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  • Una mutazione della regione di controllo, o di un esone condiviso da tutti gli mRNA alternativi, produrrà un effetto su tutte le proteine codificate da una determinata unità di trascrizione complessa.
  • In tutti i procarioti i geni coinvolti nello stesso processo metabolico (es. sintesi del triptofano) sono organizzati in regioni contigue di DNA (OPERONE) perché operano come un’unica unità a partire da un unico promotore…. I geni sono impacchettati l’uno vicino all’altro con molto pochi gap non coding. Messaggeri policistronici…ogni gene ha il proprio sito di start per la traduzione….
  • Negli eucarioti i geni coinvolti nello stessso pathway sono spesso separati nel DNA e generalmente si trovano su cromosomi diversi.. Ogni gene è trascritto a partire dal proprio promotore. Esoni, introni… Negli eucarioti quindi si ha un trascritto primario (pre-mRNA, RNA nucleare eterogeneo) che deve essere processato per divenire maturo. Questo RNA deve essere trasportato nel citoplasma per poter essere tradotto. Quindi negli eucarioti trascrizione e traduzione non possono avvenire contemporaneamente.
  • Inoltre i pre-mRNA eucariotici inizialmente sono modificati alle due estremità. Al 5’ della catena nascente di mRNA viene attaccato un 5’-cap (incappucciamento con nucleotidi G metilati), importante per l’inizio della sintesi proteica e per difendere l’RNA dalla degradazione enzimatica. Al 3’ viene aggiunta una coda di poli-A che sembra facilitare la fuoriuscita dell’mRMA maturo dal nucleo. Splicing…
  • Differenti tipi di cellule possono avere forme diverse di una proteina (isoforme)…splicing alternativo…
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    1. 1. Regolazione della transcrizione in Eucarioti
    2. 2. Biologia molecolare e comprensione del funzionamento delle cellule e degli eucarioti <ul><li>L’esplosione delle conoscenze di biologia molecolare degli ultimi 25 anni ha letteralmente modificato la nostra visione di come operano </li></ul><ul><ul><li>le cellule, </li></ul></ul><ul><ul><li>i loro meccanismi molecolari </li></ul></ul><ul><ul><li>e come questi hanno avuto impatto sulla comprensione dell’ </li></ul></ul><ul><ul><li>Origine delle malattie e </li></ul></ul><ul><ul><li>Sulle modalità evolutive degli organismi </li></ul></ul><ul><ul><li>ed anche, </li></ul></ul><ul><ul><li>sull’ origine dell’ uomo e della sua coscienza </li></ul></ul>
    3. 3. Numero dei geni ed Evoluzione Prokarioti 500 - 7,000 Urochordati Artropodi Nematodi 16,000 14,000 21,000 Specie Unicellulari Funghi 2,000 – 13,000 5,000 – 10,000 Vertebrati Piante Vascolari 30,000 – 50,00 0 25,000 – 60,000
    4. 4. Numero dei geni ed Evoluzione <ul><li>Esistono anfibi con 5 volte la quantità di DNA presente nei mammiferi e </li></ul><ul><li>Alcune amebe hanno ca. 1,000 la quantità di DNA dei mammiferi. </li></ul><ul><li>Inoltre, C. elegans (un verme con solo circa 1,000 cellule) ha 19,000 geni (l’uomo ne ha ca. 22,500) </li></ul>
    5. 5. Geni e Genomi
    6. 6. Sequenze di genomi in banche dati Genomi Sequenziati: Human 3 × 10 9 Yeast 1.2 × 10 7 Mouse 2.7 × 10 9 × 12 different strains Rat 2.6 × 10 9 Neurospora 4 × 10 7 14 more fungi within next year Fugu fish 3.3 × 10 8 Tetraodon fish 3 × 10 8 >500 bacteria/viruses Mosquito 2.8 × 10 8 Next years: Drosophila 1.2 × 10 8 Dog, Chimpanzee, Chicken Worm 1.0 × 10 8 2 sea ascidiae 1.6 × 10 8 Current rate of sequencing: Rice 1.0 × 10 9 4 big labs × 3 × 10 9 bp /year/lab Arabidopsis 1.2 × 10 8 10s small labs
    7. 7. <ul><li>La maggior parte degli mRNA degli eucarioti sono </li></ul><ul><li>monocistronici e contengono introni </li></ul><ul><li>I geni che producono un singolo tipo di mRNA, codificante un’unica proteina, sono chiamati </li></ul><ul><li>unità di trascrizione semplici </li></ul><ul><li>mediante splicing alternativi portano alla formazione di mRNA diversi </li></ul><ul><li>unità di trascrizione complesse </li></ul>
    8. 8. I genomi di eucarioti contengono una gran parte di DNA non-funzionale Tra gli eukarioti, il DNA cellulare non correla con la filogenia.
