1. Oleh: Muhamad Rizki
Customer Support Engineer PT Ditek Jaya
Mengupas seputar Problematika HPLC
dalam analisa sehari-hari
Oleh : Muhamad Rizki/ Customer
Support Engineer/081382479839
2. • Solvent Degasser : Menghilangkan
microbubble dari solvent
• HPLC Pompa : Memompa fase
gerak menuju ke sistem HPLC
• Autosampler : Meinjeksi sampel
ke dalam aliran fase gerak
• Kolom : Tempat terjadi nya
pemisahan yaitu sampel campuran
akan berinteraksi dengan fase diam
• Kolom Oven : Tempat menyimpan
kolom, dan menjaga suhu kolom
agar stabil
• Detektor : Mendeteksi analit yang
telah di lakukan pemisahan oleh
kolom dan output sinyal di baca
oleh software menjadi kromatogram
Konfigurasi alat HPLC
3. PROBLEMATIKA HPLC
1. Tekanan Tinggi
2. Fluktuasi tekanan
3. Kebocoran pada HPLC
4. Fluktuasi waktu retensi
5. Fluktuasi pada area
6. Penurunan sensitifitas
7. Kenaikan noise
8. Fluktuasi pada baseline
9. Munculnya Ghost peaks
10. Kerusakan pada bentuk peak
5. Penyebab:
• Penyumbatan pada tubing
• Penyumbatan pada flow cell
• Penyumbatan pada Filter
• Penyumbatan pada Kolom
1. TEKANAN TINGGI
Periksa dimana terjadi penyumbatan flow line mulai dari pompa sampai
ke detektor
Eluent
Pump
Injector
Column Oven
Column
Detector
Note: Ketika pengecekkan lepaskan kolom
CHECKING
Apa yang diperiksa pertama kali?
6. Penyumbatan Pada Tubing
Pasang clogged tubing
langsung ke pump outlet
Penyebab
Kemungkinan besar karena penyumbatan
partikel mikro
Penanganan
Hubungkan ujung selang/tubing yang
tersumbat ke keluaran pompa lalu alirkan
air
Jika perlu gunakan laju alir yang tinggi secara
bertahap
7. Penyumbatan Pada Flow Cell
Penyebab
Kemungkinan besar karena penyumbatan
partikel mikro
Penanganan
Sambungkan inlet dan outlet flowcell
berlawanan arah dan alirkan air dimulai
flow kecil 0,2 ml/min sambil lihat
tekanannya
Connect to OUT port
Connect to IN port
Flow
8. Penyumbatan di Line Filter
Filter (frit) pada pump outlet
- Jika line filter tersumbat (tekanan saat dialirkan air
>0.3mpa) lakukan ultrasonic dengan air, metanol dan
IPA masing-masing 5 menit.
- Melakukan pergantian frit filter/line filter jika sudah
tidak dapat diultrasonic atau setiap 6 bulan sekali.
Filter pada lokasi lain
Filter lain dapat terletak pada
• gradient mixer
• Filter di guard kolom
(Diganti 6 bulan sekali sesuai
pemakaian)
9. Penyumbatan Kolom
Penyebab umum
• Bahan yang tidak terlarut di sampel dan fase gerak
• Penyerapan komponen sampel
• Perubahan struktur, kelarutan dan hancurnya packing
material kolom
Penanganan
• Alirkan dengan larutan pencuci
Hubungkan kolom langsung ke pump outlet
Pilih larutan pembilas yang sesuai dengan instruksi
manual kolom
• Metode lain sesuai dengan instruksi manual kolom
Flush dengan posisi terbaik
Mengganti inlet filter kolom
Pump outlet
11. 2. Fluktuasi Tekanan/Pressure
Adanya gelembung udara masuk pada sistem pompa
Periksa apakah terjadi masalah di bagian pompa (kebocoran dari seal,
Check valve in dan check valve out bermasalah)
Eluent
Pump
Injector
Column Oven
Column
Detector
Apa yang diperiksa pertama kali?
