hiệu [156]. Để khắc phục điểm yếu này, các kỹ thuật định
lượng methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite được phát triển và hoàn thiện.
Giải trình tự bisulfite (Bisulfite sequencing) là tiêu chuẩn vàng cho phép đánh giá
methyl hóa ở từng vị trí CpG trong sản phẩm khuếch đại từ khuôn DNA đã xử lý
bisulfite, nhưng không phù hợp khi tiến hành phân tích trên số lượng mẫu nghiên
cứu lớn [38].