Dokumen ini menjelaskan berbagai metode pembuatan sediaan untuk penelitian di bidang patologi serta langkah-langkah yang diambil untuk mempersiapkan sampel, termasuk metode oles, rentang, pencet, supravital, irisan, dan wholemount. Kelebihan dan kekurangan dari masing-masing metode diuraikan, di samping teknik fiksasi, dehidrasi, dan pengawetan jaringan yang krusial dalam proses mikroskopi. Sediaan apus darah sebagai contoh khusus disebutkan, serta langkah-langkah detail pembuatan dan pewarnaannya agar dapat diapresiasi secara mikroskopis.

1. METODE PEMBUATAN SEDIAAN
KELOMPOK 3:
DIAH
GIFSON
MIKYU
SISCHA

2. SEDIAAN

3. PENGERTIAN SEDIAAN
Pembuatan sediaan adalah tindakan atau
proses pembuatan maupun penyiapan suatu
menjadi media, spesimen patologi maupun
anatomi yang siap dan diawetkan untuk
penelitian dan pemeriksaan
Menurut Shofyatul Yumna Triyana pengertian
sediaan adalah sampel spesimen yang
diletakkan atau dioleskan dipermukaan gelas
objek (object glass) atau slides, dengan atau
tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat
diamati di bawah mikroskop.

4. METODE PEMBUATAN SEDIAAN
1. Metode Oles (Smear Methods)
Adalah suatu pembuatan sediaan dengan
jalan mengoles / membuat selaput (film) dari
substansi yang berupa cairan atau bukan cairan
diatas gelas benda yg bersih dan bebas lemak,
untuk selanjutnya kmd difiksasi, diwarnai dan
ditutup dengan gelas penutup.
Bahan yang sering dibuat sediaan oles :
darah, nanah / jaringan-jaringan tertentu. Cara
ini sangat baik untuk mempelajari : sitologi
darah, sumsum tulang merah, eksudat dari
bermacam-macam jaringan yg meradang.

5. LANJUTAN
2. Metode Rentang (Spread)
Adalah suatu metode pembuatan sediaan
dengan cara merentangkan suatu jaringan pada
permukaan gelas benda sehingga dapat diamati
dengan mikroskop.
Bahan yang dibuat jaringan yang tipis,
misal : pleura, mesenterium, peritoneum,
pericardium, dsb. Dapat diamati tanpa
pewarnaan / dengan pewarnaan Mallory-Acid
Fuchsin : Hematoksilin ; Azure II-Eosin.

6. LANJUTAN
3. Metode Pencet (Squash)
Adalah metode untuk mendapatkan suatu
sediaan dengan cara memencet suatu potongan
jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan
sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis yang
dapat diamati dengan mikroskop. Digunakan untuk
jaringan yang sel-selnya mudah lepas, misal : lien,
sumsum tulang, tumor seluler dll. Diambil ± 1 mm.
Pewarnaan yang digunakan : Larutan
Carmine.

7. LANJUTAN
4. Metode Supravital
Adalah metode untuk mendapatkan sediaan
dari sel / jaringan yang hidup. Zat warna : Janus
Green, Neutral Red, Methylen Blue dengan
konsentrasi tertentu. Bahan : darah, epithelium
mukosa mulut.
5. Metode Irisan
Suatu metode pembuatan sediaan dengan
jalan membuat suatu irisan dengan tebal tertentu
sehingga dapat diamati dengan mikroskop.
Ada 2 macam metode irisan :
- Metode irisan dengan tangan
- Metode irisan dengan mikrotom

8. SEDIAAN UTUH
WHOLEMOUNT

9. PENGERTIAN
Wholemounth merupakan metode pembuatan
preparat yang nantinya akan diamati dengan
mikroskop tanpa didahului adanya proses
pemotongan.
Pada metode ini, preparat yang diamati adalah
preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan,
organ maupun individu.
Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole
mounth ini terlihat dalam wujud utuhnya seperti
ketika organisme tersebut masih hidup sehingga
pengamatan yang dapat dilakukan hanya terbatas
terhadap morfologi secara umum saja.

10. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN
METODE WHOLEMOUNT
Kelebihan metode Wholemount
Dapat mengamati seluruh bagian tanaman
dengan jelas tiap bagian-bagiannya
Kelemahan metode Wholemount
Metode ini hanya bisa dilakukan pada
tanaman dengan ukuran yang kecil saja
tidak bisa tanaman yang besar sehingga
metode ini perlu terus dikembangkan
dengan melakukan bebagai percobaan

11. SEDIAAN UTUH (WHOLEMOUNT)
SEMUT
Tujuan
Membuat sediaan organisme atau bagian
dari organism hewan secara utuh.
Klasifikasi Semut
Kingdom : Animalia
Pillum : Arthropoda
Kelas : Insecta
Ordo : Hymenoptera
Subordo : Apokrita
Superfamil : Vespoidea
Famili : Formicidae
Genus : Formica
Spesies : Formica yessensis

12. ALAT DAN BAHAN
 Alat
1. Pinset
2. Kuas
3. objek gelas
4. bak pewarna
5. Pipet
6. mikroskop
 Bahan
1. Semut
2. etanol 70%
3. alkohol 30%, 50%, 70%,
80%, 95%, 100%
4. minyak cengkeh,
5. xilol 1, xilol 2
6. Eosin
7. formalin 4%
8. Laktofenoldan
9. entellan

13. CARA KERJA
Fiksasi dengan etanol 70% 2x24 jam
Dehidrasi dengan alkohol 80%, 95%, 100%. Masing-
masing 10 menit
Clearing: rendam di dalam minyak cengkeh 5 menit
Direndam dalam xilol 1 dan xilol 2. maasing-masing 5
menit
Diberi entellan
Ditutup dengan kaca penutup, amati dibawah
miksroskop

14. GAMBAR

15. GAMBAR

16. GAMBAR

17. METODE SMEAR
(APUSAN DARAH)

18. DEFINISI
Adalah suatu pembuatan sediaan dengan jalan
mengoles / membuat selaput (film) dari substansi
yang berupa cairan atau bukan cairan diatas gelas
benda yg bersih dan bebas lemak, untuk
selanjutnya kmd difiksasi, diwarnai dan ditutup
dengan gelas penutup.
Bahan yang sering dibuat sediaan oles : darah,
nanah / jaringan-jaringan tertentu. Cara ini sangat
baik untuk mempelajari : sitologi darah, sumsum
tulang merah, eksudat dari bermacam-macam
jaringan yg meradang.

19. PENGERTIAAN
Sediaan apus darah adalah suatu sarana yang
digunakan untuk menilai berbagai unsur sel
darah tepi, seperti eritrosit, leukosit, dan
trombosit. Selain itu dapat pula digunakan
untuk mengidentifikasi adanya parasit seperti
malaria, mikrofilaria, dan lain-lain.
Sediaan apus yang dibuat dan dipulas dengan
baik merupakan syarat mutlak untuk
mendapatkan hasil pemeriksaan yang terbaik
merupaka syarat mutlak untuk mendapatkan
hasil pemeriksaan yang baik.

20. TUJUAN
Mengamati dan menilai berbagai unsur sel
darah pada manusia seperti sel darah merah
(eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan
keping darah (trombosit)
Sediaan apus darah juga dapat digunakan
untuk mengidentifikasi adanya parasit seperti
malaria, microfilaria, dan lain-lain
Untuk mengetahui deskripsi bentuk dari
berbagai sel darah dan menilai persentase sel
darah yang teramati

21. ALAT DAN BAHAN
Alat
1. Objek glass
2. Lanset
3. Alkohol swab
Bahan
1. Darah
2. Pulasan giemsa
3. Alkohol

22. CARA KERJA
1. Pengambilan darah probandus
• Tangan probandus diayunkan terlebih dahulu sebelum
jarinya ditusuk
• Ujung jari dibersihkan dengan kapas yang telah
dibasahi alcohol 70%
• Pegang dan tekan sedikit jari tersebut
• Jarum frankee disetel 3-4 mm
• Jari ditusuk dengan jarum dengan arah tusukan tegak
lurus garis-garis sidik jari dan setelah darah keluar, jari
tidak boleh ditekan-tekan dan diperas. Apabila
menggunakan daun telinga, bagian yang ditusuk bukan
bagian sisi tetapi cukup bagian pinggirnya saja.
• Tetesan darah yang pertama diisap atau dihapus
dengan kapas (tidak digunakan). Tetesan darah
berikutnya digunakan untuk pemeriksaan.