    9. 9. Complessità dei Genomi L’ evoluzione è una consequenza di tale complessità <ul><li>Numero dei Geni – mantenimento di geni duplicati . </li></ul><ul><li>Splicing e proliferazione degli introni </li></ul><ul><li>Complessità delle regioni regolatorie modulari </li></ul><ul><li>Transposoni and retrotransposoni </li></ul>
    10. 10. Nel corso dell’Evoluzione il DNA coding (letto a 3 nt) diminuisce fortemente in percentuale <ul><li>Solo il 3% del DNA genomico umano codifica proteine o RNA funzionali </li></ul><ul><li>Quello batterico arriva al 98% </li></ul>
    11. 11. Controllo della trascrizione genica in Eucarioti <ul><li>Diversamente dai batteri e da eucarioti unicellulari, le cellule di organismi multicellulari hanno pochi geni che sono regolati reversibilmente da condizioni ambientali </li></ul><ul><li>Il controllo dell’espressione genica nei Metazoi è importante per lo sviluppo e il differenziamento e generalmente non è reversibile . </li></ul>
    12. 12. OPERONI L’ operone Lac di E. coli
    13. 13. Modello di Regolazione Genica <ul><li>Benchè questo modello di regolazione genica non è quello adoperato dai geni di Metazoi e Piante, tale modello è </li></ul><ul><li>servito come base per la comprensione della regolazione genica </li></ul><ul><li>in tutti gli organismi </li></ul>
    14. 14. I geni di Metazoi vengono letti in luoghi diversi (tessuti), in tempi diversi (embriogensi, adulto), in condizioni diverse (es. risposte ormonali), etc Abbondanza Attivazione ormonale SPAZIO TEMPO
    15. 15. Circuit i <ul><li>I circuiti biologici hanno caratteristiche logiche ed operative simile a quelli dei computer </li></ul><ul><li>La complessità è stata ottenuta collegando semplici circuiti piuttosto che rendendoli più complessi </li></ul>
    16. 16. Complessità in organismi multicellulari <ul><li>Sono state introdotte nel corso dell’ Evoluzione modifiche all’ o rganizzazione genica dei batteri che hanno generato maggior complessità </li></ul><ul><li>Repressione e attivazione </li></ul><ul><li>Collegare fattori di trascrizione in circuiti complessi, come nei computer </li></ul><ul><li>Un ulteriore livello è stato ottenuto con modifiche </li></ul><ul><ul><ul><li>post-traduzionali di proteine </li></ul></ul></ul>
    17. 17. Core Processes Tra 2 e 1 miliardo di anni fa, le cellule eucariotiche hanno raggiunto un livello elevato di coordinamento di grosse combinazioni di geni in circuiti molto complessiQuesti meccanismi di regolazione possedevano robustezza ed insieme la versatilità che ha permesso la loro evoluzione. Sono rimasti conservati da allora.La regolazione genica di eucarioti è tra i core processes più potenti maggiormente conservato, e responsabile per la variazione fenotipica su cui agisce la selezione naturale.Robustezza= resistenza del fenotipo (anatomia, fisiologia, comportamento) a modifiche
    18. 18. Core Processes Il controllo dell’espressione genica in eucarioti ha indebolito il collegamento tra segnali e risposte trascrizionali in 2 maniere:Rilasciamento delle richieste geometriche per l’interazione del repressore con l’apparato trascrizionale (DNA)Nei batteri, il repressore si lega precisamente ad un sito particolare del DNA bloccandone fisicamente la trascrizioneNegli eucarioti, le proteine si legano solo in vicinanza del DNA non esattamente, possono trovarsi prima o dopo il gene DNA binding proteins si legano a sequenze vicino al gene e non interagiscono con la macchina trascrizionale, portando enzimi vicino al gene che a sua volta modifica la struttura della proteina che si trova vicino al geneL’attività del gene è basata su di un consensus che non ha un contatto chimico con il macchinario per la sintesi dell’ RNA