Gelembung udara
Pump rusak
Kebocoran pada Flow
line
12. Kerusakan Pompa
Tindakan 1 - Bilas bagian dalam pompa
• Alirkan air, metanol dan Iso propanol.
Alirkan pompa dengan menghubungkan back
pressure tube
Selalu ganti consumable dan spare part secara
berkala:
- Line filter (6 bulan)
- Plunger seal (1 tahun atau 90 L)
- Check Valve In dan Out (1 tahun)
13. Kerusakan Pompa
13
Tindakan 2 - Ultrasonic dan ganti bagian
part
• Cuci dan sonikasi check valve dengan air,
metanol lalu 2-propanol masing-masing 5
menit
• Pergantian check valve
• Pergantian plunger seal
OUTLET Check Valve
Pump Head
INLET Check Valve
Check
valves
Check valve in dan check valve out diganti
1 tahun sekali)
Plunger
seal
(Plunger seal diganti 1 tahun sekali sesuai
pemakaian)
15. 3. Kebocoran Pada Flow line
Eluent
Pump
Injector
Column Oven
Column
Detector
Apa yang diperiksa pertama kali?
Periksa lokasi kebocoran
Kebocoran dari Injektor
Kebocoran dari pump
head
Kebocoran dari cell
detektor
16. Kebocoran dari Pump Head (1)
• Kejadian
• Muncul error leak di Pompa
• Kebocoran dari area dasar pump head
• Isi botol rinsing pump bertambah
• Penanganan
• Penggantian plunger seal (dalam banyak
kasus karena plunger seal rusak)
• Maksimal 90 Liter Pemakaian
16
Seal rinse kit
18. Fluktuasi pada Retention Time
• Periksa :
• Pump pulsation
• Flowrate
• Kebocoran, dan
• Perubahan suhu ruangan
Perubahan komposisi dan
density eluen
Ketidakstabilan pompa
Column temperature
fluctuations
Eluent
Pump
Injectors
Column Oven
Column
Detectors
Kebocoran Flow line
19. Perubahan eluen komposisi dan densitas
• Kasus
• Waktu retensi berubah secara
bertahap dikarenakan perubahan
komposisi larutan yang mudah
menguap
• Waktu retensi juga dapat fluktuatif
dikarenakan suhu kolom/ruangan
tidak stabil
• Penanganan
• Disiapkan eluen baru
• Gunakan tutup reservoir agar larutan
organik tidak menguap (kasus FG
campur diluar)
• Menjaga suhu ruangan agar stabil
19
Column: Shim-pack VP-ODS
(150 mm x 4.6 mm I.D.)
Eluent: Water / acetonitrile = 8/2 (v/v)
1.0 mL/min
Detection: UV 275 nm
Eluent left in an uncovered
beaker
1 2 3 4 5 6 7 min
0
After 30 minutes
After 1 hr
After 2 hrs
After 4 hrs
After 6 hrs
After 8 hrs
After 10 hrs
After 12 hrs
Injected 5 µL of 80 mg/L
caffeine solution
20. Efek suhu kolom
• Kasus
• Retensi dan pemisahan tidak stabil
dikarekan perubahan suhu kolom
• Penanganan
• Gunakan unit coloumn oven
20
Effects of Column Temperature in Reverse Phase Mode
1: Sorbic acid, 2: Benzoic acid, 3: Methylparaben
Time (min)
Time (min)
Time (min)
21. Penambahan ‘end time’ pada mode gradien,
agar kestabilan dan keterulangan terjaga
Column: Shim-pack VP-ODS
(150 mm 4.6 mm I.D.)
