2. SOUTHERN BLOTTING
Teknik ini dikembangkan oleh EM Southern pada
tahun 1975.
Southern blot digunakan untuk mendeteksi
keberadaan suatu bagian tertentu dari DNA dalam
sampel.
DNA terdeteksi dapat menjadi sebuah gen tunggal,
atau dapat menjadi bagian dari bagian yang lebih
besar dari DNA seperti genom virus.
Kunci dari metode ini adalah hibridisasi.
Hibridisasi-proses pembentukan molekul DNA
beruntai ganda antara probe DNA beruntai tunggal
dan DNA beruntai tunggal sasaran pasien.
3. PRINCIPLE
1. Campuran molekul dipisahkan.
2. Molekul-molekul yang bergerak pada matriks.
3. Probe ditambahkan ke matriks untuk mengikat
molekul.
4. Setiap probe terikat kemudian dihapus.
5. Tempat di mana probe dihubungkan sesuai dengan
lokasi dari molekul target bergerak.
5. Steps in southern blotting
1. DNA dicerna dengan
pembatasan endonuklease.
Tinggi berat molekul DNA
dicerna menjadi fragmen-
framen yang lebuh kecil.DNA
dicerna dengan pembatasan
endonuklease. Tinggi berat
molekul DNA dicerna
menjadi fragmen-framen
yang lebih kecil.
2. DNA ini kemudian dipisahkan
oleh ukuran dengan elektroforesis
pada gel agarosa.
6. CONT…….
3. Selembar membran nilon atau
nitroselulosa (ungu) ditempatkan di atas
gel agarosa dalam larutan buffer. Ini
dianggap sebagai blotting atau
mentransfer panggung.
Tekanan diberikan secara merata ke gel
baik menggunakan sedotan atau dengan
menempatkan tumpukan kertas handuk
dan berat di atasmembran dan gel untuk
memastikan bahkan kontak antara gel
dan membran. Buffer transfer oleh
kapiler dari wilayah potensi air yang
tinggi kepada daerah potensial air
rendah (biasanya kertas filter dan kertas
tisu) yang kemudian digunakan untuk
memindahkan DNAdari gel ke
membran. Membran bermuatan positif
(ungu) biasanya digunakan yang
memungkinkan DNA untuk mengikat
dengan afinitas tinggi untuk ion
membrane melalui interaksi
antarabermuatan negatif DNA dan
membrane bermuatan positif.
7. CONT…….
4. Nitroselulosa membran
dipanggang oleh paparan
suhu tinggi (60-100° C).
Membran nilon terpapar
radiasi UV. Langkah-langkah
ini digunakan untuk
memastikan permanen dan
kovalen crosslink DNA hadir
dalam band ke membrane.
8. 5. Membran dihadapkan pada
radiolabeled probe.Probe ini beruntai
tunggal fragmen DNA yang memiliki
urutan minat Anda yang ingin Anda
mendeteksi. Probe ini diinkubasi
dengan membrane dan
diperbolehkan berhibridasi dengan
DNA pada membrane. Probe biasanya
radiolabeled sehingga mereka
dapat dideteksi pada film, namun
baru juga digunakan probe yang non-
radioaktif seperti neon atau
chromogenic pewarna. Setelah
hibridasi, kelebihan terikat probe
dicuci jauh dari membran,
meninggalkan probe terikat secara
khusus.
6. Pola hibridisasi dideteksi oleh
visualisasi pada film sinar-X oleh
autoradiografi dalam kasus radioaktif
atau fluorescent probe, atau
perkembangan warna pada membran
jika metode deteksi chromogenic
dimanfaatkan.
CONT…….