    19. 19. Core Processes <ul><li>E’ semplice evolvere un nuova caratteristica regolativa di un gene: </li></ul><ul><ul><li>Basta legare un fattore di trascrizione dovunque vicino ad un nuova sequenza genica </li></ul></ul><ul><li>La regolazione della trascrizione degli eucarioti è molto meno precisamente organizzata che nei procarioti </li></ul><ul><li>Questa tolleranza in un posizionamento approssimativo è una caratteristica che ha permesso la riduzione di ostacoli per </li></ul><ul><ul><li>L’incorporazione di nuove sequenze nei genomi </li></ul></ul><ul><ul><li>La generazione di variazione fenotipica a livello di espressione genica </li></ul></ul>
    20. 20. Core Processes <ul><li>La regolazione dell’espressione genica è uno dei core processes più importanti per generare variazione fenotipica : </li></ul><ul><ul><li>La facilità nel rimodellare i collegamenti che regolano i geni è direttamente in relazione con la facilità nel generare nuovi patterns di espressione genica durante l’evoluzione </li></ul></ul><ul><li>Nei Metazoi le variazioni anatomiche avvengono durante lo sviluppo embrionale </li></ul><ul><ul><ul><li>Patterns di regolazione genica nel tempo e nello spazio guidano questi processi. </li></ul></ul></ul>
    21. 21. Le cellule rispondono a segnali <ul><li>In che maniera viene generata l’anatomia durante lo sviluppo? </li></ul><ul><li>Come può lo sviluppo cambiare durante l’evoluzione ? </li></ul>
    22. 22. Elementi regulatori nel DNA di eukarioti spesso distano diverse kilobasi dall’inizio della trascrizione <ul><li>I principi di base che controllano la trascrizione nei batteri sono validi anche per gli eukarioti: </li></ul><ul><ul><li>la transcrizione inizia su coppie di basi specifiche ed è controllata dal legame di proteine che agiscono in trans ( fattori di transcrizione ) su sequenze di DNA che agiscono in cis </li></ul></ul><ul><li>Gli elementi di eucarioti che agiscono in cis spesso si trovano molto più distanti dal promotore che loro regolano, e la trascrizione da un singolo promotere può essere regolata da molteplici fattori di trascrizione che legano diversi elementi regolativi sul DNA </li></ul>
    23. 23. Tre polimerasi eukariotiche catalizzano la formazione di differenti RNAs I: pre-rRNA II: mRNA III: tRNAs, 5S rRNA, small stable RNAs alfa-amanitina DEAE Sephadex
    24. 24. Struttura delle subunità della RNA polimerasi di yeast e E. coli
    25. 25. La subunità maggiore dell’ RNA polymerase II ha un repeat essentiale al carboxyl-terminale che viene fosforilato durante la transcrizione Repeat = Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser Da 26 a 52 ripetizioni del dominio CTD Ab verde capra Ab rosso* conig lio
    26. 26. Il TATA box è una regione altamente conservata del promotere di eucarioti Inizio tra -35 e -20 CG regions sono poco presenti in genomi di eukarioti
    27. 27. La maggior parte dei geni eucarioti sono regolati da controlli multipli della transcrizione U pstream A ctivating S equences
    28. 29. Gli operoni batterici producono mRNA poli-cistronici mentre la maggior parte dei mRNA eukariotici sono mono-cistronic i e contengono introni
    29. 31. Unità di trascrizione semplici e complesse vengono trovate in genomi di eucarioti
    30. 32. Splicing alternativo tessuto-specifico del pre-mRNA della fibronectina nei fibroblasti e negli epatociti
    31. 33. Multipli isoformi di proteine sono comuni nel sistema nervoso dei vertebrati Splicing alternativo di slo mRNA, che codifica per il canale del K + Ca 2+ -dipendente nelle cellule ciliate dell’apparato auditivo, contribuisce alla percezione dei suoni a frequenze diverse coclea 576 possibili isoforme
    32. 34. Splicing
    33. 35. Identificazione degli elementi di controllo della transcrizione di controllo della transcrizione Figure 10-31
    34. 36. Saggio in vivo per l’attività di fattori trascrizionali
    35. 37. Una serie di mutanti per delezione di Gal4 ha dimostrato che i fattori di trascrizione sono composti da domains separabili: DNA- binding e attivazione Assay in Gal4 -
    36. 38. Gli attivatori transcrizionali sono proteine modulari composte da domains funzionali distanti