Eluents: A: water, B: methanol
Flow Rate: 1.0 mL/min
Detection: UV 260 nm
Injected 5 µL each of 50 mg/L methylparaben,
ethylparaben,
n-proylparaben, and n-butylparaben
0 5 10 15 20 25 min
60
80
Concentration
of
Solution
B
(%)
5 10 min
0
60
80
Concentration
of
Solution
B
(%)
1st Time
2nd Time
3rd Time
1st Time
2nd Time
3rd Time
23. FLUKTUASI PADA AREA
• Cek keterulangan sampel
• Focus terutama pada injektor
RSD diatas 1 %
Masalah di autosampler, vial yang
dipakai berulang
packing material kolom
Sudah kotor
Suhu detektor
Eluent
Pump
Injectors
Column Oven
Column
Detectors
25. Sensitivitas yang Berkurang ... Apa yang harus kita lakukan ?
• Pastikan bahwa preparasi sample ok
• Pada autosampler pastikan volume injek akurasi ok dan tidak ada kebocoran
• Pastikan vial yang digunakan baru
• Pada detektor pastikan energy lampu OK diatas 800 atau umur lampu < 2000 H
• Settingan metode sudah sesuai
Kesalahan preparasi sample
Kesalahan injeksi volume
Ketidakakuratan volume injeksi
Adsorpsi di injektor
Berkurangnya sensitivitas
detector/ energy lampu kecil
Kesalahan pengaturan
sensitivitas
Eluent
Pump
Injector
Column Oven
Column
Detector
27. 7. Kenaikan Noise
• Periksa bagaimana preparasi fase gerak, Tekanan tidak stabil dan status
detector
Eluent
Pump
Injector
Column Oven
Column
Detector
Apa yang diperiksa pertama kali?
Kenaikan pump pulsation
Detector problems
28. Peningkatan Noise dari Detektor
Pengecekkan
• Jika tekanan pompa stabil/pulsation stabil
• Tidak ada gelembung udara
• Sudah dilakukan flushing flowcell
Penanganan
• Ganti sumber cahaya lampu (Foto 2) secara
berkala
• Penggantian lampu D2 maksimal 2000 jam
28
1
2
30. 8. Fluktuasi Baseline
Eluent
Pump
Injector
Column Oven
Column
Detector
Apa yang diperiksa pertama kali?
Perubahan komposisi fase
gerak dalam
Degassing tidak stabil
Aliran dari kolom
Masalah pada detektor
(Perubahan temperatur
ruangan)
Kontaminasi flow line
Kebocoran pada
Flowcell
31. Mempersempit Kemungkinan Penyebabnya
Jika baseline stabil setelah kolom dilepas....
• Elusi dari kolom
• Ganti suhu kolom, jika menggunakan oven
Jika baseline tidak stabil setelah kolom dilepas tapi stabil setelah menghentikan
aliran fase gerak
• Ganti komposisi fase gerak
• Masalah pada pompa
• Masalah pada detektor seperti efek dari suhu ruangan/ absorban tidak stabil.
32. Masalah Fase Gerak
• Fase gerak rentan terhadap baseline
• Pelarut organik dengan polaritas yang
rendah (non polar) -> Normal phase
• Pencampuran pelarut dengan volatilitas
tinggi dan rendah
• Komposisi mudah dipengaruhi oleh
udara
• Terutama jika tingkat kelembaban/udara
mempengaruhi deteksi
32
5.0 10.0 min
0
1000
2000
3000
uV
0
Water
Tetrahydrofuran (THF)
Example of Comparing Baselines from the Same
Environment Using Refractive Index Detection
33. Masalah Fase Gerak
• Cara Menanggulangi
• Membuat fase gerak yang baru
• Homogenkan FG yang telah dibuat
(foto bagian atas)
• Menggunakan penutup reservoir
• Terutama pada FG yang mudaha
menguap
• Untuk mencegah kontaminasi udara,
gunakan silika gel di bagian atas
tutup botol (foto bagian bawah)
• Menjaga suhu ruangan
• Gunakan reagent HPLC grade
33
Desiccant (silica
gel)
35. Kemunculan peak yang tidak diinginkan
• Pastikan ghost peaks disebabkan oleh apa?