23. LANJUTAN
2. Pembuatan sediaan apus darah
• Menyiapkan dua object glass
• Setetes darah yang berasal dari ujung jari
probandus diletakkan pada ujung object glass
yang pertama.
• Object glass yang kedua diambil dan disentuhkan
salah satu ujungnya pada object glass pertama di
sebelah kiri tetesan darah sehingga kedua ujung
object glass tersebut membentuk sudut 45o ke
kanan.
• Object glass kedua digerakkan ke kanan sehingga
tetesan darah berada disudut antara kedua object
glass dan membentuk garis yang tipis.
• Preparat dikeringkn dan siap diwarnai.

24. LANJUTAN
3. Pewarnaan preparat apus
• Preparat apus yang telah kering difiksir dengan
methanol selama 3-5 menit
• Preparat apus ditetesi dengan larutan Giemsa (9-
10 tetes)dan dibiarkan selama 20-30 menit
• Preparat apus dicuci dalam air mengalir lalu
dikeringkan dalam suhu ruang
4. Pengamatan
• Preparat apus diamati dibawah mikroskop
dengan perbesaran kuat.

25. GAMBAR

26. GAMBAR

27. FIKSASI

28. PENGERTIAN FIKSASI
Fiksasi merupakan suatu proses yang
dilakukan untuk mempertahankan kondisi
jaringan
Fiksasi adalah usaha yang dapat
mempertahankan elemen-elemen sel atau
jaringan agar tetap berada pada tempatnya
dan tidak mengalami perubahan bentuk
maupun ukuran.

29. TUJUAN FIKSASI
Menghentikan proses metabolisme secara
cepat
Mencegah kerusakan jaringan
Mengawetkan komponen-komponen sitologis
dan histologis
Mengeraskan materi-materi yang lembek
sehingga terjadi koagulasi protoplasma
maupun elemen-elemen di dalm protoplasma
Jaringan dpat diwarnai sehingga bagian-
bagian dari jaringan dapat mudah dikenali.

30. BAHAN-BAHAN FIKSASI YANG
DIGUNAKAN
1. Alkohol
2. Asam kromat
3. Asam pikrat
4. Mercuri khlorida
5. Formalin
6. Larutan canoi
7. Larutan zenker
8. Larutan helly
9. Larutan bouin
10.Larutan susa

31. PENGARUH FIKSASI TERHADAP
PEWARNAAN
Cairan fiksasi dapat mempengaruhi reaksi
histokimia karena mengikat bagian reaktif jaringan. Ada
sejumlah faktor yang akan mempengaruhi proses
pengawetan:
1. Dapar
Pengawetan sebaiknya dikerjakan pada pH yang
mendekati netral, 6 – 8. Jaringan hipoksia menurunkan
pH, sehingga harus terdapat kapasitas dapar pada
pengawet untuk mencegah keasaman yang berlebihan.
Keasaman memudahkan terbentuknya pigmen heme-
formalin yang akan muncul sebagai deposit hitam yang
dapat terpolarisasi di jaringan. Dapar umum terdiri atas
fosfat, bikarbonat, kakodilat, dan veronal.

