Dokumen tersebut membahas tentang metode sekuensing DNA yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida pada DNA dengan menjelaskan prinsip dasar, bahan-bahan, dan dua metode utama yaitu metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger."

1. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
SEKUENSING
KELOMPOK 2
1. M. AMAR NAUFA
2. SINTA NURUL C
3. ANGGI KRISDIANTO
4. DEWI AYU MARYATI
5. DWI RAHMAWATI
6. ANIS AFIFAH
7. CITRA FARADINA
8. ANGGIH RETNO P
Anggota :

2. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
• DNA merupakan asam nukleat yang menyimpan
informasi genetic setiap makhluk hidup yang
menentukan beberapa sifat dan diturunkan kepada
keturunannnya
• DNA dapat mereplikasi membentuk salinannya
sendiri dan setiap untainya berisi atas unit berulang
yang disebut nukleotida
DNA

3. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
Metode Penentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada
sepotong DNA.
PENGERTIAN SEKUENSING
Urutan Basa
Nukleotida
Urutan Asam
Amino
Struktur protein
dan fungsinya
Perubahan
Sequencing DNA
Perubahan
Protein
Protein non
fungsional

4. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
PRINSIP DASAR SEKUENSING DNA
DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya.
DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template)
Kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR
Ada penambahan beberapa pereaksi tertentu seperti buffer, dNTPs dan ddNTP. Proses ini
dinamakan cycle sequencing

5. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
Bahan -Bahan Fungsi
DNA Template / DNA Stand Sebagai cetakan DNA
DNA Primer Beberapa pasang basa pada DNA
DNA Polimerase I Enzim yang merepikasi DNA, berfungsi
memperpanjang
dNTP Bahan pembentuk sintesis DNA
ddNTPs (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) Menghentikan reaksi pemanjangan untai DNA atau
sintesis DNA
KOMPONEN SEKUENSING DNA

6. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
MACAM
SEKUENSING
Metode Maxam Gilbert
(Reaksi Kimia)
Metode Sanger
(Reaksi Enzimatik)

7. Metode Maxam Gilbert
(Reaksi Kimia)
 Metode pengakhiran rantai (chain termination) dan
degradasi kimia.
 Didasarkan pada pembelahan nukleotida oleh bahan
kimia yang spesifik.
 tidak memerlukan DNA untai ganda sehingga tidak
memerlukan primer untuk mensintesi untai baru
kembali.
 Pemotongan DNA terjadi secara kimia sehingga
reagen kimia tertentu harus ditambahkan kedalam
sistem reaksi.

8. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
 Sekuen molekul DNA untai ganda yang akan digunakan dipotong bagian posisi ikatan antara fosfat dan
guladeoksiribosa menggunakan piperidin
 Fragmen DNA diberi label pada salah satu ujungnya atau pada nukleotida 3’ menggunakan fosfat radioaktif
 Basa dimodifikasi dengan spesifik menggunakan bahan kimia tertentu.
a. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G c. Hidrazin akan menghidrolisis C dan T
b. Asam format menyerang A dan G D. Hidrazin, piperidin dan garam bekerja pada C
 Kemudian akan diperoleh empat fragmen yang berbeda masing- masing ujungnya adalah G, A atau G, C
atau T dan C.
 Dilihat laju migrasi masing-masing fragmen dalam bentuk pita. Dengan cara membandingkan lajur pertama
dan kedua, serta lajur ketiga dengan keempat.
 Diurutkan berdasarkan lajur migrasinya dari yang terkecil ke yang besar.
TAHAPAN METODE MAXAM GILBERT

9. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro

10. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro

11. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
Kelebihan Kekurangan
Dapat digunakan baik untuk DNA ganda maupun
tunggal
Memiliki Tekhnik yang Rumit
Menghasilkan fragmen yang bermacam-macam Menggunakan Bahan Kimia yang berbahaya seperti
hydrazine yang bersifat neurotoxin
Kesulitan dalam Scale-up
KELEBIHAN & KEKURANGAN METODE MAXAM GILBERT

12. Metode Sanger
(Reaksi Enzimatis)
 melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung
terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang
dibutuhkan.
 Menggunakan dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs)
yang memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa.
Yang normal memiliki OH pada deoxynucleotide
triphosphates (dNTPs).
 Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam
reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan
bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti
karena 3’OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida
berikutnya tidak ada

13. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
1. DNA utas sebagai template DNA
2. Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi
sebagai starting point untuk replikasi
3. DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari
template
4. Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)
6.Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy nukleotida
diambil (dipasangkan).
7. Penambahan dideoxynukeotida menyebabkan reaksi berhenti. Khusus untuk ddNTP, yang
ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang
ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
8. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama
elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan
TAHAPAN METODE SANGER

14. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro

15. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
FAKTOR PENENTU SEKUENSING DNA
Ekstraksi DNA Untuk sekuensing DNA
Sekuensing menggunakan Dye Terminator
Sekuensing Dengan bahan Kimia
Sekuensing menggunakan Dye primers

16. Rekayasa Genetika I Universitas Diponegoro
APLIKASI SEKUENSING DNA
Untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA
lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA
lain yang sudah diketahui
Sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan
mengembangkan pengobatan penyakit genetik
Contoh :

17. TERIMAKASIH