Teknik southern blot, northern blot, dan western blot memungkinkan deteksi DNA, RNA, dan protein secara spesifik. Southern blot melibatkan pemotongan DNA, elektroforesis, transfer ke membran, hibridisasi dengan probe DNA, dan deteksi. Northern blot melibatkan isolasi RNA, elektroforesis, transfer ke membran nilon, hibridisasi dengan probe RNA, dan deteksi. Western blot melibatkan transfer protein dari gel ke membran untuk deteksi ekspresi protein menggunakan antibodi.

1. DNA SEKENSING DAN HIBRIDISASI
REKAYASA GENETIKA

2. PENDAHULUAN
Blot/Blotting
Teknik memindahkan atau
mentransfer DNA, RNA, atau
Protein ke lembaran tipis atau
matriks membran.
1. Southern blot
2.Nothern blot
3.Western blot

3. PENGERTIAN DAN SEJARAH SOUTHERN
BLOT
Southern blot
Sebuah metode yang sering
digunakan dalam bidang biologi
molekular untuk menguji
keberadaan dari suatu sekuen DNA
dalam suatu sampel DNA.

4. KOMPONEN-KOMPONEN DALAM
SOUTHERN BLOT
Membran
nitroselulosa
Tempat hasil jiplakan
fragmen DNA
DNA Probe

5. Larutan Buffer
Membawa DNA dari gel
dan mengimobilisasi
DNA pada membran
DNA
Materi atau molekul yang
akan diidentifikasi pada
teknik southern blot
Enzim restriksi Memotong DNA menjadi
fragmen tertentu

6. TAHAPAN SOUTHERN BLOT

7. Isolasi dan
pemotongan DNA
Fragmentasi DNA
dengan elektroforesis
Transfer DNA ke
membran
Hibridisasi DNA
Deteksi DNA

8. Isolasi dan pemotongan
DNA
Tahap untuk
memperoleh DNA yang
dideteksi. Pemotongan
DNA yang diinginkan
menggunakan enzim
restriksi

9. Fragmentasi DNA
dengan elektroforesis
Fragmen-fragmen dari
DNA akan terpisah
berdasarkan ukuran
molekulnya.

10. Denaturasi DNA
 Perendaman gel
 Rusaknya ikatan hidrogen
 DNA single strand

11. Transfer DNA ke membran
Mentransfer DNA yang
diperoleh ke membran
nitroselulosa.

12. Gel agarosa dijiplak pada
membran nitroselulosa
Berdasarkan prinsip kapilaritas
Fragmen DNA yang
telah terjiplak pada
membran
nitroselulosa
dipanaskan pada
suhu 600C dan
diberikan radiasi
UV.

13. Hibridisasi DNA
 Pembentukan molekul double helix
 Membran nitroselulosa direndam dalam
larutan yang berisi probe DNA Ss

14. Deteksi DNA
 Tahap lanjutan hibridisasi DNA menggunakan
probe
 Probe biasanya adalah DNA murni
 Pada tahap deteksi DNA digunakan autoradiogram

15. PENGERTIAN DAN SEJARAH NORTHERN
BLOT
Northern blot
 Secara umum teknik ini mirip dengan southern blot
 Pemisahan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi
pada membran menggunakan probe hibridisasi
dengan urutan basa komplementer untuk semua,
atau sebagian, dari urutan mRNA target

16. KOMPONEN-KOMPONEN DALAM
NORTHERN BLOT
Membran
 Tempat hasil jiplakan
fragmen RNA dari gel
agarosa formaldehid
 Membran nilon
Probe
 Fragmen yang digunakan
untuk hibridisasi asam
nukleat
 Dilengkapi semua, sebagian,
urutan basa komplementer
dari urutan mRNA target.

18. TAHAP-TAHAP NORTHERN BLOT
Isolasi RNA
Elektroforesis
Transfer ke membran dan imobilisasi
Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe
Pencucian
Deteksi

19. Isolasi RNA
 Lisis dilakukan
menggunakan
deterjen
 Pemisahan
pengotor dengan
cara sentrifugasi
 Molekul
nukleotida
dipisahkan dari
protein
 Penggunaan
enzim DNAse
 Dihasilkan
RNA
 Penggunaan
larutan PCI
 Purifikasi RNA

20. Elektroforesis
RNA dielektroforesis
menggunakan gel
agarosa formaldehida

21. Transfer ke membran dan imobilisasi
 RNA ditransfer ke
membran nilon
 Membran nilon bermuatan
positif
 Transfer buffer
mengandung formamida
Setelah RNA ditransfer
ke membran, maka
membran harus segera
disiapkan untuk
crosslink RNA dengan
sinar UV.

22. Prehibridisasi
dan hibridisasi
dengan probe
Memblok bagian
nonspecific untuk
mencegah probe yang
single strand dari
mengikat sembarang
bagian dari membran
 Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa
probe ini melengkapi semua atau sebagian, dari
urutan mRNA target
 Probe harus diberi label baik dengan isotop
radioaktif (32P) atau dengan chemiluminance
dimana alkali fosfatase atau horseradish
peroksidase memecah chemiluminancent substrat
menghasilkan emisi terdeteksi cahaya

24. Pencucian
 Untuk memastikan bahwa probe yelah terikat
secara khusus dan untuk mencegah sinyal balik
yang timbul
 Menghilangkan unhibridisasi probe, dengan
larutan buffer misalnya sodium citrate

25. Deteksi
Jika probe radiolabeled
selesai digunakan, blot
disimpan dalam
bungkus plastik,
kemudian membran di
autoradiografi
Radioaktivitas Non-radioaktif

27. DEFINISI WASTERN BLOT
• Proses pemindahan protein dari gel hasil
elektroforesis ke membran
• Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel
daripada gel sehingga protein yang terblot pada
membran dapat dideteksi dengan cara visual
maupun fluoresensi
• Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi
menggunakan antibodi primer dan antibodi
sekunder

28. TEKNIK WASTERN BLOT