• Lakukan penginjeksian solvent
Eluen kontaminasi dan
impurities
Sistem peak
Column kontaminasi
Elute substances with strong
retention
Mobile phase
Pump
Injectors
Column Oven
Column
Detectors
Flow line
kontaminasi
Injektor kontaminasi
Vial kontaminasi
Adanya udara terlarut
dalam sampel
36. Kontaminasi dari fase gerak dan impurities
• Untuk analisis isokratik
- Cek dan preparasi ulang fase gerak
- Pastikan Tidak terjadi kontaminasi di
Flow lines
• Analisis gradient
- Run metode gradient tanpa injeksi dan
cek bentuk kromatogram.
Example of Ghost Peaks Appearing for Water-to-
Methanol Gradient
Column: ODS
Detection: Absorbance
Grades shown are for methanol
41. Kontaminasi dari Injektor dan Vial
• Kontaminasi Injektor
- Pastikan larutan rinsing tidak ada
gelembung udara
• Kontaminasi Vial
Gunakan Vial yang baru setiap
analisa
42. Peak dari gelembung udara
• Kasus dimana peak cenderung
muncul
- Pastikan larutan rinsing tidak ada
gelembung udara
- Disebabkan oleh perbedaan kadar udara
terlarut eluen dan sampel
- Peak muncul untuk deteksi indeks bias dan
deteksi absorbansi dekat 200 nm
Chromatogram When Eluent Was Injected
from Injector
Column: ODS
Eluent: Methanol/water (85/15), with online degassing
Flow Rate: 1.0 mL/min
Detector: UV 210 nm
Oxygen bubbling
Air saturated
Helium bubbling
43. Peak dari Injeksi sampel sebelumnya
• Fenomena
- Peak muncul setelah beberapa siklus
analisis berulang
• Penanggulangan
- Setting waktu analisis yang lebih lama
sampai baseline lurus atau tidak muncul
peak lagi
- Tambahkan langkah pembilasan kolom,
Gunakan analisis gradien
- Hilangkan komponen yang tidak diinginkan
dengan preparasi sampel
46. Akibat Pelarut Sampel
• Penyebab
• Terjadi perbedaan elusi pelarut sampel
dan fase gerak, maka peak akan melebar
• Penanganan
• Pilih pelarut sampel dengan komposisi
yang sama dengan fase gerak
Flow
Pelarut sampel
Analit
47. Akibat Volume Injeksi
Kerusakan bentuk peak karena volume injeksi
Bentuk peak dapat diperbaiki dengan mengurangi volume injeksi
Ketika 100 uL sampel diinjeksikan, awal
pemisahan terjadi sekitar menit ke 3.
Kondisi HPLC sama sebalum
slide analit caffeine
Pelarut sampel: methanol
48. Akibat Kolom Rusak
Penyebab
• Salah Fase gerak, Pencucian kolom tidak maksimal sesuai Manual Kolom
• Kolom Sudah Jenuh
Penanganan
• Pastikan melihat manual kolom sebelum pemakaian (pH, maksimal tekanan,
maksimal suhu)
• Pastikan setelah analisa kolom dicuci dan disimpan sesuai manual
• Kolom tidak terlalu banyak metode
• Gunakan flowrate bertahap (flow pilot)
• Ganti Kolom
49. • Tips agar HPLC kita selalu dalam
performa ok:
– Ganti consumable part jika sudah
melewati umur pemakaian.
– Lakukan maintenance rutin minimal 1
tahun sekali oleh engineer yang sudah
tersertifikat.
– Pastikan part yang dibeli original.
– https://www.shimadzu.com/an/servic
e-support/virtual-adviser/index.html
50. PIC PT. DITEK
• JKT A (Bogor) : Farid Permana S./081219777810
• JKT B (Bekasi) : Syahrir Rosihan ./+62 812-3175-1015
• JKT C (Tangerang) : Ayub Zaen M./085-695-258300
• Solo : Suryanto /+62 813-2612-6401
• Medan : Fadli /0823-6387-1777
• Bandung : Robby Iskandar /+62 812-9898-6872
• Surabaya A : Rony H. /+62 856-3013-366
• Surabaya B : Ismail /+62 812-1627-8905