    37. 39. I domains DNA- binding possono essere classificati in numerosi tipi strutturali <ul><li>Proteine homeodomain </li></ul><ul><li>Proteine zinc - finger </li></ul><ul><li>Proteine winged -helix (forkhead) </li></ul><ul><li>Proteine leucine-zipper </li></ul><ul><li>Proteine helix-loop-helix </li></ul>
    38. 40. L’ homeodomain della proteina engrailed interagisce con uno specifico sito di riconoscimento sul DNA 60 aa homeobox Anche in vertebrati e Uomo controllano lo sviluppo
    39. 41. Mutanti di Drosophila
    40. 42. Mutazioni in selector genes possono causare transformazione di una parte del corpo in un altra ( homeosis )
    41. 43. Interazione fra i zinc-finger domains C 2 H 2 e C 4 con il DNA In tumori umani Recettore gluco- corticoidi
    42. 44. Interazione fra la proteina C 6 zinc-finger (Gal4) ed il DNA Leucine zipper 1 Leu ogni 7 aa nella zona del C-terminal DNA-binding domain Legano il DNA come dimeri e le Leu sono necessarie
    43. 45. Interazione fra una proteina homodimerica-leucine-zipper ed il DNA
    44. 46. Interazione fra l’ helix-loop-helix di una proteina homodimerica ed il DNA
    45. 48. I fattori di trascrizione etero-dimerici aumentano le opzioni per la regolazione genica
    46. 49. I domains di attivazione mostrano una considerevole diversità strutturale Figure 10-47 In assenza di 9-cis-retinoic acid agisce come repressore Con trans stimola la trascrizione
    47. 50. Complessi multiproteici si formano sugli enhancers Attivazione dell’ Interferone Enhanceasome il complesso proteico
    48. 51. Trascrizione e Fattori di Trascrizione
    49. 52. Molti repressori funzionano in maniera inversa degli attivatori <ul><li>La trascrizione negli Eukarioti è regulata sia da </li></ul><ul><li>attivatori che da repressori </li></ul><ul><li>I siti repressor-binding possono essere identificati e i repressori purificati con le stesse tecniche adoperate per gli attivatori </li></ul><ul><li>Molti repressori di eukarioti hanno due domains : </li></ul><ul><li>un domain DNA-binding e </li></ul><ul><li>un domain repressor </li></ul>
    50. 53. Assemblaggio stepwise in vitro del complesso Pol II transcription-initiation
    51. 54. Meccanismi moleculari del controllo trascrizionali degli eucarioti <ul><li>La concentrazione e l’ attività degli Attivatori e dei Repressori controlla il differenziamento cellulare ed in risposta a </li></ul><ul><li>Ormoni </li></ul><ul><li>Segnali da cellule vicine </li></ul><ul><li>La concentrazione e l’attività degli attivatori e dei repressori regolano </li></ul><ul><li>la struttura della cromatina, l’acilazione de-acilazione degli istoni, l’ assemblaggio dei complessi transcription-initiation e la velocità con cui la trascrizione inizia </li></ul>
    52. 55. Meccanismi moleculari del controllo trascrizionali degli eucarioti <ul><li>Attivatori e dei Repressori regolano </li></ul><ul><li>i cambiamenti della struttura della cromatina e </li></ul><ul><li>l’ acilazione e de-acilazione degli istoni </li></ul><ul><li>Che a loro volta influenzano </li></ul><ul><li>l’abilità dei fattori generali di trascrizione a legarsi ai promotori </li></ul><ul><li>La velocità con cui inizano la trascrizione </li></ul>
    53. 56. Gli attivatori stimolano l’assemblaggio altamente cooperativo del complesso di iniziazione della trascrizione I binding sites per gli attivatori che controllano la trascrizione del gene di topo TTR
    54. 58. Modello per l’assemblaggio cooperativo per l’attivazione del complesso per l’inizio della trascrizione del promotore TTR
    55. 59. Assemblaggio cooperativo HNF1 proteina homeobox - specifica negli epatociti HNF3 proteina winged-helix - specifica negli epatociti HNF4 recettore nucleare espresso anche in epiteli intestinali e cellule renali C/EPB eterodimero basic zipper espresso in epiteli intestinali, cellule del grasso, in alcuni neuroni AP1 eterodimero basic zipper espressi in tutte le cellule
    56. 60. Controllo combinatoriale della trascrizione

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