32. LANJUTAN
2. Penetrasi
Penetrasi jaringan bergantung pada kemampuan
difusi masing-masing fiksatif. Formalin dan alkohol
adalah yang terbaik sementara glutaraldehida adalah
terjelek. Merkuri dan yang lainnya berada di antaranya.
Untuk mengatasi ini, jaringan diiris dengan ketipisan 3–
5 mm.
Jaringan yang tipis akan lebih mudah dipenetrasi
daripada jaringan tebal. Untuk pekerjaan rutin, jaringan
dapat dibuat dengan ketebalan hingga 1 cm. Dengan
ketebalan ini, diharapkan cairan fiksasi dapat dengan
cepat memfiksasi seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu
tebal, maka permukaan luarnya saja yang berhasil
difiksasi sedangkan bagian tengahnya dapat membusuk
sebelum cairan fiksasi sempat merembes/menginfiltrasi
ke sana. Untuk mikroskopi elektron, ketebalan irisan
jaringan adalah 1 mm.

33. LANJUTAN
3. Volume Pengawet
Volume pengawet adalah penting.
Sebaiknya, volume pengawet adalah 10 x
volume jaringan yang difiksasi. Besarnya volume
jaringan menentukan volume fiksasi yang
diperlukan sedangkan tebalnya jaringan
menentukan lamanya fiksasi. Panjang dan lebar
jaringan umumnya ditentukan oleh jenis
mikrotom yang digunakan.

34. LANJUTAN
4. Konsentrasi
Konsentrasi pengawet sebaiknya diatur ke
kadar terendah yang mungkin, karena
pertimbangan ekonomis. Konsentrasi formalin
terbaik adalah 10%, sedangkan glutaraldehida
pada 0,25% - 4%. Konsentrasi yang terlalu tinggi
dapat menimbulkan artefak yang sama dengan
panas yang berlebihan.

35. LANJUTAN
5. Interval Waktu
Jaringan yang didapat harus segera
diawetkan. Artefak akan timbul bila jaringan
mengering, sehingga bila belum mendapat
pengawet, rendamlah dalam larutan garam
fisiologis. Semakin lama jaringan menunggu
untuk diawetkan, semakin banyak kehilangan
organel sel dan pengerutan nukleus sehingga
banyak artefak terbentuk.

36. LANJUTAN
6. Suhu
Peningkatan suhu, seperti reaksi kimia
lainnya, akan meningkatkan laju pengawetan. Ini
tidak berarti bahwa anda dibenarkan untuk
merebus jaringan dalam bahan pengawet. Formalin
yang panas akan mengawetkan lebih cepat.
7. Jenis Larutan Pengawet
Jenis larutan fiksasi yang akan digunakan
bergantung pada jenis unsur jaringan yang ingin
didemonstrasikan dan pewarnaan yang akan
dilakukan.

37. MACAM – MACAM LARUTAN FIKSATIF
Larutan fiksatif sederhana
Hanya mengandung satu macam zat saja.
Misal : etanol 70-100% , Formaldehyde 4-10% ,
Asam asetat 0,3-5% , Asam pikrat , asam
Chromiat 0,5-1 % dll.
Larutan Fiksatif Majemuk / campuran
Mengandung lebih dari satu macam zat.
Misal : larutan Bouin (asam pikrat, formalin
dan asam asetat glasial) , Larutan Zenker (merkuri
chlorida, potassium dichromate, aquadest) dll.
Larutan Zenker : Nuklei dan jaringan pengikat
sangat terpulas baik terutama jaringan tumor.

38. DEHIDRASI

39. PENGERTIAN
Dehidrasi adalah proses penarikan air dari
dalam jaringan dengan menggunakan bahan-
bahan kimia tertentu
Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air
dari dalam jaringan yang telah difiksasi
Proses dehidrasi merupakan serangkaian
proses dengan cara memasukan sample ke
dalam larutan dehidrasi secara berseri dari
konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi
dengan mengurai konsentrasi air.

40. CARA DEHIDRASI
Dehidrasi dapat dilakukan dengan empat
cara, yaitu :
1. Penguapan air
Berdasarkan penguapan air, proses
dehidrasi dapat dilakukan dengan pengeringan
dan penganginan
2. perbedaan tekanan osmosis
Berdasarkan tekanan osmotisnya, proses
dehidrasi dapat dilakukan dengan penggulaan
dan penggaraman.

41. LANJUTAN
3. Tekanan
Berdasarkan tekanan osmotisnya, proses dehidrasi
dapat dilakukan dengan penggulaan dan penggaraman.
Tekanan adalah pengurangan kadar air
berdasarkan perbedaan tekanan di dalam bahan pangan
dengan lingkungannya. Berdasarkan tekanan, proses
dehidrasi dapat dilakukan dengan hiperbarik dan
hipobarik.
4. Pengeringan Beku
Pengeringan beku adalah pengurangan kadar air
dengan mengendalikan suhu dan tekanan. Pengeringan
beku menggunakan diagram titik triple yang menjelaskan
hubungan antara tekanan dan suhu lingkungan.
Berdasarkan pengendalian tekanan dan suhu lingkungan,
suatu zat pada titik tripel berada dalam wajud antara
padat, cair dan gas

42. BAHAN YANG DIGUNAKAN UNTUK
DEHIDRASI
• Etanol,
• Alkohol,
• Etil alkohol (secara bertingkat),
• Aseton dengan panas.
Bila menggunakan dioxan maka bisa digunakan
dalam;
• Dioxan 50 % selama 3 jam
• Dioxan murni selama 3 jam
Volume dehidran yang digunakan adalah 10 x
volume jaringan.

43. CLEARING

44. PENGERTIAN
Clearing merupakan proses membuat
potongan jaringan supaya jernih atau
transparan (bila perlu dilakukan
dealkoholisasi).
Proses ini dilakukan setelah dehidrasi selesai.
Senyawa kimia yang digunakan harus dapat
bercampur dengan dehidran, parafin (apabila
akan diproses dengan metode parafin)

45. MACAM-MACAM SENYAWA CLEARING
• Xylol/ xylene: proses cepat, sulit untuk transparan
betul, dan apabila terlalu lama disimpan akan rapuh.
• Toluol/ toluene: proses cepat, hasilnya jernih
menyakinkan, tidak menyebabkan kerasnya jaringan
(kecuali disimpan terlalu lama), dan hanya untuk
potongan jaringan dengan dehidran alkohol absolut.
• Minyak cedar: sedikit mengkerutkan jaringan, dapat
menjernihkan jaringan dengan dehidran alkohol 95 %,
bagus untuk jaringan SNC dan kelenjar limfa, proses
lambat, dan sebelum dimasukkan kedalam parafin
harus dimasukkan dulu ke benzen atau xylol selam ½-1
jam.

46. LANJUTAN
• Chloroform: sedikit mengkerutkan jaringan, dapat
digunakan untuk jaringan-jaringan yang besar,
mahal, dan sulit dipindahkan keparafin (perlu
pengantian parafin murni 3-4 x).
• Minyak cengkeh idem dengan nomer 4.
• Anilin oil (minyak anilin): proses cepat, sedikit
mengkerutkan jaringan, dapat dipindahkan
langsung ke alkohol 70 % dan sukar dipindahkan
ke parafin.
• N-butyl alkohol: baik untuk objek yang keras dan
padat dan prosesnya lama.

47. MOUNTING

48. PENGERTIAN
Mounting merupakan proses penutupan sediaan
mikroskopis
Mounting merupakan perekatan jaringan pada
kaca penutup dengan mempergunakan bahan
perekat (adhesive).
Proses mounting ini menggunakan mounting
media. Mounting media merupakan zat yang
mengisi antara sediaan dengan kaca penutup.
Zat yang dapat digunakan sebagai mounting
diantaranya gliserol dan balsam kanada, tetapi
untuk preparat permanen digunakan balsam
kanad

49. SYARAT UNTUK MOUNTING
Syarat-syarat media untuk mounting
(mountan) harus
Dapat merekatkan irisan jaringan dengan jaringan
dan atau gelas benda dengan gelas penutup.
Mempunyai index refraksi tertentu
Tidak berwarna
Bersifat netral.
Bersifat aquosa dan non aquosa:
• Aquosa : untuk sediaan lemak, eg. medium
farrant, medium glychrogel
• Non aquosa: eg. clearmount, crystalite, DPX,
emexel, flourmount, mountan michrome, SQD.
Balsam, entelan, canada balsam